СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО L-АНТИГЕНА Российский патент 2015 года по МПК C12N1/00 A61K39/02 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, иммунологии, биотехнологии, а именно к технологии получения антигена для диагностики бруцеллеза.

Диагностика и специфическая профилактика бруцеллеза несовершенна, в связи с многообразием форм микроорганизма и его способностью к внутриклеточному паразитированию, что приводит к недоступности выявления заболевания существующими методами диагностики, которые в основном базируются на использовании антигенов из S-форм бруцелл (Наставление по диагностике бруцеллеза, 2004 г.) [1].

Каждая существующая форма (S- R- L-) микроорганизма при посеве на питательные среды имеет свои особенности, которые четко обозначены только для S-формы (Наставление по диагностике бруцеллеза, 2004 г.) [1].

Известен способ получения L-субкультур B. abortus (Базиков И.A. «L-трансформация бруцелл», 1989 г.), включающий использование среды, содержащей в основе полужидкий триптический перевар бычьих сердец, 10-20% сахарозу, 0,05-5% сульфат магния, 0,01-1% натрия хлорид, 15-25% лошадиную сыворотку, 1% глицерин, 0,01-0,03% налидиксовую кислоту, а в качестве трансформирующего агунта бициллин-3 от 50 до 20000 ЕД /мл и глицерин от 0,1%о до 3%. Однако полученные по данному способу L-субкультуры бруцелл отличаются сниженными, а иногда и полностью утраченными антигенными свойствами. Антисыворотка, полученная с помощью данных L-субкультур бруцелл, была недостаточно специфична, так как агглютинировала исходные бактериальные S-формы в разведении 1:320. Антисыворотка была предложена для бактериологической диагностики бруцеллеза [2].

Известен способ получения L-субкультур - «Способ получения L-субкультур штамма brucella abortus И-206» (патент №2263142 от 2003.07.14). Способ предусматривает пассирование бруцелл штамма Brucella abortus И-206 на питательной среде, содержащей: агар-агар - 1,2; натрия хлорид - 0,1; магния сульфат - 0,05; сахароза - 10; глицерин - 1,0; нормальная лошадиная сыворотка - 10; печеночный настой - остальное, где бициллин-3 добавляют в питательную среду в нарастающих концентрациях от 10 до 9000 ЕД/мл среды. Данный способ позволяет получить L-субкультуры бруцелл при конечной концентрации бициллина-3 2000 ЕД/мл среды получают L-субкультуры бруцелл, которые при однократном внутривенном введении кроликам вызывают выработку специфических агглютининов, выявляемых в реакции агглютинации в титре 1:1600 [3]. Культивирование бруцелл L-форме происходит с применением бициллина-3 в нарастающих концентрациях от 10 до 9000 ЕД/мл среды - это длительный процесс. А получение даже небольшого количества бактериальной массы использовалось для получения гипериммунной сыворотки, которую применяли в бактериологической диагностике бруцеллеза.

Наиболее близким техническим решением является способ получения диагностической сыворотки против бруцелл в L-форме, для получения которой использовали культуры из штамма В. abortus 19 в L-форме путем трансформации исходной типичной культуры вакцинного штамма Brucella abortus 19 (S-форма) культивированием на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночно-глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5%) (МППГГА) с добавлением нормальной лошадиной сыворотки 10-15% и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл при 37-38°C в течение 4-5 суток, антиген получают путем инактивации полученной культуры нагреванием при температуре 85-90°С в течение 60 мин и трехкратно внутривенно вводят кроликам в возрастающих дозах с интервалом 72 часа [4]. Недостатком данного способа является длительный процесс приготовления антигена, целью данного изобретения ставилось получение стабильной L-культуры, и использовался антибиотик-стрептомицин, который задерживает рост микроорганизмов и переход его в исходную S-форму, выход бактериальной массы неважен, так как при введении культуры в организм экспериментального животного вырабатываются антитела (сыворотка), которую и используют для бактериологической диагностики бруцеллеза.

Техническим результатом изобретения является сокращение сроков получения бруцеллезного L-антигена, повышение выхода готовой продукции, использование антигена в комплексе серологических исследований при диагностике бруцеллеза, а именно в реакции агглютинации (РА) для выявления дополнительных больных животных с латентной формой бруцеллеза.

Заявленный технический результат достигается тем, что способ получения бруцеллезного L-антигена включает культивирование штамма Brucella abortus 19 в L-форме на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночно-глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5%) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки, инактивации взвеси при температуре 85-90°C в течение 60 минут, культивирование проводят при 20-22°C в течение 2-3 суток, полученную в L-форме культуру эмульгируют 0,5% фенолизированным физиологическим раствором, центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут и устанавливают концентрацию бруцелл 50-60 млрд. м.к., полученный антиген титруют 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, стандартизуют по специфичности и активности, используют для реакции агглютинации в серологической диагностике бруцеллеза. Антиген признается годным для диагностических целей в разведении 1:20.

Предлагаемый способ приготовления бруцеллезного L-антигена в 2 раза сокращает сроки его изготовления и повышает выход бактериальной массы для приготовления антигена в 3 раза. Антиген используют в комплексе серологических исследований при диагностике бруцеллеза, а именно в PA для выявления дополнительных больных животных с латентной формой бруцеллеза.

Изобретение характеризуется следующими примерами.

Пример 1. Культуру из штамма Brucella abortus 19 в L-форме засевают в пробирки с плотной питательной средой, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночно-глюкозо-глицеринового агара (1,3-1)5%) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл, при 37-38°C в течение 4-5 суток. Микробную взвесь Brucella abortus 19 L смывают физиологическим раствором (0,85% NaCl), готовят одно миллиардную смесь (по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Затем методом последовательных разведений выбирают концентрацию, чтобы в 1 мл находилось 100 м.к. [5].

Для исследования берут 7 температурных режимов: 18°C, 20°C, 22°C, 25°C, 30°C, 35°C, 37°C. На каждый режим готовят по 4 чашки Петри со средой, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночно-глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5%) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки. В первый вариант в среду добавляют стрептомицин, во второй вариант без стрептомицина. И в каждую чашку Петри вносят по 100 м.к. культуры Brucella abortus 19 L, которые выдерживают в разных температурных режимах, рост культуры Brucella abortus 19 L проверяют на чашках Петри визуально ежедневно в течение 5 суток (табл.1).

При разных температурных режимах в средах со стрептомицином и без него культуры В. abortus 19 L на чашках Петри росли по-разному. При температуре 20°C, 22°C на средах без антибиотика на 2-3 сутки выросло колоний в 3 раза больше, чем со стрептомицином. При температуре 37°C только на 5-е сутки выросло колоний одинаковое количество со стрептомицином и без него, количество колоний было меньше, чем в первом примере.

В предложенном способе получения бруцеллезного L-антигена на 2-3 сутки при температуре 20-22°C отмечался максимальный рост бактериальной массы. Культивирование B. abortus 19 L при температуре 20-22°C в 2 раза сокращает сроки приготовления антигена и в 3 раза выход бактериальной массы.

Таблица 1 Зависимость роста культуры B. abortus 19 L от температурного режима в течение 5 суток Температура Сутки (1-5) Среда со стрептомицином, на чашках Петри Среда без антибиотика на чашках Петри 18°C   1 2 3 4 1 2 3 4 1 25 22 20 18 52 53 55 49 2 28 30 32 30 54 55 58 55 3 50 52 50 52 72 75 70 68 4 52 53 52 53 81 82 83 82 5 67 65 53 54 83 82 84 85 20°C 1 22 21 22 21 75 74 75 76 2 24 28 25 30 100 99 101 100 3 47 44 50 52 151 150 149 150 4 50 49 51 53 200 201 199 271 5 66 62 53 54 270 269 271 270 22°C 1 23 21 20 21 76 75 74 77 2 25 27 24 27 135 140 138 135 3 46 42 48 47 155 158 158 156 4 51 47 53 53 200 205 206 210 5 67 68 60 59 269 272 273 270 25°C 1 26 24 24 23 70 66 69 65 2 29 31 32 30 74 69 72 73 3 50 51 50 52 88 89 85 86 4 55 54 53 55 104 109 107 108 5 66 65 60 59 150 145 146 148 30°C 1 45 46 42 43 46 48 50 51 2 60 67 66 65 69 69 68 70 3 78 72 71 74 89 91 93 94 4 84 83 88 81 100 106 ПО 116 5 90 89 88 85 120 118 117 118 35°C 1 46 47 48 50 29 33 31 30 2 68 70 66 75 77 74 73 72 3 85 82 80 86 93 98 92 96 4 95 97 94 94 99 100 101 100 5 106 107 109 108 111 106 113 110 37°C 1 48 49 50 51 28 32 30 33 2 69 69 68 70 75 74 76 77 3 89 89 85 84 99 98 98 97 4 99 98 97 98 100 99 100 101 5 109 110 111 110 110 108 112 110

Пример 2. Специфичность L-антигена проверяли в соответствующих серологических реакциях с применением S- и R-бруцеллезных сывороток из коммерческих диагностических наборов и негативной (N-) сыворотки крови здоровых животных. Антиген для реакции агглютинации (РА) из бруцелл в L-форме дает положительную реакцию только с L-бруцеллезными сыворотками (табл.2, 3, 4).

Таблица 2 Результаты реакции агглютинации (PA) L-бруцеллезного антигена с бруцеллезными (S-,R-) и негативной (N-) сыворотками Разведение L-бруцеллезного антигена Наименования и разведения бруцеллезных сывороток S-(1:10) R-(1:10) N-(1:10) L-(l:10) 1:5 отр отр отр ++ 1:10 отр отр отр +++ 1:20 отр отр отр ++++ 1:40 отр отр отр ++++

Из таблицы видно, что в перекрестных реакциях с гетерологичными (S-и R-) сыворотками получены отрицательные, а с гомологичными (L-) сыворотками - положительные результаты.

Из приведенных выше данных следует, что предлагаемый бруцеллезный L- антиген, обладает строгой специфичностью в отношении S, R и N сывороток и диагностической активностью. Рабочая концентрация микробных клеток L-антигена 50-60 млрд.

Пример 3. Производственное испытание бруцеллезного L-антигена проводили на поголовье северных оленей в стадах с различной эпизоотической характеристикой по бруцеллезу общей численностью 4400 голов, в том числе в неблагополучных по бруцеллезу -1005 головы.

Специфичность L-антигена определяли на поголовье северных оленей, благополучных по бруцеллезу (табл.3).

Таблица 3 Результаты серологических исследований на бруцеллез северных оленей в благополучных стадах Год исследования Район ЯНАО Исследовано животных (голов) Из них положительно реагирующих При этом с антигенами S R L гол. % 2010 Ямальский 3000 0 0 - - - 2011 Ямальский 1000 0 0 - - - 2012 Ямальский 400 0 0       Итого 4400 0 0      

Приведенные данные подтверждают, что антиген, полученный из L-культур, обладает специфичностью и проявляет диагностическую активность в реакции агглютинации (PA) с сыворотками, несодержащими S-, R-, L-антитела.

В очагах бруцеллезной инфекции находятся животные - носители не только S-, но и L-форм возбудителя, которые не регистрируются коммерческими S-антигенными диагностикумами, а дополнительно выявляются предлагаемым L-антигеном (табл.4).

Таблица 4 Результаты серологических исследований на бруцеллез северных оленей из неблагополучных стад Год исследования Район ЯНАО Исследовано животных (голов) Из них положительно реагирующих При этом с антигенами S L голов % 2008 Надымский 184 2 1,0 2 - 2009 Тазовский 379 3 0,8 3 - 2010 Надымский 315 48 31,5 22 26 2011 Надымский 127 4 3,1 2 2 Итого 1005 57 - 29 28 % от числа исследованных -     2,8 2,7

Из таблицы видно, что из 1005 исследованных голов выявлено положительно реагирующих - 57 голов, что составило 5,5% от общего числа исследованных животных, в том числе известным S- антигеном выявлено 2,8% животных (29 голов), а предлагаемый L-антиген позволил дополнительно выявить 2,7% (28 голов) животных-бруцеллоносителей с персистенцией возбудителя в L-форме.

Таким образом, предлагаемый бруцеллезный L-антиген, используемый в реакции агглютинации (PA), обладает строгой специфичностью в отношении S-, R- и N-сывороток, диагностической активностью, повышает эффективность и достоверность диагностики бруцеллеза на 50,0%. Может быть использован для диагностики бруцеллеза у животных-бруцеллоносителей с персистенцией измененных L-форм возбудителя.

Изобретение позволяет сократить в 2 раза сроки приготовления антигена за счет изменения температурного режима при выращивании Brucella abortus 19 в L-форме и увеличить выход бактериальной массы в 3 раза, полученный антиген может быть использован в PA, в комплексе серологических исследований на бруцеллез для выявления дополнительных больных животных с латентной формой инфекции, что позволит повысить эффективность и достоверность диагностики бруцеллеза на 50%.

ЛИТЕРАТУРА

1. Наставление по диагностике бруцеллеза животных. - М., 2004. - 62 с.

2. Базиков И.А. Л-трансформация бруцелл / Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций: тезисы докл. областной научн. конф. молод. ученых, 17-20 октября 1989 г., Ростов-на-Дону, 1989, стр.5-8.

3. Патент RU №2263142 C2, 7C12N 1/20, C12N 1/20, C12R 1:00, «Способ получения L-субкультур штамма Brucellaabortus И-206», опубликовано 2005.10.27.

4. Патент RU №2268748 C2, A61K 39/40, C12N 1/20, G01N 33/531, опубл. 27.01.2006.

5. Альтон Дж., Джонс Л.М. Методы лабораторных исследований по бруцеллезу / ФАО / ВОЗ, Женева, 1968. - 86 с.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения антигена для диагностики бруцеллеза. Способ получения бруцеллезного L-антигена осуществляют следующим образом. Культивируют штамм Brucella abortus 19 в L-форме на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночного глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5%) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки при 20-22°C в течение 2-3 суток. Полученную в L-форме культуру эмульгируют 0,5% фенолизированным физиологическим раствором, инактивируют при 85-90°C в течение 60 минут. Взвесь центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут и устанавливают концентрацию бруцелл 50-60 млрд. м.к. Полученный антиген титруют, стандартизируют по специфичности и активности. Используют для реакции агглютинации в серологической диагностике бруцеллеза. Изобретение позволяет в сократить сроки приготовления антигена и увеличить выход бактериальной массы. 4 табл., 3 пр.

Способ получения бруцеллезного L-антигена, включающий культивирование штамма Brucella abortus 19 в L-форме на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночно-глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5% агара) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки, инактивация взвеси при температуре 85-90°C в течение 60 минут, отличающийся тем, культивирование проводят при 20-22°C в течение 2-3 суток, полученную в L-форме культуру эмульгируют 0,5% фенолизированным физиологическим раствором, центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут и устанавливают концентрацию бруцелл 50-60 млрд. м.к., полученный антиген титруют, стандартизируют по специфичности и активности и используют для реакции агглютинации в серологической диагностике бруцеллеза.