СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕННОГО КОМПЛЕКСА БРУЦЕЛЛ Российский патент 2010 года по МПК A61K39/10 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к способам получения протективных антигенов, и может быть использовано для специфической профилактики и оздоровления животных от бруцеллеза.

Известны способы получения специфических средств защиты животных от возбудителя бруцеллеза - живых вакцин из штаммов В.abortus 19 и В.abortus 82, включающие культивирование бруцелл вакцинных штаммов на питательной среде с последующим сбором микробных клеток, ресуспендирование и лиофильное их высушивание. Применение живых вакцин позволяет профилактировать заболевание бруцеллезом. Однако использование живых вакцин опасно из-за длительного бактерионосительства, возможности проявления остаточной вирулентности у иммунодефицитных и ослабленных особей, а также у взрослых животных, не вакцинированных в раннем возрасте. Вследствие длительных поствакцинальных гуморальных реакций (позитивные серореакции - РА, РСК и др.) снижается эффективность диагностических мероприятий, так как требуется применение дополнительных дифференциальных тестов (РИД с ОПС-антигеном и др.) Неоднократное применение живых вакцин способствует развитию патоморфологических изменений.

Известен способ получения протективного защитного антигена бруцелл (см. патент №2915437, НКИ 424-92, опубл. 11 мая 1956 г.). Испытание иммуногенной фракции в смеси с поликатионом показало ее выраженное профилактическое действие. Антиген бруцелл получают воздействием на бруцеллы углекислого натрия в интервале рН от 7 до 11 в течение нескольких суток при температуре 2°C с замораживанием-оттаиванием. Выделение антигена проводят фильтрованием через фильтр Зейтца. Готовый антиген используют в смеси с поликатионом (поливинилпирролидоном). Однако препарат не нашел применения в ветеринарной практике из-за длительности и сложности технологии приготовления.

Задачей изобретения является получение протективного антигенного комплекса бруцелл с высокой иммуногенностью и профилактическими свойствами, не осложняющего диагностику бруцеллеза.

Задача решается следующим образом: выращивают бактериальную массу на твердой питательной среде, которую отмывают физиологическим раствором от балластных веществ, при 6 тыс.об/мин в течение 30 минут, бактериальную массу ресуспендируют в соотношении 1:5 дистиллированной водой, полученную клеточную суспензию смешивают с подготовленным раствором щелочи и поликатиона, причем щелочь и поликатион находятся в равных объемах, в качестве поликатиона используют поли-N,N-диметил-N-N-диаллиламония хлорид, полученный бактериальный комплекс выдерживают при t 2-6°C, несвязавшийся поликатион и щелочь отмывают десятикратным объемом дистиллированной воды, полученную взвесь центрифугируют при 6 тыс.оборотов в течение 30 мин.

Отличительными признаками предлагаемого способа являются: центрифугирование проводят при 6 тыс.об/мин в течение 30 мин, предлагаемый режим позволяет полностью отделить бруцеллы от балластных веществ. Ресуспендирование бактериальной массы дистиллированной водой в соотношении 1:5, такое соотношение обеспечивает максимальный выход антигена из бруцелл. Полученную клеточную суспензию смешивают с подготовленным раствором щелочи и поликатиона, причем щелочь и поликатион находятся в равных объемах, щелочь обеспечивает стерильность и инактивацию бруцелл, а использование в качестве поликатиона поли-N-N-диметил-N-N-диалиламония хлорида способствует созданию прочного протективного антигенного комплекса бруцелл с высокой иммуногенностью, полученную взвесь центрифугируют при 6 тыс.об/мин в течение 30 минут.

Использование щелочи вместо углекислого натрия (см. патент №2915437) позволяет в течение суток без замораживания-оттаивания полностью инактивировать бруцеллы. Одновременное экстрагирование антигена и конъюгация его с полокатионом поли-N-N-диметил-N-N-диалиламония создает более прочный иммуногенный комплекс, который уменьшает выработку агглютининов. При использовании известного способа агглютинация меняет лишь характер получения преципитата.

Поликатион поли-N-N-диметил-N-N-диалиламония хлорид является высокомолекулярным, более 200 килодальтон, высокоэпитопным водорастворимым полимером. При конъюгировании создает прочные комплексы с многими химическими веществами, в том числе и с протеин-полисахаридами бруцелл.

Полученный протективный антигенный комплекс бруцелл обладает высокой иммуногенностью (до 100%) и профилактическими свойствами, не вызывает длительного проявления поствакцинальных специфических к бруцеллам антител, следовательно, не осложняет диагностику бруцеллеза.

ПРИМЕР

Протективный антигенный комплекс бруцелл получают следующим образом: выращивают бактериальную массу В. abortus 19 или штамма В. abortus 544 на твердой питательной среде, которую отмывают физиологическим раствором от балластных веществ, центрифугируют при 6 тыс.об/мин в течение 30 минут, бактериальную массу ресуспендируют в соотношении 1:5 дистиллированной водой, клеточную суспензию смешивают с подготовленным раствором щелочи и поликатиона, причем щелочь и поликатион находятся в равных объемах, в качестве поликатиона используют поли-N-N-диметил-N-N-диалиламония хлорид, полученную бактериальную взвесь выдерживают при t 2-6°C, несвязавшийся поликатион и щелочь отмывают десятикратным объемом дистиллированной воды, взвесь центрифугируют при 6 тыс.оборотов в течение 30 мин.

Таблица 1 Очистка бактериальной массы от балластных веществ № п/п Режимы центрифугирования Наличие бруцелл в натате тыс. микроб, клеток 1 3 тыс., 30 мин. 100 2 6 тыс., 30 мин. 0 3 6 тыс., 60 мин. 0

Из таблицы 1 видно, что режим центрифугирования 3 тыс.об/мин в течение 30 минут является недостаточным для полного осаждения бруцелл из бактериальной массы. Режим 6 тыс.об/мин в течение 30 минут является оптимальным и позволяет максимально отделить бруцеллы от балласта.

Таблица 2 № п/п Ресуспендирование полученной бактериальной массы с водой проводили при следующих соотношениях: Соотношение бак. массы с дистиллированной водой Выход антигена (%) 1 1:2 40-50 2 1:5 80 3 1:10 70

Из таблицы 2 видно, что соотношение бактериальной массы с дистиллированной водой 1:5 является оптимальным так, как обеспечивает максимальный выход антигена (80%).

Катион подбирали по прочности связи с антигеном, которую проверяли с помощью электрофореза, по диффузии антигена, чем ниже диффузия, тем прочнее связь с поликатионом. При этом учитывали иммуногенные свойства полученного антигенного комплекса, иммуногенность проверяли на морских свинках.

Таблица 3 Выбор полииона для создания протективного антигенного комплекса бруцелл № пп Полиионы Подвижность антигенов при электрофорезе иммуногенность животных (%) 1 Поливинилпирралидон положительно 100 2 поли-N-N-диметил-N-N-диалиламония хлорида отрицательно 100 3 Полиакриловая кислота положительно 60

Из таблицы 3 видно, что антиген в связи с поливинилпирралидоном проявляет диффузию (подвижен), обладая высокой иммуногенностью (до 100%), с полиакриловой кислотой также подвижен, иммуногенность - 60%, с поли-N-N-диметил-N-N-диалиламония хлоридом создает прочные ионные связи и обладает 100% иммуногенностью.

Таким образом, предлагаемый способ полученя антигенного комплекса бруцелл, основанный на культивировании бруцелл вакцинного штамма 19 с последующим разрушением клеток щелочным гидролизом с одновременной конъюгацией с поли-N-N-диметил-N-N-диалиламония хлоридом, позволяет получить прочный с высокой иммуногенностью комплекс (до 100%), профилактическими свойствами, не осложняющий диагностику бруцеллеза.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Петров Р.В., Хаитов P.M. Синтетические полиэлектролиты и регуляция отдельных этапов иммуногенеза // Иммунология. Итоги науки и техники. - М.: ВИНИТИ, 1978. - т.7. - С.223-224.

2. Патент №1518961 Способ получения вакцины против бруцеллеза. Петров Р.В., Хаитов P.M., Игнатов П.Е., Некрасов А.В., Свиридов В.Д., Федоров А.И., Горяинов Д.А., Сочнев В.В., Григорьева Г.И. - 05.12.1985.

3. Шин Н.Г. и др. Иммунологическая характеристика клеточных компонентов бруцелл / Шин Н.Г., Ременцова М.М., Студенцов В.К., Цирельсон Л.Е., Цой В.П. / ЖМЭИ, 1984. - №10. - С.92-96.

4. Григорьева Г.И., Игнатов П.Е. Антигенная структура бруцелл // Успехи современной биологии, 1991. - Т.111. - Вып.6. - С.890-904.

5. Игнатов П.Е., Федоров А.И. Способ получения бруцеллезного антигена. Авт. св-во №12565258 СССР, А61К 39/10.

6. Химические противобруцеллезные вакцины: Франция, 1982.-№2506615 А61К 39/10, Израиль, 1985. - №4493825 А61К 39/10, WO, 1984. - №84/01289 А61К 39/10

7. Bosseray N., Plommet А.-М., Plommet М. Theoretical, practical and statistical basis for a general control method of activity for anti-Brucella vaccines // Developments in biological standardization. - Geneve, 1984. - P.257-270.

8. Immuno-chemical characterization of brucella lipopolysaccharides and polysaccharides / Moreno E., Speth S., Jones L.M. and Berman D.T. // Infect. Immun.- 1984. - 31. - 1. - P.214-222.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для профилактики бруцеллеза, в частности к способам получения протективных антигенов. Способ предусматривает выращивание бактериальной массы на твердой питательной среде. Полученную бактериальную массу отмывают от балластных веществ физиологическим раствором и центрифугируют при 6 тыс.об./мин в течение 30 минут. После чего бактериальную массу ресуспендируют дистиллированной водой в соотношении 1:5. Подготавливают раствор, содержащий щелочь и поликатион, в качестве которого используют N-N-диметил N-N-диаллиламмония хлорид в равных объемах. Полученную клеточную суспензию смешивают с подготовленным раствором и выдерживают при температуре 2-6°С. Полученную взвесь промывают дистиллированной водой, после чего центрифугируют при 6 тыс. оборотов в течение 30 мин. Изобретение позволяет получить соединение с высокой иммуногенностью, не осложняющее диагностику бруцеллеза. 3 табл.

Способ получения протективного антигенного комплекса бруцелл, включающий выращивание бактериальной массы на твердой питательной среде, отмывание физиологическим раствором от балластных веществ, центрифугирование, ресуспендирование, смешивание, полученную смесь выдерживают при температуре 2-6°С, отличающийся тем, что центрифугируют при 6 тыс.об/мин в течение 30 мин, ресуспендируют дистиллированной водой в соотношении 1:5, полученную клеточную суспензию смешивают с подготовленным раствором щелочи и поликатионом, причем щелочь и поликатион находятся в равных объемах, в качестве поликатиона используют поли-N-N-диметил-N-N-диалиламония хлорид, полученную взвесь центрифугируют при 6 тыс.об/мин в течение 30 мин.