НАБОР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛЕГИОНЕЛЛЕЗА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ И ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ Российский патент 2010 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для выявления возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора.

Легионеллез - одно из опасных инфекционных заболеваний, протекающих в форме тяжелых пневмоний, при которой до 15% случаев заканчиваются летальным исходом, или в форме респираторных заболеваний.

Большинство случаев легионеллеза связано с видом Legionella pneumophila, однако наибольшую опасность представляют Legionella pneumophila I серогруппы (1). Другие виды легионелл, такие как L. bozemanii, L. longbeachae, L. micdadei и др., вызывают заболевания преимущественно у лиц со сниженным иммунным статусом (2).

Легионеллы размножаются внутри макрофагов и локализуются в «неперевариваемой» фаголизосоме, поэтому для лечения используют антибактериальные препараты, способные проникать через мембраны клеток и накапливаться внутри вакуолей, что отличает лечение при пневмонии, вызванной другими возбудителями (3).

В связи с этим ранняя диагностика в клинических образцах возбудителя легионеллеза позволяет корректировать лечение больного и избежать тяжелых последствий, а своевременное и быстрое выявление его в объектах окружающей среды способствует предотвращению эпидемических вспышек.

Эффективность лечения больных и эпидемиологического надзора за Legionella spp. во многом определяется качеством лабораторной диагностики. Для диагностики легионеллеза применяют бактериологические, иммунологические, молекулярно-генетические методы исследования.

Бактериологический метод диагностики легионеллеза является «золотым стандартом», однако чувствительность его составляет в среднем не более 60%, несмотря на применение высококачественных питательных сред (4). Кроме невысокой чувствительности, недостатком культурального метода является его продолжительность. Максимальное количество видимых колоний вырастает на 5-8 сутки.

Иммунологические методы исследования обладают достаточно высокой чувствительностью, например, с помощью коммерческих ИФА тест-систем возможно обнаружение антигена Legionella pneumophila I серогруппы, чувствительность метода до 97%.

Иммунохроматографический анализ (ИХА) позволяет выявлять растворимый легионеллезный антиген в моче, и чувствительность достигает 95% (5, 6, 7). Недостатком данного метода является то, что он не может быть применен для другого клинического материала (мокрота, кровь, лаваж и др.) и проб из объектов окружающей среды.

Основной недостаток коммерческих ИФА и ИХА тест-систем состоит в том, что они не рассчитаны на диагностику инфекций, вызванных Legionella pneumophila 2-16 серогрупп и Legionella spp. (8).

В настоящее время наиболее перспективным считают молекулярно-генетические методы исследования, основанные на детекции ДНК возбудителя в исследуемом материале. Методом ПЦР возможно исследовать биологический материал - мокроту, бронхоальвеолярный лаваж, плевральную жидкость, мазки из ротоглотки, кровь, микро- и макроаутоптаты, а также пробы из объектов окружающей среды - воду, смывы, образцы биопленки, а также чистые культуры возбудителя.

Важным этапом при разработке ПЦР тест-систем является подбор мишеней для детекции возбудителя.

Известно использование в качестве мишеней для детекции Legionella spp. и L. pneumophila фрагментов генов mip, 16S рДНК, 5S рДНК, 23S-5S, dotA для ПЦР с учетом результатов методом электрофореза (ПЦР-ЭФ) (9, 10). Описанные мишени не обеспечивают достаточного уровня надежности для клинической диагностики легионеллеза при выполнении ПЦР-ЭФ (11).

При тщательном изучении нуклеотидных последовательностей генома Legionella pneumophila установлено, что вариабельность фрагмента гена 16S рДНК размером 1434 п.н. у штаммов Legionella pneumophila составила 2,0-6,0% (в среднем 31 полиморфный нуклеотид) между L. pneumophila и другими видами легионелл. При исследовании генов 23S-5S вариабельность среди штаммов L. pneumophila составила 7,4%, а между L. pneumophila и другими видами - 14,0-20,0%. Гены 23S (143 п.н.) и 5S (91 п.н.) обладали высокой гомологией, тогда как межгенный участок 23S-5S (102 п.н.) характеризовался высоким содержанием полиморфных нуклеотидов. Исходя из полученных данных, видно, что применение этих мишеней в ПЦР целесообразно только при использовании системы праймеров и зондов с учетом результатов в режиме «реального» времени (ПЦР-РВ).

Известен набор для детекции Legionella spp., содержащий праймеры для амплификации, для внутреннего контроля и зонд, позволяющий выявлять возбудителя с помощью ПЦР-РВ (12).

Известен коммерческий набор IQ-Check (BioRad) для скрининга легионелл в окружающей среде, сконструированный американскими исследователями (13). Однако описанный набор не предназначен для выявления возбудителя легионеллеза в биологическом материале (мокроте, бронхоальвеолярном лаваже, плевральной жидкости, мазках из ротоглотки, крови, микро- и макро-аутоптатов). Кроме того, высокая стоимость набора и невозможность выполнения с его помощью ПЦР с электрофоретическим учетом результатов ограничивают его применение в практических лабораториях, так как ПЦР с учетом результатов в режиме «реального времени» предусматривает использование дорогостоящего оборудования.

Проведенный поиск по патентам и научно-техническим источникам информации показал отсутствие сведений о наборах, предназначенных для выявления L. pneumophila методом ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флюоресцентным учетом результатов, обеспечивающих детекцию возбудителя в биологическом материале и объектах окружающей среды, а также доступных для работы в лабораториях России. Таким образом, существует потребность в создании недорогого, чувствительного и специфичного набора, который нашел бы широкое применение в практическом здравоохранении.

Задачей изобретения является создание набора для детекции возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды с возможностью использования его в ПЦР с электорофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов.

Техническим результатом заявляемого изобретения является высокоспецифичное и быстрое выявление L. pneumophila 1-14 серогрупп в биологическом материале и объектах окружающей среды.

Технический результат достигается набором для детекции возбудителя легионеллеза. Заявляемый набор содержит видоспецифичные праймеры Lp1 - 5'-GCTTGGTGCTGTGAAAGGTА-3', Lp2 - 5'-ССТССААТAAAGGAGATGCАА-3' и зонд Lp-з - 5'-ROX-TCACCGTACGCACATCCGCA-BHQ2-3', используемые при амплификации фрагмента гена ftsZ L. pneumophila в пределах с 397 по 758 нуклеотид полной последовательности локуса, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 1.

При конструировании набора для детекции возбудителя легионеллеза особое значение придавали выбору новых ДНК - мишеней.

На основании анализа нуклеотидной последовательности генома возбудителя L. pneumophila проверены 10 генов, участвующих в жизнедеятельности клетки (house keeping), и отобран фрагмент гена ftsZ. Сравнительные данные нуклеотидных последовательностей 10 генов (жизнеобеспечения) L. pneumophila и других видов легионелл представлены в табл.1 и 2. Анализ нуклеотидных последовательностей указанных генов L. pneumophila и других видов легионелл представлен по генетической базе данных GenBank NCBI. Секвенирование фрагмента гена ftsZ у штаммов L. pneumophila, выделенных на территории Российской Федерации, и их сравнение с нуклеотидной последовательностью аналогичных участков у референс-штаммов L. pneumophila Philadelphia 1, Corby, Paris, Lens (GenBank NCBI: NC_- 002942, CP 00675, NC_- 006368, NC_- 006369) показало, что наиболее перспективным для подбора праймеров при разработке ПЦР является фрагмент гена ftsZ, кодирующего синтез тубулиноподобного белка (с 397 по 758 нуклеотид). В результате тщательной проверки качества определения нуклеотидной последовательности была выведена консенсусная последовательность фрагмента гена ftsZ SEQ ID NO 1:

Обоснование выбора праймеров и зонда.

На следующей стадии конструировали набор олигонуклеотидных праймеров, специфических для детекции L. pneumophila. На основании консенсусной последовательности выбранного фрагмента гена ftsZ с помощью программы Primer Premier-V5 (Premier Bio Soft International) и алгоритма BLAST подобранны олигонуклеотидные праймеры, обеспечивающему амплификацию фрагмента данного локуса размером 185 п.н. Выбор праймеров осуществляли с учетом возможности регистрации результатов как в режиме «реального времени», так и с помощью электрофореза. Для использования праймеров в ПЦР-РВ подбирали зонд формата TaqMan (Lp-з) в онлайн-режиме на интернет-сайте www.genscript.com. Подобранные зонд Lp-з - 5'-ROX-TCACCGTACGCACATCCGCA-BHQ2-3' к участку гена fisZ и праймеры: Lpl - 5'-GCTTGGTGCTGTGAAAGGTA-3', Lp2 - 5'-CCTCCAATAAAGGAGATGCAA-3' обеспечивают высокую специфичность реакции и позволяют выявлять возбудителя легионеллеза в образцах из объектов окружающей среды и биологического материала.

Специфичность праймеров оценивали методом множественного сравнения последовательностей, используя программное обеспечение, например BLAST (Lastaew для оценки полиморфизмов в сравниваемых последовательностях).

Данные праймеры не образуют вторичных структур (шпилек) и димеров, что способствует эффективному связыванию их с матричной ДНК.

Для определения аналитической чувствительности ПЦР использовали количественно охарактеризованные разведения рекомбинантных плазмид с клонированным фрагментом гена ftsZ, а также препаратов ДНК, выделенных из проб, содержащих L. pneumophila различных серогрупп в концентрации 1×10³-1×10⁵ м.к./мл. Результаты представлены на фиг.1 и 2.

Для характеристики специфичности ПЦР применяли выборку штаммов из целевой коллекции различных микроорганизмов. Специфичность ПЦР с праймерами на основе нуклеотидной последовательности ftsZ гена представлена в табл.3.

В результате проведенной оценки установлено, что выбранные праймеры и зонд для детекции L. pneumophila обладают высокой чувствительностью - 1·10³ м.к./мл и специфичностью 100%.

Подобраны оптимальные параметры реакции амплификации с олигонуклеотидными праймерами и системой « праймер - зонд»:

- концентрация праймеров - от 5 до 16 пМ;

- концентрация зонда - от 1 до 5 пМ;

- концентрация MgCl - от 2 до 3 пМ;

- концентрация Tag-полимеразы - от 1 до 1,5 ед.;

- температура, при которой определяется уровень флуоресценции в пробах, - от 54 до 60°С;

- количество циклов, во время которых считывается флуоресценция, - от 30 до 40;

- температура отжига праймеров - от 50-64°С;

- время каждого шага цикла - 30-60 с;

- количество циклов: 35-40;

- время предварительной денатурации 1-5 мин;

- время завершающей элонгации 1-7 мин.

Экспериментально установлен оптимальный состав реакционной смеси для выполнения ПЦР-ЭФ. Подобранная концентрация праймеров Lp1 и Lp2, фермента Tag-полимеразы в концентрации 1,0 ед. и зонда Lp-з необходима и достаточна для обеспечения высокой специфичности и эффективности проведения реакции и позволяют получить легко детектируемые количества ампликонов. Сущность изобретения подтверждена примерами.

Пример 1. Выявление ДНК возбудителя L. pneumophila в биологическом материале (мокроте, бронхоальвеолярном лаваже, плевральной жидкости, мазках из ротоглотки, крови, микро- и макро-аутоптатов) с помощью ПЦР с электрофоретическим учетом результатов.

Для выявления возбудителя легионеллеза биологический материал обеззараживают путем добавления в подготовленные пробы 300 мкл раствора, содержащего 6 М гуанидинтиоцианата, и прогревают в течение 15 мин при температуре 64°С.

Выделение ДНК. В обеззараженные пробы добавляют 30 мкл сорбента, затем инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре, периодически встряхивая на вортексе 10 с, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 20 с. Отбирают супернатант и к осадку добавляют 300 мкл раствора для отмывки сорбента от клеточного дебриса и других веществ, которые могут ингибировать реакцию амплификацию; перемешивают и центрифугируют при 12000 об/мин в течение 20 с. Супернатант удаляют, а к осадку добавляют 1 мл второго отмывочного раствора (10 мМ Трис, 50 мМ NaCl, 50% этанол), перемешивают и инкубируют при температуре 64°С. Надосадочную жидкость удаляют, проводят отмывку осадка 400 мкл ацетона, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 20 с. Осадок высушивают в течение 10 мин при температуре 64°С, добавляют 50 мкл ТЕ-буфера и инкубируют при температуре 64°С в течение 10 мин, периодически встряхивая на вортексе, центрифугируют 12000 об/мин в течение 2 мин; супернатант используют в ПЦР.

Для проведения ПЦР в микропробирках объемом 0,5 мл готовят общую ПЦР-смесь исходя из того, что на одну пробу необходимо 10 мкл реакционной смеси и 0,2 мкл фермента Tag-полимеразы. Полученную смесь тщательно перемешивают на микроцентрифуге/встряхивателе и добавляют по 10 мкл в микропробирки, содержащие смесь праймеров и дНТФ под слоем парафина. Затем в пробирки вносят по 10 мкл ДНК, выделенных из исследуемых проб. Пробирка с отрицательным контрольным образцом содержит 10 мкл ТЕ-буфера, а пробирка с положительным контрольным образцом содержит 10 мкл ПКО ДНК L. pneumophila. Микропробирки, содержащие контрольные и опытные образцы, переносят в термоциклер, предварительно нагретый до 95°С, и проводят амплификацию по подобранной программе.

Детекцию продуктов амплификации проводят с помощью электрофореза в 1,5-2,5% агарозном геле по методике, приведенной в руководствах Л.А.Остермана и Т.Маниатиса (14,15). Результаты представлены в табл.3.

Пример 2. Выявление возбудителя L. pneumophila в объектах окружающей среды (вода, смывы, образцы биопленки).

Выявление возбудителя легионеллеза из объектов окружающей среды осуществляют аналогично примеру 1. Результаты детекции возбудителя легионеллеза в биологическом материале представлены в табл.4, а в пробах из объектов окружающей среды - в табл.5.

Параллельно с использованием заявляемого набора проводили исследования образцов другими методами. Полученные данные показали высокий процент совпадения результатов.

Пример 3. Детекция L. pneumophila в образцах, искусственно контаминированных микроорганизмом различных серогрупп.

Выделение ДНК и проведение ПЦР проводили аналогично примеру 1. Результаты представлены в табл.6.

Описанное изобретение не ограничивается указанными в таблицах объектами, которые предназначены только для иллюстрирования. Любые клинические образцы и объекты внешней среды находятся в сфере действия настоящего изобретения.

На основе выбранных праймеров и зонда сконструированы тест-системы «Ген L. pneumophila - РЭФ» и «Ген L. pneumophila - РГФ» для индикации L. pneumophila. Тест-системы прошли апробацию на базе Ставропольского НИПЧИ и ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» и находятся на стадии внедрения в производство.

Таким образом, использование новой мишени и соответствующих наборов праймеров и зонда к ним для детекции L. pneumophila 1-14 серогрупп с помощью ПЦР с электрофоретическим и/или гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов обеспечивает раннюю диагностику возбудителя (в течение 3-4 ч), что способствует эффективности лечения больных, повышает качество эпидемиологического надзора за объектами окружающей среды. Предлагаемый набор праймеров и зонда доступен для любой практической лаборатории здравоохранения, так как позволяет выполнять исследования при различном уровне оснащенности оборудованием и реактивами.

Таблица 3 Вид Количество Результаты   штаммов ПЦР-РЭФ ПЦР-РГФ L. pneumophila 22 + + 1-14 серогрупп       L. dumoffi 1 - - L. longbeachae 1 - - L. micdadei 1 - - Aeromonas spp. 3 - - A. faecalis 3 - - B. anthracis 1 - - B. cereus 2 - - B. subtilis 1 - - Comamonas spp. 3 - - C. diphteriae 3 - - Enterococcus spp. 9 - - E. coli 9 - - F. tularensis 1 - - H. influenzae 2 - - H. parainfluenzae 1     K. oxytoca 2 - - K. pneumoniae 4     L. monocitogenes 3 - - M. catarrhalis 1 - - P. shigelloides 3 - - P. mirabilis 1 - - P. vulgaris 3     P. aeruginosae 5 - - P. cepacia 1     P. maltophilia 1     S. paratyphi 3 - - S. typhi 1     S. typhimurium 1     S. marcescens 3 - - S. sonnei 3 - - S. flexneri 3     S. pyogenes 4 - - S. pneumoniae 11     S. salivarius 1     S. albus 1 - - S. aureus 9     S. epidermidis 5     S. pyogenes 1     Vibrio cholerae eltor 3 - - Y. enterocolitica 3 - - Y. pestis 1     Y. pseudotuberculosis 1     Candida spp. 5 - -

Таблица 4 Вид материала Кол-во исследованных проб ПЦР-ЭФ ПЦР-РГФ Бактериологический ИФА* ИХА** Секционный 2 + + + Невозможно определить Невозможно определить материал:         фрагменты легкого         фрагменты трахеи 2 + + + -«- -«- фрагменты 2 + + + -«- -«- головного и             спинного мозга             Мокрота 15 - - - -«- -«- БАЛ 3 - - - -«- -«- Мазки из 9 - - - -«- -«- ротоглотки             Моча 5 - - Невозможно определить -«-   Сыворотка крови 3 - - Невозможно определить - Невозможно определить Пробы крови и сыворотки, искусственно инфицированные L. pneumophila Philadelphia 1 333151 АТСС 4 + + + + -«- Всего: 45 45 45 37 7 5 Примечание: * - «Набор для суммарного выявления IgМ-IgG - антител к L. pneumophila серогруппы 1-6» фирмы Vircell (Испания). ** - Набор для выявления растворимого антигена L. pneumophila серогруппы I в моче «Binax NOW Legionella Urinary Antigentest» (BINAX, США). (-) - отрицательный результат. (+) - положительный результат.

Таблица 5 Виды материала Кол-во исследованных проб ПЦР-ЭФ ПЦР-РГФ Бактериологический Пробы воды из питьевого водоснабжения 14 - - - Смывы из систем питьевого водоснабжения 15 - - - Смывы из систем отопления 10 - - - Смывы из систем кондиционирования 12 - - - Пробы питьевой воды, искусственно инфицированные L. pneumophila Philadelphia 1 333151 АТСС 3 + + + Смывы с кондиционера, искусственно инфицированные L. pneumophila Philadelphia 1 333151 АТСС 3 + + + Всего: 57 57 57 57 Примечание: (-) - отрицательный результат; (+) - положительный результат.

Таблица 6 Серогруппа L. pneumophila Количество проб Детекция ПЦР-РЭФ Детекция ПЦР-РГФ 1 3 + + 2 3 + + 3 3 + + 4 3 + + 5 3 + + 6 3 + + 13 3 + + 2-14* 10 + + Референс-штаммы, CDC, (Атланта, США), 1988 L. dumoffii АТСС 33343 TEX-KL 3     L. micdadei 3     ATCC 33218       TATLOCK       L. pneumophila 3 + + Philadelphia 1       ATCC 33152       L. pneumophila 3 + + Togus 2       ATCC 33154       L. pneumophila 3 + + Bloomington 3       ATCC 33155       Примечание: * - серогруппу определяли с помощью набора реагентов для латекс-агглютинации NEW Legionella Latex Test Serogroup 1-14 (Oxoid, Великобритания).

Изобретение относится к области биотехнологии. Задачей изобретения является создание набора для детекции возбудителя легионеллеза в биологическом материале и объектах окружающей среды с возможностью использования его в ПЦР с электрофоретическим и гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов. Набор для детекции возбудителя L. pneumophila содержит видоспецифичные праймеры Lp1 - 5'-GCTTGGTGCTGTGAAAGGTА-3', Lp2 - 5'-CCTCCAATAAAGGAGATGCAA-3' и зонд Lp-з - 5'-ROX-TCACCGTACGCACATCCGCA-BHQ2-3'. ДНК-мишенью для специфической амплификации L. pneumophila является фрагмент ДНК гена fisZ, расположенный в пределах с 397 по 758 нуклеотид полной последовательности локуса. Изобретение обеспечивает быстрое и высокоспецифичное выявление L. pneumophila 1-14 серогрупп в клинических образцах и пробах окружающей среды. 2 ил., 6 табл.

Набор для детекции возбудителя L. pneumophila в биологическом материале и объектах окружающей среды, содержащий видоспецифичные праймеры Lp1 - 5'-GCTTGGTGCTGTGAAAGGTA-3', Lp2 - 5'-CCTCCAATAAAGGAGATGCAA-3' и зонд Lp-з - 5'-ROX-ТСACCGTACGCACATCCGCA-BHQ2-3', используемые при амплификации фрагмента гена ftsZ L.pneumophila в пределах с 397 по 758 нуклеотид полной последовательности локуса, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 1.