ПАНЕЛЬ СЫВОРОТОК С НОРМИРОВАННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ АНТИТЕЛ КЛАССА IgG K АНТИГЕНАМ p17 И p41 TREPONEMA PALLIDUM И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2006 года по МПК G01N33/53 G01N33/571 

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и может быть использовано в технологии изготовления панелей сывороток для контроля качества тест-систем, предназначенных для серологической диагностики сифилиса. Нормированное содержание антител к отдельным белкам возбудителя сифилиса - Treponema pallidum в образцах панели позволяет осуществлять контроль ряда показателей качества тест-систем, изготовленных с использованием рекомбинантных антигенов, на стадиях их производства и применения.

Сифилис представляет собой инфекционное венерическое заболевание, характеризующееся прогрессирующим волнообразным течением, в котором стадии клинических проявлений (первичный сифилис половых органов, вторичный сифилис кожи и слизистых и т.д.) сменяются бессимптомными периодами (скрытый сифилис). Более половины случаев заболевания сифилисом протекают в скрытой, бессимптомной форме и выявляются только при серологическом обследовании пациентов. В таких условиях большое значение приобретает эффективная лабораторная диагностика данного заболевания.

Лабораторная диагностика сифилиса основана на выявлении неспецифических (реагинов) или специфических (IgG, IgM) антител в сыворотке (плазме) пациента. Профили этих антител сложны и значительно варьируют в зависимости от стадии заболевания. В комплексе серологических реакций, применяемых для диагностики сифилиса, в последние годы все большее значение приобретает иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием рекомбинантных белков, содержащих специфические антигенные детерминанты Т.Pallidum. К настоящему времени разработаны системы ИФА для выявления сифилитических антител класса IgG, антител класса IgM и суммарных (IgG+IgM) антител, причем в двух последних модификациях рекомбинантные антигены используют не только на подложках, но и в качестве иммунопероксидазного конъюгата. От того, какие антигены, какого качества, в каком количестве и соотношении использованы в тест-системе, в решающей степени зависит чувствительность и специфичность диагностики [1-3].

При производстве тест-систем используются в основном антигены с мол. массой 17 и 41 кДа. Проведенные исследования показали, что для сывороток со стадии первичного сифилиса характерно значительное преобладание антител к антигену р41, а для сывороток со стадии скрытого сифилиса - к антигену р17. На стадии вторичного сифилиса соотношение титров антител к указанным антигенам разнообразно. При этом на всех стадиях сифилиса выявляются сыворотки как с высокими, так и с крайне низкими уровнями антител. Экспериментально подтверждено наличие пяти принципиально различающихся ситуаций соотношения титров антител к указанным антигенам:

1. в сыворотке определяются только антитела к антигену р41;

2. в сыворотке определяются антитела к тому и другому антигену, но уровень антител к антигену р41 значительно выше, чем уровень антител к антигену р17;

3. в сыворотке определяются одинаковые или близкие по значению титры антител к белкам р17 и р41;

4. в сыворотке определяются антитела к тому и другому антигену, но уровень антител к антигену р17 значительно выше, чем уровень антител к антигену р41;

5. в сыворотке определяются только антитела к антигену р17.

Очевидно, что тест-системы, предназначенные для диагностики сифилиса, должны выявлять все перечисленные выше ситуации. Для этого необходимо иметь планшеты, сенсибилизированные сбалансированной смесью антигенов р17 и р41, а в случае тест-систем для выявления суммарных антител необходима также сбалансированная смесь конъюгатов указанных антигенов с пероксидазой.

Качество диагностических наборов проверяется на определенном наборе (панели) сывороток. В настоящее время официально утвержденных отечественных панелей сифилитических сывороток нет. Зарубежные аналоги неизвестны. Производители и потребители тест-систем обычно пользуются своими панелями, подбор сывороток в которых в основном имеет случайный характер и в лучшем случае учитывает стадию заболевания и пол донора.

Известна панель производства «Вектор-Бест», однако и эта панель представляет «слепой» набор высокотитражных сывороток, неизвестны ни характеристики образцов панели, ни критерии их подбора [4].

Такая панель не может обеспечить достаточно полный анализ сывороток.

Наиболее близким способом изготовления панели (прототипом) является способ получения стандартной позитивной панели сывороток для контроля качества иммуноферментных тест-систем и иммуноблотов [5, прототип]. Способ включает приготовление иммунных сывороток, содержащих разные концентрации специфических антител ко всем основным белкам тестируемого антигена путем разведения нативных иммунных сывороток неиммунной сывороткой доноров. Причем наибольшее количество сывороток панели приготавливают с концентрациями антител, близкими к их минимальной концентрации в этих сыворотках, служащей границей между положительными и отрицательными исследуемыми сыворотками, а наименьшее количество сывороток панели - с концентрациями антител, близкими к их концентрации в нативных сыворотках.

В отличие от прототипа настоящее изобретение предполагает целенаправленный подбор сывороток, критериями которого служит соотношение (К) в сыворотках обратных титров антител к антигенам р17 и р41 (К=Т^-1 _р17/Т^-1 _р41).

Технической задачей изобретения является получение панели сывороток, обеспечивающей контроль параметров тест-систем в процессе их производства и эксплуатации, как средства, позволяющего сопоставлять экспериментальные данные, полученные разными исследователями на разных тест-системах и в разное время.

Поставленная задача решается получением и использованием панели сывороток с нормированным содержанием антител класса IgG к антигенам р17 и р41 Treponema pallidum.

Настоящее изобретение позволяет реализовать новый подход к конструированию панелей как эффективного инструмента для контроля ряда параметров тест-систем в процессе их производства и эксплуатации. В отличие от существующих панелей настоящее изобретение предполагает включать в панель набор сывороток, воспроизводящих все описанные выше ситуации соотношения титров антител к антигенам р17 и р41. Такая панель позволяет потребителям осуществлять оценку чувствительности и специфичности тест-системы, а производителям, кроме того, обеспечивает дифференциальный контроль достаточности нагрузки планшетов антигенами и оптимальности соотношения антигенов в «суммарном» конъюгате.

Подбор сывороток осуществляется их титрованием на планшетах, сенсибилизированных отдельными антигенами (р17 или р41) в насыщающей концентрации. Подбираются исходные сыворотки:

- сыворотка №1 (с первичной или вторичной стадии сифилиса) с К<1/2;

- сыворотка №2 (со скрытой стадии сифилиса) с К>2;

- сыворотка №3 (с первичной, вторичной или скрытой стадии сифилиса) с К=1;

- несколько образцов донорских сывороток, не содержащих антител к Tr.Pallidum (негативные образцы);

- донорская сыворотка или смесь сывороток, не содержащих антител к Tr.Pallidum, для приготовления разводящего раствора.

Сыворотки №1 и 2 раститровывают на разводящем растворе и в полученных образцах определяют титры антител к отдельным антигенам таким же способом, как и на стадии подбора исходных сывороток. По каждой раститровке исходных сывороток выбирают не менее 2 образцов таким образом, чтобы в первом образце определялись антитела к тому и другому антигену, а во втором определялись только наиболее представленные антитела (антитела только к одному антигену) с оптическим сигналом, в 1,5 раза превышающем ОПкрит.

Сыворотку №3 раститровывают на разводящем растворе и в полученных образцах определяют титры антител к отдельным антигенам таким же способом, как и на стадии подбора исходных сывороток. Из раститровки отбирают не менее 2 образцов таким образом, чтобы в первом образце антитела к тому и другому антигену выявлялись в титре не менее 1/20, а во втором - в титре не более 1:10 с оптическим сигналом, в 1,5 раза превышающем ОПкрит.

Корректировку оптического сигнала образцов при необходимости производят добавлением исходной позитивной сыворотки или разводящего раствора.

Для обеспечения достоверности контроля в состав панели включают по два или более позитивных образца каждого типа, полученных из различных исходных сывороток с разных стадий заболевания.

Из каждой донорской сыворотки готовят по одному негативному образцу.

Все отобранные позитивные и негативные образцы сывороток дополнительно очищают центрифугированием или фильтрацией и стабилизируют добавлением известных консервантов или стабилизирующих смесей, разливают во флаконы и лиофилизируют.

Пример

По описанному выше способу изготовляют панель, включающую в себя 12 позитивных и 6 негативных сывороток. При оценке исходных сывороток и разведенных образцов используют растворы для отмывок, разведения сывороток и коньюгата, а также субстраты на основе ОФД и ТМБ из диагностических наборов «СИФ-ДСМ-IgG» (ЗАО «Медико-биологический союз», Бердск). Характеристики исходных сывороток и образцов панели приведены в табл.1.

Таблица 1
Характеристики исходных сывороток и образцов панели№ панелиИсходные сывороткиОбразцы панелиПолСтадия сифилисаТитр антителКратность разведенияОП₄₉₂ на планшетах с антигенамир17р41р17р41р17+р411мскрытый1:801:2022,2420,8852,050251,2240,1240,9343жскрытый1:6401:160161,9320,4241,5464400,7310,0950,6345мвторичный1:3201:640301,4831,9961,8026450,2150,9680,8457жпервичный1:201:8020,6521,6541,477850,2530,9030,7639мвторичный1:6401:640251,4121,2181,76210500,6110,7650,80111жпервичный1:3201:320101,2841,1681,41412250,5860,8320,71013жНегативные донорские сыворотки0000,1240,1420,15414ж0000,1230,1320,15215м0000,1190,1250,10816ж0000,1360,1180,14617м0000,1280,1120,11218м0000,1150,1370,125

Панель используют для оценки планшетов, сенсибилизированных сорбционными смесями, содержащими различные соотношения антигенов р17 и р41, а также конъюгатов для определения суммарных антител, содержащими различные соотношения антигенов р17 и р41, конъюгированных с пероксидазой.

Пример 1 - Планшеты сенсибилизированы сорбционной смесью с преобладанием антигена р17, конъюгат - a/IgG-Hum-ПХ.

Пример 2 - Планшеты сенсибилизированы сорбционной смесью с преобладанием антигена р41, конъюгат - a/IgG-Hum-ПХ.

Пример 3 - Планшеты сенсибилизированы сорбционной смесью с оптимальным соотношением антигенов р17 и р41, конъюгат - a/IgG-Hum-ПХ.

Пример 4 - Планшет тот же, что и в примере 3, антигенный конъюгат с преобладанием белка р17.

Пример 5 - Планшет тот же, что и в примере 3, антигенный конъюгат с преобладанием белка р41.

Пример 6 - Планшет тот же, что и в примере 3, антигенный конъюгат с оптимальным соотношением белков р17 и р41.

Результаты оценки приведены в табл.2.

Таблица 2
Примеры применения панели для оценки сбалансированности сорбционной смеси для сенсибилизациии планшетов и антигенного конъюгата№Пример 1Пример 2Пример 3Пример 4Пример 5Пример 612,1621,1822,0500,9630,6571,02621,1450,2280,9340,4210,2200,43931,8350,6341,5460,7400,4460,87540,7120,2360,6340,4190,2160,33451,2381,8741,8020,6540,7630,98960,2670,7680,8450,2330,4320,55470,7161,4391,4770,4410,5410,76780,2710,8120,7630,2300,4300,58191,3241,1181,7620,6550,6570,816100,5870,6450,8010,4380,4340,534111,1961,2341,4140,5610,7620,923120,6740,7120,7100,4320,4290,577130,1180,1360,1540,0780,0740,092140,1210,1280,1520,0840,0780,105150,1290,1230,1080,0920,0830,103160,1140,1250,1460,0890,0760,133170,1180,1180,1120,0860,0830,092180,1350,1290,1250,0950,1020,106ОПкрит0,3000,3000,3000,2800,2800,280

Использование описанной выше панели позволяет дать оценку:

1. работоспособности тест-системы,

2. чувствительности тест-системы,

3. специфичности тест-системы,

4. оптимальности соотношения антигенов на сенсибилизированных планшетах,

5. оптимальности соотношения антигенов в конъюгате для выявления суммарных антител,

6. стабильности тест-системы при хранении, стабильности отдельных белков на планшетах и в антигенном конъюгате при хранении.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Заявка Японии №9304391 «Immunological Treponema pallidum diagnostic reagent and its manufacture» G 01 N 33/571.

2. Патент США 6479248 "Process and agent for detecting antibodies against Treponema pallidum" G 01 N 33/53.

3. Патент РФ «Набор для обнаружения антител к бледной спирохете Treponema pallidum, рекомбинантный полипептидный антиген Treponema pallidum 15 кДа, рекомбинантный полипептидный антиген Treponema pallidum 17 кДа и рекомбинантный полипептидный антиген Treponema pallidum TMP А», С 12 N 15/31.

4. Тест-система иммуноферментная для выявления антител класса G к Treponema pallidum с использованием рекомбинантных белков ФСП 42-0117-0281-00 «РекомбиБест антипаллидум"».

5. Патент РФ №2094807 «Способ получения стандартной позитивной панели сывороток для контроля качества иммуноферментных тест-систем и иммуноблотов», G 01 N 33/96, 33/53.

Изобретение относится к области биотехнологии и иммунологии и может быть использовано в технологии изготовления панелей сывороток для контроля качества тест-систем, предназначенных для серологической диагностики сифилиса. Панель содержит набор образцов с нормированным содержанием антител класса IgG к антигенам р17 и р41 Т.pallidum: образцы с преобладанием антител к антигену р17, с преобладанием антител к антигену р41, образцы, содержащие антитела только к антигену р17, только к антигену р41, и образцы, содержащие смесь антител к р17 и р41 в равных концентрациях. Способ изготовления панели предусматривает отбор положительных сывороток по соотношению (К) обратных титров антител к антигенам Т.pallidum с м.м. 17 и 41 кДа (К=T^-1 _p17/T^-1 _р41) и отбор исходных образцов сывороток с К≥2, К≤1/2 и К=1 и разводят их неиммунной донорской сывороткой до получения необходимых концентраций специфических антител. Использование изобретения позволяет осуществлять оценку чувствительности и специфичности тест-системы и ряда других показателей качества тест-систем на стадиях производства и применения. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Панель сывороток для контроля качества тест-систем для серодиагностики сифилиса, отличающаяся тем, что она содержит набор образцов с нормированным содержанием антител класса IgG к антигенам р17 и р41 Т.pallidum:

a) образцы с преобладанием антител к антигену р17;

b) образцы, содержащие антитела только к антигену р17;

c) образцы с преобладанием антител к антигену р41;

d) образцы, содержащие только антитела к антигену р41;

e) образцы, содержащие смесь антител к антигенам р17 и р41 в равных концентрациях.