СПОСОБ ОЦЕНКИ ИНТЕНСИВНОСТИ РЕАКЦИИ ВОСПАЛЕНИЯ У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ПАРОДОНТИТОМ Российский патент 2010 года по МПК A61B10/00 C12Q1/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии и общей патологии, и может найти свое применение при разработке новых подходов к прогнозированию воспалительного ответа в тканях пародонта, основанных на оценке реакции тканевых структур полости рта.

Современный уровень представлений о патогенезе хронического пародонтита определяет его как результирующую взаимодействия «инфект-хозяин» [Канканян А.П. Болезни пародонта (новые подходы в этиологии, патогенезе, диагностике, профилактике и лечении / А.П.Канканян, В.К.Леонтьев. - Ереван, 1998. - 358 с; Cloning of the gene encoding a glycyl-prolyl aminopeptidase from Porphyromonas gingivalis / S.Nakamura [et al.] // Arch. Oral Biol. - 1992. - Vol.37, №10. - P.807-812; Distribution of Porphyromonas gingivalis biotypes defined by alleles of the kgp (Lys-gingipain) gene / M.A.Nadkarni [et al] // J. Clin. Microbiol. - 2004. - Vol.42, №8. - P.3873-3876]. При этом баланс между бактериальной инвазией и локальной резистентностью полости рта рассматривается в качестве основного фактора, определяющего клинические проявления поражений тканей пародонта - атрофию и резорбцию костных структур, наличие пародонтальных карманов, гноетечение из пародонтальных карманов, отек и гиперемия десен, расшатанность зубов [Chen М. Oral health status by social group / M.Chen, R.Andersen // Comparing oral health care system: a second International Collaborative Study. - Geneva: WHO, 1997. - P.149-163; Gene profiling in human periodontal ligament fibroblasts by subtractive hybridization / T.Yamamoto [et al.] // J. Dent. Res. - 2003. - Vol.82, №8. - P.641-645].

Тканевые реакции в полости рта, запущенные бактериальной колонизацией и сопровождающиеся изменениями метаболических процессов на уровне клеток-«мишеней» и тканей, лежат в основе клинических проявлений пародонтита [Greenstein G. A critical assessment of interleukin-1 (IL-1) genotyping when used in a genetic susceptibility test for severe chronic periodontitis / G. Greenstein, Th.C. Yart // J. Periodontol. - 2002. - Vol.73, №2. - P.231-247; Paiosaari Heidi. Matrix metalloproteinases (MMPS) and their specific tissue inhibitors (TIMPS) in nature human odontoblasts and pulp tissue / Paiosaari Heidi // Acta univ. ouluen. D. - 2003. - №739. - P.17-18; Nares S. Genetic factors in periodontology / S. Nares, P. Kolenbrander // Rialites cliniques. - 2003. - Vol.14, №3. - P.279-292]. В связи с этим, при прогнозе течения хронического воспаления в пародонте именно с клинических позиций должны быть интерпретированы результаты молекулярных механизмов тканевой резистентности полости рта.

Задача изобретения - разработка способа оценки интенсивности воспаления у больных хроническим пародонтитом путем установления ассоциаций между показателями тканевой резистентности полости рта и генетическими маркерами воспаления.

Результат решения поставленной задачи - улучшение качества оказания специализированной стоматологической помощи больным пародонтитом на основании оценки интенсивности воспаления.

Поставленная задача решается за счет того, что в комплексе клинико-лабораторных параметров определяется информативность полиморфизмов генов CD-14, TNF-α и c-fms, а также их генотипов, выбранных в качестве генетических маркеров воспаления в пародонте, которые могут быть использованы в качестве теста критического состояния возможной реализации болезни у конкретного пациента.

Определение набора генов-кандидатов обусловлено их участием в реакции воспаления. CD 14 является главным рецепторным белком, реагирующим с липополисахаридами клеточной стенки грамм-отрицательных бактерий, опознает структуру липополисахарида и активизирует врожденные защитные механизмы клетки. TNF-α -противовспалительный цитокин, который продуцируется активированными макрофагами при воспалительном ответе и регулирует иммунные реакции как в зоне воспаления, так и на системном уровне. Макрофагколониестимулирующий фактор c-fms определяет дифференцировку, пролиферацию и выживаемость клеток моноцит/макрофагального ряда и, таким образом, вовлечен в формирование неспецифического иммунитета. При хроническом генерализованном пародонтите фактор роста макрофагальных клеток c-fms участвует в дифференцировке остеокластов.

Анализ отличительных признаков показал, что предлагаемый способ существенно отличается от известных тем, что предполагает оценку интенсивности воспаления в тканях пародонта на основании сопоставления уровня экспрессии генов, регулирующих воспалительную реакцию, с атрофией костной ткани челюстей, степенью расшатанности зубов, кровоточивостью десны и глубиной пародонтальных карманов. Доказана возможность использования генов-кандидатов воспаления в качестве маркеров, определяющих тяжесть течения воспаления в тканях пародонта.

Сущность изобретения.

Исследованы однонуклеотидные полиморфизмы генов, регулирующих реакцию воспаления CD14(C/C, С/Т, Т/Т) при С(-260)→Т, TNF-α (А/A, G/A, G/G) при G(-308)→A и c-fms (3′ UTR ТС→СА) и (del425). Образцы ДНК, выделены из венозной крови обследуемых. Генотипирование осуществлялось с использованием современных молекулярных методов изучения генома: секвинирования ДНК, аллель-специфической ПЦР, ПДРФ и методов автоматического генотипирования. Известные полиморфизмы этих генов были оценены с точки зрения их генетической информативности и перспективности для последующего ассоциативного анализа.

Выборки больных хроническим пародонтитом и контрольная популяционная (лица, не имеющие патологии пародонта) были сформированы из представителей европеоидной расы, проживающей на территории г.Омска. Исследовательскую когорту составили лица обоего пола, в количестве 289 человек, из которых 148 мужчин и 141 женщина, в возрасте 17-75 лет. Средний возраст 36±4,8 лет. Группа сравнения включала лиц обоего пола, не имеющих патологии пародонта (95 человек: 48 мужчин и 47 женщин).

При анализе аллельного полиморфизма гена CD 14 среди больных хроническим генерализованным пародонтитом было зафиксировано статистически значимое (р<0,001) повышение частот генотипов С/С и С/Т в группе больных пародонтитом, по сравнению с группой пациентов, не имеющих клинически выраженных признаков воспаления в тканях пародонта (табл.1).

Таблица 1. Распределение частот генотипов и аллелей полиморфизма гена CD14 С(-260)→Т у больных пародонтитом и пациентами без признаков воспаления в тканях пародонта Группа Число обследован-
ных Частота генотипа, (абс. число) Частота аллеля, (абс. число) С/С С/Т Т/Т С Т Пациенты без клинически выраженных признаков воспаления в тканях пародонта 95 44 51 29 315 139 Пародонтит 194 99 р<0,001 115 р<0,001 38 345 169 Примечание: р-значимость рассчитана по отношению к частотам соответствующих генотипов в группе пациентов без клинически выраженных признаков пародонтита

В группе пациентов, гомозиготных по мутантному Т-аллелю, отмечаются значимое увеличение следующих показателей, характеризующих состояние локальной резистентности, по отношению к пациентам группы сравнения, имеющих такой же генотип: индекс гигиены полости рта по методике Green J., Vermillion J., 1964 (OHI-S); индекс зубного налета (ИЗН); индекс зубного камня (ИЗК); индекс кровоточивости по методике Mühlemann H.R, Son S., 1971 (SBI); папиллярно-маргинально-альвеолярный индекс по Schour Е. и Massler J. в модификации Parma С, 1976 (РМА). Эти показатели отражают процессы, которые либо инициируют воспаление в пародонте (OHI-S; ИЗН; ИЗК), либо поддерживают воспаление (OHI-S), либо являются его следствием (SBI; РМА).

Результаты изучения частот генотипов С/С; С/Т полиморфизма гена CD 14 у больных хроническим генерализованным пародонтитом обосновывают высокую диагностическую информативность экспрессии молекулы CD-14 (С/С, С/Т, Т/Т) при С(-260)→Т при оценке интенсивности воспаления в пародонте. Ассоциации степеней тяжести пародонтита с генотипом С/С полиморфизма гена CD14, значительно выше, чем для всех групп исследованных ранее в этом отношении генетических локусов.

При генотипировании пациентов по TNF-ά гену в позиции -308 были обнаружены все возможные вариации аллелей (А/А; G/A; G/G) обследованных пациентов. У больных пародонтитом отмечается статистически значимое (р=0,001) увеличение частоты генотипа G/G (гомозигота по мутантному аллелю). При этом отсутствие этого полиморфизма в группе сравнения предопределяет резистентность тканей пародонта и не способствует развитию воспаления при воздействии равных экзо- и эндогенных факторов (табл.2). Вместе с тем, отмечается значимое (р=0,003) снижение частоты генотипа А/А полиморфизма гена TNF-ά у пациентов группы сравнения по отношению к частоте соответствующего генотипа в популяции.

В результате проведенного исследования была показано значительная связь частоты генотипа А/А полиморфизма гена TNF- α у пациентов, имеющих пародонтит с некоторыми показателями тканевой резистентности полости рта. Так отмечалась статистически значимая корреляционная связь между частотой изучаемого полиморфизма и индексом РМА; индексом кровоточивости по Mühlemann H.R, Son S.. и индексом зубного камня.

Получены статистически значимые данные о наличии ассоциаций между продукцией цитокина TNF-α (А/А, G/A, G/G) при G(-308)→А и степенью тяжести хронического генерализованного пародонтита. Было показано, что частоты изученных аллелей промоторного участка гена различаются в зависимости от значений индекса PI по Russel, отмечается статистически значимое (р=0,001) влияние данных полиморфизмов на степень тяжести пародонтита.

Таблица 2. Распределение частот генотипов и аллелей полиморфизма гена TNF-ά G(-308)→А у больных пародонтитом и пациентами без признаков воспаления в тканях пародонта Группа Число обследованных Частота генотипа, (абс. число) Частота аллеля, % (абс.число) А/А G/G G/A G А Пациенты без клинически выраженных признаков воспаления в тканях пародонта 95 38 p₁=0,003 - 12 265 224 Пародонтит 194 131 286 р=0,001 44 286 214 Примечание: р-значимость рассчитана по отношению к частоте генотипа G/G в группе сравнения;
p₁-значимость рассчитана по отношению к частоте генотипа А/А в группе больных без клинически выраженных признаков воспаления тканей пародонта по отношению к популяционному контролю.

При определении полиморфизма гена c-fms (3′UTR) отмечается его клиническая информативность с точки зрения установления ассоциаций со степенью тяжести воспалительного процесса в пародонте. Установлено, что динамика изменений глубины пародонтальных карманов во всех обследованных группах больных пародонтитом определяется генотипом пациента. Увеличение глубины пародонтальных карманов при изначальной их глубине ≤3мм среди гетерозигот (С/Т) и гомозигот (С/С) произошло в 36,8±18,9% и 21,5±17,1% случаев соответственно (табл.3).

Таблица 3.   Уровень полиморфизма (del 425 и 3′UTR) гена c-ƒms у больных хроническим генерализованным пародонтитом различной степени тяжести Ген Категории больных ХГП Кол-во q%(S_q) Частота генотипа рр(N_pp) Частота генотипа pq(N_pq) Частота генотипа qq(N_qq) χ² _х-в, (Р) c-fms (3′UTR) Пародонтит легкой степени (ПК до 3 мм) 48 19,08 (3,2) 0,711 (19) 0,197 (10) 0,092 (4) 9,8 (р=0,007)   Пародонтит средней степени (ПК до 4-6 мм)* 45 25,20 (2,8) 0,596 (20) 0,358 (14) 0,102 (11) соотв. Х-В   Пародонтит тяжелой степени (ПК≥7 мм)* 54 37,26 (3,4) 0,363 (17) 0,529 (27) 0,108 (10) соотв. X-B Примечание: *χ2 - критерий, p=0,009; Фишера-критерий: F₂._Sjded, ₄₅₀=0,007(статистически значимое отличие по частотам аллелей и генотипов между пациентами со средней и тяжелой степенями тяжести пародонтита; **Фишера-критерий: F_2-Sjded, ₄₅₀=0,03 (статистически значимое отличие между пациентами со средней и тяжелой степенями тяжести пародонтита.

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии и общей патологии, и может найти свое применение при оценке интенсивности воспаления в тканях пародонта у больных пародонтитом, на основании установлении ассоциаций между полиморфизмами генов, регулирующих реакцию воспаления CD14(C/C, С/Т, Т/Т) при С(-260)→Т, TNF-a (A/A, G/A, G/G) при G(-308)→A и c-fms (3'UTR ТС→СА) и (del425) и показателями тканевой резистентности пародонта. Проводят оценку уровня экспрессии молекулы CD-14 (С/С, С/Т, Т/Т) при С(-260)→Т в сопоставлении со значениями папиллярно-маргинально-альвеолярного индекса и индекса кровоточивости, оценку уровня экспрессии цитокина TNF-α (A/A, G/A, G/G) при G(-308)→A - с увеличением значений пародонтального индекса и костного показателя, характеризующего степень резорбции костной ткани, и оценку уровня экспрессии c-fms (3'UTR TC→CA) и (del425) - с глубиной пародонтальных карманов и повышением индекса кровоточивости среди гетерозигот (С/Т) и гомозигот (С/С). Способ обеспечивает оценку интенсивности воспаления у больных хроническим пародонтитом путем установления ассоциаций между показателями тканевой резистентности полости рта и генетическими маркерами воспаления. 3 табл.

Способ оценки интенсивности реакции воспаления у больных хроническим пародонтитом, основанный на определении уровня экспрессии генов, участвующих в реакции воспаления, отличающийся тем, что оценку уровня экспрессии молекулы CD-14 (С/С, С/Т, Т/Т) при С(-260)→Т проводят в сопоставлении со значениями папиллярно-маргинально-альвеолярного индекса и индекса кровоточивости, оценку уровня экспрессии цитокина TNF-α (A/A, G/A, G/G) при G(-308)→A - с увеличением значений пародонтального индекса и костного показателя, характеризующего степень резорбции костной ткани, и оценку уровня экспрессии c-fms (3'UTR ТС→СА) и (del425) - с глубиной пародонтальных карманов и повышением индекса кровоточивости среди гетерозигот (С/Т) и гомозигот (С/С).