СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО L-АНТИГЕНА Российский патент 2013 года по МПК A61K39/02 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, иммунологии, биотехнологии, а именно к технологии получения антигена для диагностики бруцеллеза.

Бруцеллы, как и многие другие возбудители инфекционных болезней, могут существовать в природе в S-, R- и L-формах, отличающихся друг от друга по морфологическим и биологическим свойствам, степени патогенности и специфичности антигенных детерминант [1, 2, 5, 6, 10, 11].

Существующие серологические методы диагностики позволяют выявить и идентифицировать бруцеллез, вызванный персистенцией возбудителя в типичной (S-) или диссоциированной (R-) форме и при этом не выявляют животных, инфицированных измененными L-формами бруцелл.

Известен способ получения антигена для диагностики бруцеллеза [7], согласно которому вакцинный штамм В.abortus 19 выращивают на плотной питательной среде, выросшую культуру смывают цитратным буфером с pH 5,3-5,5, бактериальные клетки инактивируют нагреванием, проводят ресуспендирование взвеси 12% раствором хлорида натрия до конечной концентрации 2×10¹⁰ КОЕ/мл, добавляют краситель метиленовый голубой и консервант фенол. Полученный антиген используют в реакциях агглютинации Райта и Хеддельсона для диагностики бруцеллеза. Однако данный диагностикум не позволяет выявить животных, инфицированных измененными L-формами бруцелл.

Известен способ изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК, включающий культивирование штамма 19, концентрирование и очистку выросшей бакмассы с использованием 0,5% фенолизированного физиологического раствора и инактивацию антигена [8]. Однако данный диагностикум также не позволяет выявлять животных, инфицированных измененными L-формами бруцелл.

Известен «Способ получения диагностической сыворотки против бруцелл в L-форме», для получения которой использовали культуры из штамма В.abortus 19 в L-форме путем трансформации исходной типичной культуры вакцинного штамма Brucella abortus 19 (S-форма) культивированием на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночно-глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5%) (МППГТА) с добавлением нормальной лошадиной сыворотки 10-15% и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл среды при 37-38°C в течение 4-5 суток, антиген получают путем инактивации полученной культуры нагреванием при температуре 85-90°C в течение 60 мин, а гипериммунизацию кроликов осуществляют путем трехкратного внутривенного введения антигена в возрастающих дозах. [9]. Однако стабильная L-культура использовалась только для получения диагностической сыворотки против бруцелл, для бактериологической диагностики бруцеллеза.

Техническим результатом изобретения является повышение специфичности диагностикумов за счет получения бруцеллезного L-антигена: в комплексе серологических исследований при диагностике бруцеллеза.

Заявленный технический результат достигается тем, что бруцеллезный антиген получают следующим образом: штамм Brucella abortus 19 в L-форме культивируют на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночного глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5%) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл, при 37-38°C в течение 4-5 суток, полученную в L-форме культуру эмульгируют 0,5% фенолизированным физиологическим раствором, инактивируют при 85-90°C в течение 60 минут, взвесь центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут и устанавливают концентрацию бруцелл 50-60 млрд м.к., полученный антиген титруют, стандартизуют по специфичности и активности и используют для реакции агглютинации в серологической диагностике бруцеллеза.

Отличительным признаком предложенного способа является то, что в основе приготовления антигена лежит использование стабильной культуры Brucella abortus 19 в L-форме, для серологической диагностики бруцеллеза.

Предлагаемый бруцеллезный L-антиген обладает строгой специфичностью в отношении S, R, N-сывороток, диагностической активностью, может найти применение в комплексе серологических исследований при диагностике бруцеллеза.

Пример 1. Для получения бруцеллезного L-антигена используют стабильную культуру из штамма В.abortus 19 в L-форме, полученную путем трансформации исходной, типичной культуры вакцинного штамма В. abortus 19 (S-форма) за счет культивирования на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночного глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5% агара) (МППГТА) с добавлением нормальной лошадиной сыворотки 10-15% и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл при 37-38°C в течение 4-5 суток. В результате неоднократно проведенных исследований установлено, что образование L-форм происходит при воздействии на исходную клетку (S-форма) бруцелл стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл среды. Меньшая концентрация антибиотика не вызывала образование L-форм бруцелл, а большая приводила к задержке роста и нередко к гибели культуры [1].

Таблица 1. Получение L-культуры бруцелл в стабильном состоянии в опытах in vitro Изучаемый штамм Доза стрептомицина (ЕД/мл среды) 0,1 0,25 0,5 1,0 2,5 5,0 10,0 20,0 40,0 В. abortus 19 S S S S L L O O O

Примечание: S - типичные S-формы возбудителя;   L - измененные L формы возбудителя;   О - отсутствие роста.  

При высеве полученной L-культуры на плотных питательных средах образуются колонии округлой формы, уплощенные, гладкие с ровными краями, беловато-серого цвета. На бульоне рост сопровождается равномерным помутнением среды, с последующим просветлением и образованием на дне пробирки обильного рыхлого осадка белого цвета.

При микроскопии нативных мазков полученная L-культура представляла собой грамположительные гигантские клетки эллипсоидной формы (овоиды) размером 2,5-3,0×5,0-6,0 мкм.

L-форма В. abortus 19 в значительной степени утрачивает ригидную клеточную стенку. Она агглютинируется L- и не агглютинируется S- и R-бруцеллезными сыворотками. Дает положительную реакцию термоагглютинации и пробу с трипафлавином. Не выделяет сероводород. Хорошо растет на средах с тионином и фуксином. Характеризуется слабовирулентными свойствами [9].

Способ получения бруцеллезного L-антигена, осуществляется следующим образом: берут культуру из штамма Brucella abortus 19 в L-форме, культивируют на мясо-пептонный печеночного глюкозо-глицериновый агар (1,3-1,5% агара) с добавляем нормальной лошадиной сыворотки 10-15% и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл среды при 37-38°C в течение 4-5 суток. Выросшую бакмассу смывают с плотной питательной среды и эмульгируют 0,5% фенолизированным физраствором, для получения однородной консистенции, которую инактивируют при температуре 85-90°C в течение 60 минут, затем центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут. Полученная концентрация микробных клеток высокая, и ее доводят до концентрации 50-60 млрд м.к. (по стандарту мутности ГИСКа им.Л.А.Тарасовича) в 0,5% фенолизированным физраствором.

Полученный антиген титруют в разведениях 1:10, 1:20, 1:40, 1:60, 1:75. Антиген признается годным для диагностических целей в разведении 1:20, который отрабатывали на гомологичных и гетерологичных сыворотках. Используют полученный антиген для реакции агглютинации в серологической диагностике бруцеллеза.

Пример 2. Специфичность L-антигена, проверяли в соответствующих серологических реакциях с применением S- и R-бруцеллезных сывороток из коммерческих диагностических наборов и негативной (N-) сыворотки крови здоровых животных. Антиген для реакции агглютинации (РА) из бруцелл в L-форме дает положительную реакцию только с L-бруцеллезными сыворотками (табл.2, 3, 4).

Таблица 2 Результаты реакции агглютинации (РА) L-бруцеллезного антигена с бруцеллезными (S-,R-) и негативной (N-) сыворотками Разведение L-бруцеллезного антигена Наименования и разведения бруцеллезных сывороток S- (1:10) R- (1:10) N- (1:10) L- (1:10) 1:10 отр отр отр ++++ 1:20 отр отр отр ++++ 1:40 отр отр отр ++++ 1:60 отр отр отр ++ 1:75 отр отр отр -

Из таблицы видно, что в перекрестных реакциях с гетерологичными (S- и R-) сыворотками получены отрицательные, а с гомологичными (L-) сыворотками - положительные результаты.

Таким образом, предлагаемый бруцеллезный L-антиген, обладает строгой специфичностью в отношении S, R и N сывороток и диагностической активностью. Рабочая концентрация микробных клеток L-антигена 50-60 млрд.

Пример 3. Производственное испытание бруцеллезного L-антигена проводили на поголовье северных оленей в стадах с различной эпизоотической характеристикой по бруцеллезу общей численностью 8232, в том числе в неблагополучных по бруцеллезу -1944 головы.

Специфичность L-антигена определяли на поголовье северных оленей, благополучных по бруцеллезу (табл.3).

Приведенные данные подтверждают, что антиген, полученный из L-культур, обладает специфичностью и проявляют диагностической активности в реакции агглютинации (РА) с сыворотками, не содержащими S, R, - L-антитела.

В очагах бруцеллезной инфекции находятся, как показали наши предыдущие бактериологические исследования [3, 4], животные - носители не только S, -R-, но и L-форм возбудителя, которые не регистрируются известными S, -R-антигенными диагностикумами, а дополнительно выявляются предлагаемым L-антигеном (табл.4).

Из таблицы видно, что из 1944 исследованных голов выявлено положительно реагирующих - 134 головы, что составило 6,9% от общего числа исследованных животных, в том числе известным S-антигеном выявлено 79,1% животных (106 голов), а предлагаемый L-антиген позволил дополнительно выявить 20,9% (28 голов) животных-бруцеллонисителей с персистенцией возбудителя в L-форме.

Таким образом, предлагаемый бруцеллезный L-антиген, используемый в реакции агглютинации (РА), обладает строгой специфичностью в отношении S-, R- и N сывороток, диагностической активностью, повышает эффективность и достоверность диагностики бруцеллеза на 20-25%. Может быть использован для диагностики бруцеллеза у животных-бруцеллоносителей с персистенцией измененных L-форм возбудителя.

Литератур

1. Базиков И.А., Бондаренко А.Н. Ультраструктурная организация L-форм бруцелл и культур ревертантов // ЖМЭИ. - 1991. №1. - С.17-20.

2. Бакулов И.А., Зеленцова Т.Я. Проблема L-форм бактерий в ветеринарии // Ветеринария. - 1980. №10. - С.23.

3. Гордиенко Л.Н., Братцев А.Ю., Бронников В.С, Попова Т.Г. Изменчивость возбудителя бруцеллеза в организме крупного рогатого скота // Актуальные вопросы ветеринарной медицины в современных условиях: Матер. Всероссийской науч. - практич. конф. - Пенза, 2003. - С.15-17.

4. Гордиенко Л.Н. Свойства измененных форм бруцелл. изолированных от северных оленей // Сельское хозяйство Севера на рубеже тысячелетий: Сб. науч. тр. ч.1. - Магадан, 2004. С.236-239.

5. Зыкин Л.Ф., Васильев Д.А. L-формы возбудителей зооантропонозов. - Ульяновск, 2000. 68 с.

6. Качесова Л.М. Результаты исследования на нестабильный (реверсивный) L-бруцеллезный бактериоз крупного рогатого скота в зонах благополучных и неблагополучных по бруцеллезу // Сб. науч. тр. ЛВИ, 1982. Вып. №72. - 56-60.

7. Патент RU 2133470 С, G01N 33/569, A61K 39/10, опубл. 20.07.1999.

8. Патент RU 2085212 C, A61K 39/10, G01N 33/569, C12N 1/20, опубл. 20.07.1999.

9. Патент RU №2268748, C2, A61K 39/40, C12N 1/20, G01N 33/531, опубл. 27.01.2006.

10. Ременцова М.М., Нифантьев В.М. Значение L-форм бруцелл в эпизоотическом процессе // Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организация мед. помощи больным: тез. докл. Всесоюзной конференции. - Москва. 1989. - С.93-94.

11. Триленко П.А. МВБ и L-формы бруцелл // ЛВИ. - 19 71. Вып. №32. - С.35.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, иммунологии, биотехнологии, а именно к технологии получения антигена для диагностики бруцеллеза. Способ получения бруцеллезного L-антигена осуществляют следующим образом. Культивируют штамм Brucella abortus 19 в L-форме на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночного глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5% агара) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл при 37-38°C в течение 4-5 суток. Затем полученную в L-форме культуру эмульгируют 0,5% фенолизированным физиологическим раствором, инактивируют взвесь при температуре 85-90°C в течение 60 минут, центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 минут и устанавливают концентрацию бруцелл 50-60 млрд м.к., полученный антиген титруют, стандартизируют по специфичности и активности. Используют для реакции агглютинации в серологической диагностике бруцеллеза. Изобретение позволяет повысить эффективность и достоверность диагностики бруцеллеза на 20-25%. Изобретение может быть использовано для диагностики бруцеллеза у животных-бруцеллоносителей с персистенцией измененных L-форм возбудителя. 4 табл., 3 пр.

Способ получения бруцеллезного L-антигена, включающий культивирование штамма Brucella abortus 19 в L-форме на плотной питательной среде, приготовленной на основе мясо-пептонного печеночного глюкозо-глицеринового агара (1,3-1,5% агара) с добавлением 10-15% нормальной лошадиной сыворотки и стрептомицина в дозе 2,5-5,0 ЕД/мл при 37-38°C в течение 4-5 суток, инактивации при температуре 85-90°C в течение 60 мин, отличающийся тем, что полученную в L-форме культуру эмульгируют 0,5%-ным фенолизированным физиологическим раствором, центрифугируют при 3000-5000 об/мин в течение 15-20 мин и устанавливают концентрацию бруцелл 50-60 млрд м.к., полученный антиген титруют, стандартизируют по специфичности и активности и используют для реакции агглютинации в серологической диагностике бруцеллеза.