СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО L-АНТИГЕНА Российский патент 2014 года по МПК C12P1/04 A61K39/10 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, иммунологии, биотехнологии, а именно к технологии получения антигена для диагностики бруцеллеза.

Известно, что бруцеллы, как и многие другие возбудители инфекционных болезней, могут существовать в природе в S-, R- и L-формах, отличающихся друг от друга по морфологическим и биологическим свойствам, степени патогенности и специфичности антигенных детерминант [1, 2, 3, 4, 7, 8, 9].

Существующие серологические методы диагностики позволяют выявить и идентифицировать бруцеллез, вызванный персистенцией возбудителя в типичной (S-) или диссоциированной (R-) форме, и при этом не выявляют животных, инфицированных измененными L-формами бруцелл.

Известен способ изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК, включающий культивирование штамма 19, концентрирование и очистку выросшей бакмассы с использованием 0,5% фенолизированного физиологического раствора и инактивацию антигена [5]. Однако данный диагностикум также не позволяет выявлять животных, инфицированных измененными L-формами бруцелл.

Наиболее близким техническим решением является способ получения диагностической сыворотки против бруцелл в L-форме, для получения которой использовали культуры из штамма В. abortus 19 в L-форме путем трансформации исходной типичной культуры вакцинного штамма Brucella abortus 19 (S-форма) культивированием на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночно-глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5%) (MППГГА) с добавлением нормальной лошадиной сыворотки 10-15% и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл при 37-38°C в течение 4-5 суток, антиген получают путем инактивации полученное культуры нагреванием при температуре 85-90°С в течение 60 мин и трехкратно внутривенно вводят кроликам в возрастающих дозах с интервалом 72 часа [6]. Однако L-культура использовалась только для получения диагностической сыворотки против бруцелл для бактериологической диагностики бруцеллеза.

Техническим результатом изобретения является повышение эффективности и достоверности при диагностике бруцеллеза в комплексе серологических исследований при выявлении дополнительных хронически больных животных.

Заявленный технический результат достигается тем, что бруцеллезный антиген получают следующим образом: штамм Brucella abortus 19 в L-форме культивируют на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночно-глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5%) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл, при 37-38°C в течение 4-5 суток, полученную L-форме культуру смывают физиологическим раствором, инактивируют при 85-90°C в течение 60 минут, взвесь центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут, надосадочную жидкость убирают, а осадок дважды промывают физиологическим раствором, центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут. К бактериальной массе добавляют расплавленный фенол в соотношении 1:1 и растирают пестиком на водяной бане в течение 20-30 минут при температуре 55-60°C, физиологическим раствором доводят раствор фенола до 5%, фенольную суспензию центрифугирую при 5000-10000 об/мин 30-40 минут. Надосадочную жидкость отстаивают и используют в качестве антигена. Полученный антиген титруют в разведениях 1:10, 1:20, 1:40, 1:50, 1:75, 1:100, стандартизируют по специфичности и активности и используют для реакции связывания комплемента в серологической диагностике бруцеллеза. Антиген для реакции связывания комплемента (РСК) признается пригодным для диагностических целей в разведении 1:75.

Отличительным признаком предложенного способа является то, что в основе приготовления антигена лежит использование культуры Bmcella abortus 19 в L-форме для серологической диагностики, а именно для реакции связывания комплемента.

Пример 1. Специфичность антигена для реакции связывания комплемента (РСК) проверяли в соответствующих серологических реакциях с применением S-, R- бруцеллезных сывороток, негативной сыворотки крови здорового животного и L-сыворотки. Антигены из бруцелл в L-форме должны давать положительную реакцию только с L-бруцеллезными сыворотками.

В перекрестных реакциях с бруцеллезными S- и R- сыворотками были получены отрицательные результаты, что свидетельствует о специфичности антигенов, изготовленных из L-форм бруцелл (табл.1).

Таблица 1 Результаты реакции связывания комплемента (РСК) антигена из L-форм бруцелл с сыворотками Разведение L-бруцеллезного антигена Наименования и разведения бруцеллезных сывороток S-(1:5) R-(1:5) N-(1:5) L-(1:5) 1:10 отр отр отр ++ 1:20 отр отр отр ++ 1:40 отр отр отр +++ 1:50 отр отр отр ++++ 1:75 отр отр отр ++++ 1:100 отр отр отр ++ 1:200 отр отр отр +

Примечание: (N) - негативная сыворотка крови здоровых животных.

L-бруцеллезные антигены обладают строгой специфичностью и диагностической активностью и могут использоваться в комплексе серологических исследований при диагностике бруцеллеза.

Антигены, полученные из культур бруцелл в L-форме, обладают специфичностью и проявляют диагностическую активность в реакции связывания комплемента (РСК) 1:75 с гомологичными сыворотками.

Пример 2. Производственное испытание антигенов, изготовленных из L-форм бруцелл, на специфичность проводили на поголовье северных оленей благополучных по бруцеллезу (таб.2).

Таблица 2 Результаты серологических исследований на бруцеллез северных оленей в благополучных стадах Год исследования Район ЯНАО Исследовано животных (голов) Из них положительно реагирующих При этом с антигенами S R L гол % 2007 Ямальский 3211 0 0 - - - 2008 Ямальский 2543 0 0 - - - 2010 Ямальский 534 0 0 - - - Итого 6288 0 0 - - - % от общего числа исследуемых животных - - - - - -

Предлагаемый бруцеллезный L-антиген обладает строгой специфичностью в отношении S, R, N-сывороток, диагностической активностью, может найти применение в комплексе серологических исследований при диагностике бруцеллеза.

Пример 3. В очагах бруцеллезной инфекции выявляются животные, реагирующие со стандартными (S-), бруцеллезными антигенами и также отмечены случаи положительных реакций с L-бруцеллезными антигенами (таб. 3).

Количество животных с хроническим течением бруцеллеза в L-форме составило от 0,6-15,0% от числа выявленных положительно реагирующих животных.

Таким образом, предполагаемый L-бруцеллезный антиген, используемый для реакции связывания комплемента (РСК), обладает строгой специфичностью в отношении S, R, N-сывороток, диагностической активностью, повышает эффективность и достоверность диагностики бруцеллеза от 0,6-15,0%. Может быть использован в комплексе серологических исследований на бруцеллез для выявления дополнительных хронически больных животных.

Таблица 3 Результаты серологических исследований на бруцеллез северных оленей из неблагополучных стад Год исследования Район ЯНАО Исследовано животных (голов) Из них положительно реагирующих При этом с антигенами S L голов абс. % абс. % 2008 Тазовский 127 12 8 6,3 4 3,4 2009 Надымский 315 25 23 7,3 2 0,6 2011 Надымский (№2) 182 103 82 4,0 21 11,5 2011 Надымский (№5) 228 54 52 22,8 2 0,8 Итого 852 194 165 85,1 29 15,0

Литература:

1. Бочко Г.М. Сравнительная характеристика некоторых методов культивирования микоплазм и L-формы и серологических реакций, используемых для их диагностики // ЖМЭИ. - 1972. - №4. - С.61.

2. Белобаб В.И., Сарсенов М.С., Мукаев X. Биологические свойства и антигенная активность L-форм бруцелл, выделенных от животных// Инфекционные и незаразные болезни с.-х. животных в Казахстане. - Алма-Ата, 1983. - С.45-47.

3. Гордиенко Л.Н., Братцев А.Ю., Бронников В.С, Попова Т.Г. Изменчивость возбудителя бруцеллеза в организме крупного рогатого скота // Актуальные вопросы ветеринарной медицины в современных условиях: Матер. Всероссийской науч.-практич. конф. - Пенза, 2003. - С.15-17.

4. Косилов И.А. Изменчивость бруцелл и ее значение в проблеме бруцеллеза с.-х. животных //Ветеринарная профилактика болезней с.-х. животных в Сибири: Методические рекомендации. - Новосибирск, 1973.- 18 с.

5. Патент RU 2085212 C, A61K 39/10, G01N 33/569, C12N 1/20, опубл. 20.07.1999.

6. Патент RU №2268748 C2, A61K 39/40, C12N 1/20, G01N 33/531, опубл. 27.01.2006.

7. Ременцова М.М., Нифантьев В.М. Значение L-форм бруцелл в эпизоотическом процессе // Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организация мед. помощи больным: тез. докл. Всесоюзной конференции. - Москва. 1989. - С.93-94.

8. Триленко П.А. МВБ и L-формы бруцелл // ЛВИ. - 1971. Вып.№32. С.35.

9. Хузин Д.А., Фомин A.M. Получение и изучение L-форм бруцелл // Актуальные вопросы эпизоотологии: Всесоюзн. науч. конф. - Казань, 1983. - С.74.

Изобретение касается способа получения бруцеллезного L-антигена. Представленный способ включает стадии. Культивируют штамм Brucella abortus 19 в L-форме на питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночного глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5% агара) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл при 37-38°C в течение 4-5 суток. Полученную культуру смывают физиологическим раствором, инактивируют при 85-90°C в течение 60 минут. Взвесь центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут, надосадочную жидкость убирают, а осадок дважды промывают физиологическим раствором и центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут. К бактериальной массе добавляют расплавленный фенол в соотношении 1:1. Физиологическим раствором доводят раствор фенола до 5%. Фенольную суспензию центрифугирую при 5000-10000 об/мин 30-40 минут. Надосадочную жидкость отстаивают и используют в качестве антигена. Предложенный способ может быть использован в комплексе серологических исследований на бруцеллез для выявления дополнительных хронически больных животных. 3 табл., 3 пр.

Способ получения бруцеллезного L-антигена, включающий культивирование штамма Brucella abortus 19 в L-форме на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночного глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5% агара) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл при 37-38°C в течение 4-5 суток, полученную в L-форме культуру смывают физиологическим раствором, инактивируют при 85-90°C в течение 60 минут, отличающийся тем, что взвесь центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут, надосадочную жидкость убирают, а осадок дважды промывают физиологическим раствором, центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут, к бактериальной массе добавляют расплавленный фенол в соотношении 1:1 и растирают пестиком на водяной бане в течение 20-30 минут при температуре 55-60°C, физиологическим раствором доводят раствор фенола до 5%, фенольную суспензию центрифугируют при 5000-10000 об/мин 30-40 минут, надосадочную жидкость отстаивают и используют в качестве антигена, полученный антиген титруют, стандартизируют по специфичности и активности и используют для реакции связывания комплемента в серологической диагностике бруцеллеза.