СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ ПРИ БРУЦЕЛЛЕЗЕ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к изготовлению диагностических препаратов, и может быть использовано для серологической диагностики бруцеллеза животных.

Известен способ получения бруцеллезного эритроцитарного диагностикума путем дезинтеграции бруцелл ультразвуком с последующим выделением антигена и сенсибилизацией формалинизированных эритроцитов, при этом дезинтеграцию ведут при pH 8,0-9,0, сенсибилизацию эритроцитов проводят при 70-72ºС в течение 5-10 мин [А.с. №784879, 1980 г.]. Недостатком данного способа является то, что при изготовлении диагностикума необходимо проводить танизацию эритроцитов, что усложняет производственный процесс, а при использовании отдельных партий танина антиген может проявлять неспецифичность при исследовании в РНГА сыворотки крови здоровых животных, кроме того, диагностикум обладает недостаточной активностью.

Наиболее близким аналогом является способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе, включающий приготовление формалинизированных эритроцитов с их последующей сенсибилизацией сенситином, полученным выращиванием бактериальной массы бруцелл, смыв ее гипертоническим раствором хлорида натрия, инактивацию, экстрагирование и отделение сенситина центрифугированием, при этом перед обработкой сенситином, формалинизированные эритроциты предварительно обрабатывают додецилсульфатом натрия в 1%-ной концентрации при 50-60ºС в течение 30 минут [RU 2283498 С1, 22.02.2005 г.]. Однако данный способ не позволяет получить антиген с высокой активностью, в связи с чем при диагностике бруцеллеза в неблагополучных хозяйствах РНГА с применением известного диагностикума недовыявляет часть больных животных, имеющих в сыворотке крови специфические гемагглютинины в диагностических титрах. Кроме того, производство эритроцитарного диагностикума этим способом дорогостоящее, т.к. требует большого количества исходного материала - бактериальной массы для извлечения сенситина и нагрузки им формалинизированных эритроцитов.

Техническим результатом изобретения является разработка способа получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе (РНГА), обладающего более высокой активностью при обнаружении больных бруцеллезом животных при снижении экономических затрат на его производство.

Технический результат достигается тем, что приготавливают формалинизированные эритроциты барана и сенсибилизируют их сенситином, полученным выращиванием бактериальной массы бруцелл, смывом ее гипертоническим раствором хлорида натрия, инактивируют, экстрагируют и отделяют сенситин центрифугированием, при этом формалинизированные эритроциты барана сенсибилизируют антигеном, изготовленным при воздействии на инактивированную бактериальную массу штамма В.abortus 19 в дозе 40-50 млрд микробных клеток в 1 мл додецилсульфата натрия в 1%-ной концентрации при 70-72ºС в течение 45 минут с последующей нагрузкой эритроцитов сенситином из расчета 0,2-0,4 мл антигена на 1 мл 5%-ной взвеси эритроцитов.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Трехсуточную агаровую культуру бруцелл штамма В.abortus 19 смывают 12%-ным раствором хлорида натрия, фильтруют и подвергают инактивации автоклавированием при 1 атм. (120ºС) в течение 30 минут, доводят концентрацию бруцелл до 40-50 млрд м.к. в 1 мл 12%-ным раствором NaCl. К бактериальной взвеси добавляют 1% додецилсульфата натрия, после чего ее нагревают в водяной бане при температуре 70-72ºС в течение 45 минут при периодическом перемешивании с интервалом 5 минут.

Взвесь декантируют путем центрифугирования при 7-8 тыс об/мин в течение 30 минут, надосадочную жидкость (антиген) используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана.

Сенсибилизацию формалинизированных эритроцитов проводят оптимальной дозой сенситина, которую определяют при титрации сенситина со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус.

Специфичность и активность сенситина проверяют при исследовании в РНГА негативной сыворотки и стандартного образца сыворотки антибруцелла абортус.

Пример определения оптимальных условий сенсибилизации формалинизированных эритроцитов сенситином, полученным при воздействии на бактериальную взвесь разных концентраций додецилсульфата, представлен в таблице 1. Данные таблицы 1 показывают, что оптимальной концентрацией додецилсульфата натрия при извлечении антигена является 1%-ная его концентрация, позволяющая получить активный сенситин с заданной активностью в РНГА не ниже титра 1:3200 с оценкой 4 креста при постановке со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус и отрицательным результате с негативной сывороткой.

Оптимальную сенсибилизирующую дозу сенситина, необходимую для получения эритроцитарного антигена для РНГА, определяют путем адсорбции его в возрастающих концентрациях на формалинизированных эритроцитах и испытания активности сенсибилизированных эритроцитов в РНГА при титрации со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус, специфичности - с негативной сывороткой и физиологическим раствором.

При титрации сенситина для сенсибилизации эритроцитов его добавляют в количествах 0,1; 0,2; 0,4; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0 мл к 1 мл 5%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов.

Результаты проверки активности и специфичности антигена, полученного при сенсибилизации эритроцитов разными дозами сенситина, представлены в таблице 2. Анализ данных таблицы 2 показывает, что антиген, изготовленный путем обработки формалинизированных эритроцитов 1%-ной концентрацией додецилсульфата натрия с последующей их сенсибилизацией сенситином, извлеченным автоклавированием, обладает более низкой серологической активностью в сравнении с антигеном, полученным при сенсибилизации формалинизированных эритроцитов сенситином, извлеченным при воздействии 1%-ной концентрации додецилсульфата. Оптимальным количеством сенситина для обработки эритроцитов является 0,2-0,4 мл на 1 мл 5%-ной взвеси эритроцитов, эритроцитарный антиген обладает активностью (титр 1:6400-1:12800) и специфичностью (отрицательный результат с негативной сывороткой и физиологическим раствором).

При сенсибилизации эритроцитов, предварительно обработанных детергентом (по аналогу), для получения титра РНГА 1:3200 со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус требуется 1,5 мл сенситина, т.е. в 7,5 раз больше, чем с предлагаемым антигеном.

Следовательно, сенсибилизация формалинизированных эритроцитов сенситином, изготовленным предлагаемым способом, из расчета 0,2-0,4 мл его на 1 мл 5%-ной взвеси эритроцитов, позволяет получить специфичный и более активный (по сравнению с аналогом) бруцеллезный эритроцитарный антиген для РНГА.

Результаты испытания специфичности и активности бруцеллезных эритроцитарных антигенов, изготовленных разными способами, представлены в таблицах 3, 4. Данные таблицы 3 и 4 показывают, что предлагаемый способ позволяет получить специфичный и более активный бруцеллезный эритроцитарный антиген в сравнении с аналогом.

Активность диагностикума повышена за счет воздействия на микробную взвесь химического детергента - 1% додецилсульфата натрия. Экономические затраты на производство снижены в два раза за счет уменьшения концентрации микробных клеток при извлечении сенситина и уменьшении его количества при нагрузке формалинизированных эритроцитов.

Эритроцитарный бруцеллезный антиген для РНГА, изготовленный по способу ВНИИБТЖ, испытан при проведении эпизоотического контроля за благополучием хозяйств по бруцеллезу крупного и мелкого рогатого скота и оздоровлении неблагополучных пунктов с высоким экономическим и противоэпизоотическим эффектами в хозяйствах Омской области.

Таблица 1 Влияние концентрации додецилсульфата натрия на активность и специфичность бруцеллезного эритроцитарного антигена Концентрация додецилсульфата натрия Количество антигена на 1 мл 5,0% взвеси эритроцитов Титр со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус Контроль с негативной сывороткой Контроль с физиологическим раствором 0,25% 0,2 - - - 0,4 - - - 1 - - - 2 1:400+++ - - 3 1:800+++ - - 0,5% 0,2 - - - 0,4 1:200++++ - - 1 1:200++++ - - 2 1:800++++ - - 3 1:1600++++ - - 1,0% 0,2 1:6400++++ - - 0,4 1:12800++++ - - 1 1:25600+++ - - 2 1:25600+++ - - 3 1:51200+++ - - 1,5% 0,2 1:3200++++ - ++ 0,4 1:6400++++ ++ ++++ 1 1:12800++++ ++++ ++++ 2 1:25600++++ ++++ ++++ 3 1:51200++++ ++++ ++++ 2,0% 0,2 1:6400++++ ++++ ++++ 0,4 1:25600++++ ++++ ++++ 1 1:51200++++ ++++ ++++ 2 1:51200++++ ++++ ++++ 3 1:51200++++ ++++ ++++

Таблица 2 Результаты титрации сенситина и проверки активности, специфичности эритроцитарных бруцеллезных антигенов в РНГА Количество сенситина на 1мл 5% взвеси эритроцинов Титр в РНГА со стандартным образцом сыворотки антибруцелла абортус с негативной сывороткой с физ. раствором 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200 1:6400 1:12800 1:25600 1:50 1:100 1:200 1:400 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 с антигеном ВНИИБТЖ 0,1 ++++ ++++ ++++ ++++ +++ + - - - - - - - 0,2 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ + - - - - - 0,4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ - - - - - 1,0 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ - - - - - 1,5 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ - - - - - 2,0 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ - - - - - 3,0 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ - - - - с антигеном Прикаспийского ЗНИВИ 0,1 - - - - - - - - - - - - - 0,2 - - - - - - - - - - - - - 0,4 ++ ++ ++ ++ - - - - - - - - - 1,0 ++++ ++++ ++++ +++ + - - - - - - - - 1,5 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ + - - - - - - - 2,0 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ - - - - - - - 3,0 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ ++ - - - - - -

Таблица 3 Результаты испытания специфичности бруцеллезных эритроцитарных антигенов № п/п Сыворотки крови, подвергнутые исследованию Количество исследованных проб Результат исследования с антигеном НИИБТЖ с антигеном Прикаспийского ЗНИВИ (аналог) 1 здорового по бруцеллезу крупного рогатого скота 2594 - - 2 здорового по бруцеллезу мелкого рогатого скота 666 - - 3 здоровых по бруцеллезу свиней 748 - - 4 больного лейкозом крупного рогатого скота 36 - - 5 больного лептоспирозом крупного рогатого скота 20 - - 6 туляремийные 3 - - 7 сальмонеллезные 4 - - 8 больного инфекционным эпидидимитом баранов 5 - - 9 больных бруцеллезом собак, вызванным В.canis 10 - - Всего исследовано 4086 - -

Таблица 4 Результаты сравнительного испытания активности бруцеллезных эритроцитарных антигенов Вид животного Количество исследованных проб Реагировали положительно в РНГА с антигеном ВНИИБТЖ с антигеном Прикаспийского ЗНИВИ (аналог) абс. % средний титр абс. % средний титр крупный рогатый скот неблагополучных по бруцеллезу хозяйств 78 20 25,6 1:290 15 19,2 1:213 мелкий рогатый скот неблагополучных по бруцеллезу хозяйств 157 92 58,6 1:133 59 37,6 1:101

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности к изготовлению диагностических препаратов, и может быть использовано для серологической диагностики бруцеллеза животных. Способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе включает приготовление формалинизированных эритроцитов барана и их сенсибилизацию сенситином, полученным выращиванием бактериальной массы бруцелл, смывом ее гипертоническим раствором хлорида натрия, инактивацию, экстрагирование и отделение сенситина центрифугированием. При этом формалинизированные эритроциты барана сенсибилизируют антигеном, изготовленным при воздействии на инактивированную бактериальную массу штамма В.abortus 19 в дозе 40-50 млрд микробных клеток в 1 мл додецилсульфата натрия в 1%-ной концентрации при 70-72°С в течение 45 минут, с последующей нагрузкой эритроцитов сенситином из расчета 0,2-0,4 мл антигена на 1 мл 5%-ной взвеси эритроцитов. 4 табл.

Способ получения эритроцитарного антигена для реакции непрямой гемагглютинации при бруцеллезе, включающий приготовление формалинизированных эритроцитов барана с их последующей сенсибилизацией сенситином, полученным выращиванием бактериальной массы бруцелл, смывом ее гипертоническим раствором хлорида натрия, инактивацию, экстрагирование и отделение сенситина центрифугированием, отличающийся тем, что формалинизированные эритроциты барана сенсибилизируют антигеном, изготовленным при воздействии на инактивированную бактериальную массу штамма В. abortus 19 в дозе 40-50 млрд микробных клеток в 1 мл додецилсульфата натрия в 1%-ной концентрации при 70-72°С в течение 45 мин, с последующей нагрузкой эритроцитов сенситином из расчета 0,2-0,4 мл антигена на 1 мл 5%-ной взвеси эритроцитов.