НАБОР ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИТЕЛ К БЛЕДНОЙ СПИРОХЕТЕ TREPONEMA PALLIDUM, РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПОЛИПЕПТИДНЫЙ АНТИГЕН TREPONEMA PALLIDUM 15 КДА, РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПОЛИПЕПТИДНЫЙ АНТИГЕН TREPONEMA PALLIDUM 17 КДА И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПОЛИПЕПТИДНЫЙ АНТИГЕН TREPONEMA PALLIDUM TMP A Российский патент 1998 года по МПК C12N15/31 C07K14/20 

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и представляет собой набор рекомбинантных белков, синтезированных в бактериальных клетках и позволяющих проводить серодиагностику сифилиса. Сифилис возникает в результате заражения человека патогенной бактерией - бледной спирохетой (Treponema pallidum). Обычным способом заражения бледной спирохетой является половой путь, возможен также трансплацентарный путь заражения ребенка от матери, носителя инфекции, при переливании крови, а также, в редких случаях, может быть бытовой путь заражения. Поэтому для проведения экстренных противоэпидемических, профилактических мероприятий и своевременного начала лечения сифилиса крайне актуальна разработка диагностических тест-систем, позволяющих выявлять инфицированных людей на ранних этапах инфекции.

Многочисленные исследования молекулярно-биологических основ иммунного ответа на бледную спирохету позволили определить структуру генов, наиболее иммуногенных белков, выяснить их специфичность по отношению к антигенам других микроорганизмов и изучить кинетические аспекты появления антител на различные белки возбудителя сифилиса.

Большинство методов диагностики сифилиса основано на определении антител к кардиолипиновому и группоспецифическому антигенам бледной спирохеты в сыворотках крови и других биологических жидкостях (серодиагностика). Для этих целей используются различные подходы, в которых применяется принцип иммуноферментного анализа (ИФА), реакции агглютинации (латекса, эритроцитов), иммунофлюоресценции, иммуноблотинга и радиоиммунопреципитации (патент WO 84/01961). Одним из наиболее перспективных путей совершенствования диагностических тест-систем является использование в качестве антитело-связывающего субстрата рекомбинантных белков бледной спирохеты, синтезированных в различных экспрессирующих системах. Использование таких рекомбинантных белков, сохраняющих антигенные детерминанты возбудителя сифилиса, вместо убитого микробного антигена патогенной или непатогенной спирохеты увеличивает специфичность и чувствительность тест-систем. Так, например, в патенте N 4868118 (США), используемом в качестве прототипа, экспрессированный в бактериальной системе рекомбинантный липопротеин 47kD бледной спирохеты предлагается для использования в диагностических тест-системах и вакцинации. Было показано, что используя этот рекомбинантный белок в качестве иммуносорбента, можно идентифицировать в сыворотках крови антитела к бледной спирохете.

Сущность данного технического решения состоит в том, что предложен набор для определения антител к бледной спирохете. Набор включает ряд рекомбинантных антигенов к Treponema pallidum (штамм Nichols), полученных с помощью методов генетической инженерии из штаммов-продуцентов, трансформированных рекомбинантными ДНК, включающими фрагменты генов липопротеинов 47kD и/или TmpA и/или 17kD и/или 15kD. В качестве контрольного антигена набор может содержать бета-галактозидазу E. coli. При этом антигены, входящие в набор, иммобилизуют на твердом носителе, либо в смеси, либо по отдельности, в зависимости от решаемой задачи. Твердым носителем могут служить полистироловые или полихлорвиниловые шарики и планшеты для иммунологических реакций, нитроцеллюлоза, найлон, латексы, эритроциты, а также другие твердофазные носители. Введение в набор дополнительных (по сравнению с прототипом) рекомбинантных антигенов позволяет повысить чувствительность и специфичность набора, определить спектр антител к индивидуальным бактериальным белкам.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Набор для массового серологического исследования образцов сыворотки или плазмы крови на присутствие антител к рекомбинантным антигенам - продуктам генов, кодирующих белки 47kD, TmpA, 17kD и 15 kD бледной спирохеты.

Штаммы бактерий E. coli - продуценты полипептидов продуктов гена 15 kD с аминокислотной последовательностью (см. в конце текста) - выращивают на среде LB с селективными добавками, клетки собирают центрифугированием, разрушают ультразвуком. Тельца включения, содержащие рекомбинантные полипептиды, промывают с помощью центрифугирования, солюбилизируют. Полипептиды очищают с помощью хроматографических методов, чистоту полученных полипептидов анализируют с помощью ДДС-Na- электрофореза. При изготовлении иммуносорбента для наборов сорбируют смесь полипептидов - продуктов генов 15kD (концентрация 1 мкг/мл), 17kD (5 мкг/мл), TmpA kD (2 мкг/мл) и 47kD (1 мкг/мл), растворенных в 0,1М фосфатно-солевом буфере pH 7,6. Сорбцию ведут при 4 ^oС в течение 18 ч.

Конъюгат пероксидазы хрена с белком A St. aureus или с антивидовыми антителами получают с помощью периодатного окисления с последующей хроматографической очисткой готового конъюгата. Конъюгат, контрольные сыворотки и буферную смесь с гидроперитом (БСГ) для пероксидазной реакции лиофилизируют в ампулах, запаивают в атмосфере инертного газа. В качестве контрольного положительного иммунореагента используют сыворотку крови человека, содержащую антитела к патогенной трепонеме (К+). В качестве контрольного отрицательного иммунореагента (К-) используют сыворотку крови человека, не содержащую антитела к патогенной трепонеме. Иммуносорбент представляет собой полистироловые или полихлорвиниловые планшеты для иммунологических реакций с иммобилизованной смесью рекомбинантных антигенов.

Иммуносорбент перед использованием трехкратно промывают. Для промывок используют фосфатный буферный раствор pH 7,2 с 0,5% Твином-20 (ФСБ-Т) с помощью автоматического или ручного промывателя, внося не менее 0,2 мл раствора в лунку. По окончании промывки удаляют влагу из планшета.

В 88 из 96 лунок вносят по 90 мкл раствора для разведения сывороток, содержащего 4% раствор клеток E. coli, лизированных ультразвуком в ФСБ-Т и добавляют по 10 мкл предварительно разведенных (1:10) исследуемых сывороток, перемешивая содержимое лунок пипетированием или с помощью встряхивателя. В незаполненном ряду, например в 1-м, в две лунки вносят 100 мкл К-, в 4 лунки - по 100 мкл К+ и в 2 лунки по 100 мкл раствора для разведения сывороток (контроль конъюгата). Планшет заклеивают пленкой и выдерживают в течение 60 мин при температуре 37^oС.

Содержимое лунок удаляют, планшет 5-ти кратно промывают и полностью удаляют влагу. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл конъюгата. Планшет заклеивают новым листом пленки и выдерживают в течение 30 мин при температуре 37^oC.

Содержимое лунок удаляют, планшет 5-ти кратно промывают и полностью удаляют влагу. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл 0,05% ортофенилендиамина в растворе БСГ. Планшет помещают в защищенное от света место на 15-20 мин при температуре 15-25^oC. Реакцию останавливают внесением во все лунки по 50 мкл 2N серной кислоты.

Регистрацию проводят немедленно на спектрофотометре типа "Мультискан", измеряя оптическую плотность (ОП) при длине волны 492 нм. Выведение спектрофотометра на нулевой уровень осуществляют по воздуху или по чистому сухому планшету.

Вычисляют среднее значение ОП (ОПср) для контроля конъюгата, которое должно быть не более 0,15; ОПср К- не более 0,2; ОП_ср К+ в пределах от 0,8 до 1,8. Пороговое значение ОП вычисляют по формуле: ОП_ср К+, умноженное на расчетный коэффициент, указываемый в паспорте набора. Сыворотку учитывают как положительную, если значение ОП образца выше порогового. Чувствительность препарата не менее 99%, специфичность не менее 98%.

Пример 2. Набор для повторного (уточняющего и дифференцирующего) серологического исследования образцов сыворотки или плазмы крови на присутствие антител к каждому из соответствующих антигенов Treponema pallidum.

Штаммы бактерий E. coli - продуценты полипептидов продуктов гена 15kD, 17kD, TmpA и 47kD, а также продуцент бета-галактозидазы выращивают на среде LB с селективными добавками. Клетки собирают центрифугированием, разрушают ультразвуком. Тельца включения, содержащие рекомбинантные полипептиды, промывают с помощью центрифугирования, солюбилизируют. Полипептиды очищают с помощью хроматографических методов, чистоту полученных полипептидов анализируют с помощью ДДС-Na-электрофореза. При изготовлении иммуносорбента для наборов готовят растворы вышеперечисленных полипептидов и "КАг" (контрольный антиген - бета-галактозидаза), каждый в виде отдельного раствора в 0,1М фосфатно-солевом буфере pH 7,6 в концентрациях соответственно 2, 5, 4, 2 мкг/мл. Сорбцию ведут при 4^oC в течение 18 ч.

Конъюгат пероксидазы хрена с белком A St. aureus или с антивидовыми антителами получают при помощи периодатного окисления с последующей хроматографической очисткой готового конъюгата. Конъюгат, контрольные сыворотки и буферную смесь с гидроперитом (БСГ) для пероксидазной реакции лиофилизируют в ампулах, запаивают в атмосфере инертного газа. В качестве контрольного положительного иммунореагента используют сыворотку крови человека, содержащую антитела к патогенной трепонеме (К1+).

В качестве контрольного отрицательного иммунореагента (К-) используют сыворотку крови человека, не содержащую антитела. Иммуносорбент представляет собой полистироловые или полихлорвиниловые планшеты для иммунологических реакций с рекомбинантными антигенами - продуктами фрагментов генов 15kD, 17kD, TmpA, 47kD, и контрольным антигеном, иммобилизованными по отдельности.

Иммуносорбент перед использованием трехкратно промывают раствором ФСБ-Т, удаляют влагу из планшета. В 78 из 96 лунок вносят по 90 мкл раствора для разведения сывороток, оставляя, как указано на фиг. 1, пустыми лунки для К-, К1+ и К2+.

На фиг.1 показано расположение сорбированных рекомбинантных антигенов и КАг в рядах планшета a b c d e f соответственно.

Добавляют по 10 мкл предварительно разведенных (1:10) исследуемых сывороток в каждую из 6-ти лунок горизонтального ряда, перемешивая содержимое лунок пипетированием или с помощью встряхивателя. В незаполненные ряды в соответствии с фиг. 1 вносят К-, К1+ и К2+ по 100 мкл в каждую из 6-ти лунок.

Планшет заклеивают пленкой и выдерживают в течение 60 мин при температуре 37^oC.

Содержимое лунок удаляют с помощью промывателя, затем планшет 5-ти кратно промывают и полностью удаляют влагу. Во все лунки планшета вносят по 100 мкл конъюгата. Планшет заклеивают новым листом пленки и выдерживают в течение 30 мин при температуре 37^oC.

Содержимое лунок удаляют, планшет 5-ти кратно промывают и полностью удаляют влагу. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл 0,05% ортофенилендиамина в растворе БСГ. Планшет помещают в защищенное от света места на 15-20 мин при температуре 15-25^oC. Реакцию останавливают внесением во все лунки по 50 мкл 2N серной кислоты.

Регистрацию проводят немедленно на спектрофотометре типа "Мультискан", измеряя оптическую плотность (ОП) при длине волны 492 нм. Выведение спектрофотометра на нулевой уровень осуществляют по воздуху или по чистому сухому планшету.

Вычисляют среднее по 6-ти лункам значение ОП для К-, которое должно быть не более 0,2. Значение ОП К1+ по лунке 8G должно быть не менее 0,8. Значение ОП К2+ по лунке 8F должно быть не менее 0,8. Значение ОП К1+ и К2+ по лункам с контрольным антигеном (12G, 12F) должны быть не более 0,2.

Для каждой сыворотки вычисляют отношения ОП по каждому рекомбинантному антигену к ОП по контрольному антигену. Сигнал по антигену учитывают как положительный, если соответствующее отношение превышает коэффициент К, указанный в паспорте. Сигнал по антигену учитывают как отрицательный, если соответствующее отношение меньше коэффициента N, указанного в паспорте. Промежуточный вариант учитывают как сомнительный.

Чувствительность препарата не менее 99%, специфичность не менее 98%.

В качестве твердого носителя для нанесения рекомбинантных антигенов могут быть использованы не только планшеты для иммунологических реакций, но и любая другая твердая фаза. Например, полистироловые шарики, нитроцеллюлоза, латекс, эритроциты и др. В этих случаях рекомбинантные антигены выделяют тем же методом, что и в примерах 1 и 2, используют те же либо другие иммунохимические реакции (например, агглютинации) и результаты учитывают как спектрофотометрически, так и визуально либо при помощи других приборов.

Пример 3. Рекомбинантные белки 15kD, 17kD, TmpA, 47kD и бета-галактозидазу очищают, как описано в примере 1. Сорбцию антигенов на планшет ведут при 4^oC, как описано в примерах 1 и 2. Ряд А планшета сорбируют только полипептидом 47kD; ряд В сорбируют смесью полипептидов 15kD, 17kD, TmpA и 47kD; ряд С - смесью полипептидов 47kD и 15kD; ряд D - смесью полипептидов 47kD и 17kD; ряд E - смесью полипептидов 47kD и TmpA.

В лунки с номерами 1-11 рядов A-E планшета добавляют 11 различных сывороток больных сифилисом, а в лунки 12 отрицательную сыворотку.

Постановку иммунологических реакций и обработку полученных данных осуществляют, как описано в примере 2. Результаты экспериментов представлены на фиг. 2. Знаком (+) отмечены лунки, давшие положительный ответ с исследуемыми сыворотками, знаком (-) - отрицательный ответ.

Как видно из фиг.2, только сорбция всех четырех антигенов (ряд B планшета) приводит к идентификации всех положительных сывороток (чувствительность 100%). В других вариантах постановки чувствительность тест-системы колеблется от 82 до 90%
Таким образом, данное изобретение позволяет повысить чувствительность и специфичность набора за счет определения антител к большему числу бактериальных белков и спектра антител к индивидуальным бактериальным белкам.

Использование: медицинская биотехнология, разработка диагностических систем, выявляющих сифилис. Сущность изобретения: получение рекомбинантных антигенов 17 кДа, 15 кДа и Тр А бледной спирохеты Treponema pallidum, способных связывать соответствующие антитела. Полученные антигены используют для приготовления диагностического набора с целью исследования образцов сыворотки или плазмы крови на присутствие антител к бледной спирохете. Антитела адсорбируют на поверхности твердой фазы в различных комбинациях. 4 с.п.ф-лы, 2 ил.

1. Набор для обнаружения антител к бледной спирохете Treponema pallidum в реакции, подразумевающей образование комплекса антиген антитело, содержащий реагенты, необходимые для выявления комплекса антиген антитело, и адсорбированные на твердой фазе рекомбинантные полипептидные антигены Treponema pallidum 15 кДа, 17 кДа, Tpm и 47 кДа, причем указанные антигены адсорбированы на твердой фазе в общей смеси, или по отдельности, или в общей смеси и при этом один антиген адсорбирован отдельно и, кроме того, каждый из других попарно абсорбирован вместе с ним. 2. Рекомбинантный полипептидный антиген Treponema pallidum 15 кДа, имеющий следующую последовательность аминокислот I, приведенную на с.

и обладающий способностью связывания антитела к Treponema pallidum.

и обладающий способностью связывать антитела к Treponema pallidum.

и обладающий способностью связывать антитела к Treponema pallidum.