АМИНОПРОИЗВОДНЫЕ АДАМАНТАНА, ОБЛАДАЮЩИЕ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСА ГРИППА Российский патент 2010 года по МПК C07D295/96 C07D295/08 C07C211/41 C07C251/44 A61P31/16 

Изобретение относится к области биологически активных соединений, медицины, в частности вирусологии и химиотерапии вирусных инфекций, и может быть использовано для подавления размножения вирусов гриппа и редукции вызываемого ими заболевания.

Известен гидрохлорид 1-аминометил-а-метиладамантана (ремантадин) [1, 2], эффективно подавляющий репродукцию вирусов гриппа А и использующийся в ряде стран мира как средство лечения и профилактики гриппа. Недостатком ремантадина является относительно невысокая активность [3].

Более широкий диапазон нетоксичных концентраций (дозировок) с противовирусным действием имеет гидрохлорид 1-аминоадамантана (амантадин) [4], (принятый за прототип), также использующийся как лекарственный противовирусный препарат. Недостатком амантадина является выраженное побочное действие на ЦНС и сниженная в отдельных случаях активность [3].

Задачей изобретения является расширение ассортимента средств, обладающих противовирусным действием.

Поставленная задача достигается применением аминопроизводных адамантанового ряда общей формулы,

где R=OH, R₁=R₂=R₃=H, R₄=C₂H₅, X=Cl, n=1 (I);

R=Br, R₁=R₂=R₃=H, R₄=C₂H₅, X=Br, n=1 (II);

R=OH, R₁=R₂=H, R₃+R₄=-СН₂СН₂СН₂СН₂-, Х=Cl, n=1 (III);

R=Br, R₁=R₂=H, R₃+R₄=-CH₂CH₂CH₂CH₂-, X=Br, n=1 (IV);

R=OH, R₁=R₂=CH₃, R₃=R₄=H, X=Cl, n=1 (V);

R=СН₃, R₁=-CH₂OH, R₂=R₃=R₄=H, X=Cl, n=1 (VI);

R=R₁=R₂=R₃=H, R₄=-СН₂СН₂NH₂, Х=Cl, n=2 (VII),

обладающих активностью в отношении репродукции вируса гриппа.

Авторами обнаружено неочевидное свойство, позволяющее применить указанные аминопроизводные адамантана в качестве ингибиторов репродукции вируса гриппа. Технический результат предлагаемого изобретения - новые химические соединения с высоким индексом селективности противовирусного действия. В патентной и научно-технической литературе информация о заявляемых соединениях и их биологической активности отсутствует.

Раскрытие изобретения. Восстановлением 1-гидрокси-3-ацетиламиноадамантана получают гидрохлорид 3-N-этиламино-1-гидроксиадамантана. Взаимодействие 3-N-этиламино-1-гидроксиадамантана с бромистоводородной кислотой дает гидробромид 1-бром-3-N-этиламиноадамантана. Восстановлением N-(1-гидрокси-3-адамантил)-γ-бутиролактама алюмогидридом лития синтезирован N-(1-гидрокси-3-адамантил)пирролидин, выделенный в виде гидрохлорида. Взаимодействием N-(1-гидрокси-3-адамантил)пирролидина с бромистым тионилом получен N-(1-бром-3-адамантил)пирролидина гидробромид. Щелочным гидролизом 1-ацетиламино-3,5-диметил-7-адамантанола и 1-ацетил амино-3-ацетоксиметил-5-метиладамантана получены соответствующие 1-амино-3,5-диметил-7-адамантанола гидрохлорид и 1-амино-3-гидроксиметил-5-метиладамантана гидрохлорид. N-(1-Адамантил)этилендиамин синтезирован взаимодействием 1-бромадамантана с этилендиамином и последующим выделением продукта в виде дигидрохлорида.

Пример 1

3-N-Этиламино-1-гидроксиадамантана гидрохлорид (соединение I):

К суспензии 0.13 моля алюмогидрида лития в 50 мл тетрагидрофурана прибавляют 0,016 моля 1-гидрокси-3-ацетиламиноадамантана. Реакционную смесь кипятят при перемешивании в течение 20 ч. Затем прибавляют последовательно 5 мл воды, 5 мл 40%-ного раствора едкого натра, затем 15 мл воды. Раствор 1-гидрокси-3-N-этиламиноадамантана в тетрагидрофуране отделяют от неорганических солей, растворитель отгоняют, твердый остаток растворяют в бензоле и пропускают сухой хлористый водород. Осадок отфильтровывают, сушат и перекристаллизовывают из изопропилового спирта.

Выход 86%, Т. пл. 243-245°С.

ИК спектр, ν, см^-1: 3463 (NH), 3204 (ОН), 2930 (CH, Ad), 2862 (NH), 2463 (NH), 1627 (NH), 1581 (NH), 1350 (ОН), 1126 (C-N).

Найдено, %: С 61,90; Н 9,40; N 5,92. Cl₂H₂₁NO·HCl. Вычислено, %: С 62,19; Н 9,57; N6,04.

Масс-спектр (ЭИ): m/z 195 (11%) [M]+, 180 (8%), 151 (7%), 138 (100%), 122 (27%).

Пример 2

1-Бром-3-N-этиламиноадамантана гидробромид (соединение II).

1-Гидрокси-3-N-этиламиноадамантан в количестве 0,014 моля растворяют в 10 мл 63%-ной бромистоводородной кислоты и оставляют при комнатной температуре. Через 48 часов выпадает гидробромид 1-бром-3-N-этиламиноадамантана. Осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из изопропилового спирта. Выход 83%, Т.пл. 275-278°С.

ИК спектр, ν, см^-1: 3404 (NH), 2930 (CH, Ad), 2817 (NH), 2478 (NH), 1311, 1164, 1076, 821.

Масс-спектр (ЭИ): m/z 257(1%) [М]⁺, 178(100%) [M-Br]⁺, 122(66%).

Найдено, %: С 42,10, Н 6,34, N 4,33. C₁₂H₂₀BrN HBr. Вычислено, %: С 42,50,

Н 6,24, N4,13.

Пример 3

N-(1-Гидрокси-3-адамантил)пирролидина гидрохлорид (соединение III)

К суспензии 0,084 моля алюмогидрида лития в 50 мл тетрагидрофурана прикалывают раствор 0,017 моля N-гидрокси-3-адамантил)-γ-бутиролактама в 100 мл тетрагидрофурана. Кипятят при перемешивании 7 ч. Прибавляют последовательно 3 мл воды, 3 мл 40% раствора гидрооксида натрия, 9 мл воды, отделяют раствор N-гидрокси-3-адамантил)пирролидина в тетрагидрофуране от неорганических солей, растворитель отгоняют, твердый остаток растворяют в сухом бензоле, через бензольный раствор пропускают ток сухого хлористого водорода. Выпавший гидрохлорид N-гидрокси-3-адамантил)пирролидина фильтруют, перекристаллизовывают из изопропилового спирта. Выход 88%, Т.пл.=240-242°С.

ИК-спектр (в вазел. масле), ν, см _1: 3480, 2980, 2670, 1420. Масс-спектр (ЭИ): m/z 221(21%) [M]+, 204 (5%), 178 (4%), 164 (100%), 148 (32%), 136 (6%).

Найдено, %: С 65,43, Н 9,18, N 5,23. C₄H₂₃NO·HCl. Вычислено, %: С 65,23, Н 9,38, N5,43.

Пример 4

N-(1-Бром-3-адамантил)пирролидина гидробромид (соединение IV)

К 0,019 моль гидрохлорида N-(1-гидрокси-3-адамантил)пирролидина медленно прибавляют 0,051 моль бромистого тионила. Выдерживают при 20-25°С в течение 2 часов. Затем при охлаждении прибавляют 10 мл изопропилового спирта для разложения избытка бромистого тионила. Кристаллический осадок фильтруют, перекристаллизовывают из воды, затем из изопропилового спирта.

Выход 50%, Т.пл.=260-263°С.

ИК-спектр (KBr), ν, см^-1: 2933, 2565, 1461, 826.

Масс-спектр (ЭИ): m/z 284(1%), 204 (100%), 148 (59%).

Найдено, %: С 45,90, Н 6,34, N 3,73. C₁₄H₂₂BrNHBr. Вычислено, %: С 46,05, Н 6,35, N 3,84.

Пример 5

1-Амино-3,5-диметил-7-адамантанола гидрохлорид (соединение V).

Смесь из 0.03 моля 1-ацетиламино-3,5-диметиладамантанола-7, 0.09 моля гидроокиси калия, 2 мл воды и 17 мл этиленгликоля кипятят 40 часов. Реакционную массу выливают в 200 мл воды, экстрагируют бутанолом. Экстракт промывают 10 мл воды, упаривают до объема 30 мл, добавляют соляную кислоту до сильнокислой реакции, гидрохлорид 1-амино-3,5-диметил-7-адамантанола экстрагируют разбавленной соляной кислотой (1:10). Водную фазу доводят до рН 10 40%-ным раствором гидроокиси натрия, выделившийся амин экстрагируют бутанолом, экстракт промывают водой, упаривают до объема 15 мл и насыщают газообразным хлористым водородом. Затем добавляют 15 мл ацетона, выпавший продукт отфильтровывают и промывают ацетоном.

Выход 87%, Т.пл.>300°С.

ИК-спектр (KBr), ν, см^-1: 3313 (ОН), 2644 (NH), 2073 (NH), 1523 (NH), 1336 (ОН), 1203 (NH), 624.

Масс-спектр (ЭИ): m/z 195(8%) [М]+, 162 (4%), 138 (3%), 124 (100%). Найдено, %: С 61,60, Н 9,24, N 5,73. C₁₂H₂₁NO·HCl. Вычислено, %: С 62,19, Н 9,57, N6,04.

Пример 6

1-Дмино-3-гидроксиметил-5-метиладамантана гидрохлорид (соединение VI).

Смесь 0.05 моль 1-ацетиламино-3-ацетоксиметил-5-метиладамантана, 0.1 моля гидроокиси натрия, 30 мл этиленгликоля и 5 мл воды кипятят в течение 20 ч. Затем реакционную массу выливают в 200 мл воды и экстрагируют бензолом. Бензольный раствор сушат сульфатом натрия, отделяют от осушителя и насыщают сухим хлористым водородом. Осадок отфильтровывают, сушат и перекристаллизовывают из изопропилового спирта.

Выход 69%, Т.пл.>300°C.

ИК-спектр (KBr), ν, см^-1: 3446,2951 (СН, Ad). 2853, 2080, 1385, 1036. Масс-спектр (ЭИ): m/z 195 (17%), 178 (4%), 164 (80%), 138 (38%), 108 (100%).

Найдено, %: С 61,61, Н 9,34, N 5,79. C₁₂H₂₁NO·HCl. Вычислено, %: С 62,19, Н 9,57, N 6,04.

Пример 7

N-(1-Адамантил)этилендиамин дигидрохлорид (соединение VII):

Смесь из 0.056 моля 1-бромадамантана, 50 мл этилендиамина и 5 мл воды кипятят в течение 5 ч до полного растворения 1-бромадамантана. Затем реакционную массу охлаждают, в колбу добавляют 20 мл бензола и 40%-ный раствор едкого натра до полного растворения осадка. После этого органический слой отделяют, промывают водой и концентрированной соляной кислотой. Солянокислый раствор подщелачивают до рН 12. Выпавший осадок экстрагируют бензолом. Бензольные вытяжки сушат сульфатом натрия и насыщают хлористым водородом. Осадок отфильтровывают и сушат.

Выход 83%, Т.пл. 273-275°С.

ИК спектр, ν, см^-1: 3420 (NH); 2900 (СН, Ad); 2840 (NH₂ ⁺), 1610 (NH⁺+NH₂ ⁺; 1450 (СН). 1070 (C-N).

Найдено, %: С 73,89; Н 11,06; N 13,81. C₁₂H₂₂N₂. Вычислено, %: С 74,17; Н 11,41; N14,42.

Масс-спектр (ЭИ): m/z 194 (1%) [M]⁺, 177 (2%), 164 (38%) [M-CH₂NH₂]+, 151(3%), 135(100%) [Ad]⁺.

Пример 8

Исследование токсических свойств заявляемых соединений.

Токсические свойства определяют по способности вызывать цитодеструктивные изменения клеток спустя 72 ч инкубации. Монослойные культуры клеток первично-трипсинизированных фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) отмывают от ростовой среды и наносят разведения аминопроизводных адамантана на среде поддержки (среда 199) с концентрацией 800 мкг/мл и менее. По истечении указанного срока неокрашенные культуры просматривают при малом увеличении микроскопа (объектив х10). Максимальной переносимой концентрацией (МПК) принимают наивысшую концентрацию вещества, не вызывающую указанных изменений. Устанавливают, что соединения I, IV и V не обладают способностью вызывать цитодеструкцию клеток в диапазоне концентраций от 400 мкг/мл и менее, соединения II и VII - в диапазоне концентраций 100 мкг/мл и ниже, соединение VI - в концентрации от 50 мкг/мл и ниже, соединение III - в концентрации от 12,5 мкг/мл и ниже.

Пример 9

Исследование противовирусной активности заявляемых соединений.

Исследование проводят методом редукции количества бляшек под агаровым покрытием. Монослойную культуру ФЭК, выращенную во флаконах, отмывают от ростовой среды, инфицируют различными разведениями вируса гриппа A/FPV/Rostock/34 (H7N1) в пределах 0,01-0,00001 БОЕ/клетка путем нанесения вируссодержащей суспензии в объеме 0,1 мл на 1 ч при 37°С. Затем жидкость удаляют и клетки покрывают расплавом питательного покрытия на основе концентрата среды 199 с добавлением 1% бактагара и 0,005% нейтрального красного (все реактивы Sigma) и различных концентраций исследуемых соединений. После застывания покрытия флаконы помещают в термостат на 36 ч и затем подсчитывают количество бляшек, видимых благодаря присутствию в покрытии витального красителя. На основе количества бляшек вычисляют титр вируса. Критерием противовирусного действия считают наличие различий в сравнении с контролем вируса. Вычисляют также концентрации 50 и 95% подавления размножения вируса (среднеэффективная и 95% эффективная концентрации, ЕС50 и ЕС95 соответственно) и отношения МПК/ЕС50 и МПК/ЕС95 (индекс селективности).

Полученные результаты приведены в таблице.

Противовирусные свойства синтезированных веществ в отношении вируса гриппа A/FPV/Rostock (H7N1)

Как видно из данных таблицы, все исследованные соединения эффективно подавляют размножение вируса гриппа в культуре клеток. Наиболее широкий диапазон нетоксичных эффективных концентраций имеет соединение VII (отношения МПК/EC₅₀ и МПК/ЕС₉₅=385,8 и 18,5 соответственно). Несколько менее он выражен у соединений II (отношения МПК/ЕС₅₀ и МПК/ЕС₉₅=84,2 и 20,1 соответственно) и I (отношения МПК/ЕС₅₀ и МПК/EC₉₅=27,4 и 13,9 соответственно). Все заявляемые соединения превосходят препарат сравнения (амантадин) по величине отношения МПК/ЕС₉₅ (индекса селективности), а соединение I - также и по величине отношения МПК/EC₅₀.

Таким образом, заявляемое решение позволяет решить поставленную задачу. При использовании новых аминопроизводных адамантанового ряда удается получить высокую селективность противовирусного действия в отношении вируса гриппа. Использованный при выполнении исследований вирус гриппа A/FPV/Rostock (H7N1) является модельным представителем вирусов рода Influenzavirus А при изучении антивирусных свойств синтетических и природных соединений [5], т.е. наличие ингибирующих свойств в отношении репродукции данного вируса подразумевает, что спектр активности исследуемого вещества распространяется на все вирусы гриппа А.

Указанное свойство предполагает использование заявляемых соединений для лечения и профилактики заболевания, вызываемого в том числе высокопатогенными вирусами гриппа птиц А (H7N1) и A (H5N1).

Грипп наиболее опасен в эпидемическом отношении среди инфекций, вызываемых РНК-геномными вирусами. В России ежегодно регистрируется более 7 млн. случаев гриппозной инфекции, что составляет около 20% в структуре инфекционных и паразитических болезней населения. Особенностью вируса гриппа (особенно гриппа А) является способность быстрого возникновения его новых разновидностей за счет антигенной изменчивости. Этим обусловлены сложности в разработке противогриппозных вакцин, а также появление резистентных к имеющимся химиопрепаратам штаммов вируса гриппа. Вирусы гриппа типа А могут инфицировать не только людей, но и некоторые виды животных и птиц, включая кур, уток, свиней, лошадей, хорьков, тюленей и китов. Наряду с циркулирующими в человеческой популяции серотипами вируса гриппа А (H3N2 и H1N1) серьезные опасения вызывают вирусы гриппа птиц, являющиеся наиболее патогенными. Возбудители, вызывающие высокопатогенный птичий грипп, - вирусы подтипов гемагглютинина Н5 и Н7. Так, на сегодняшний день вирус птичьего гриппа A(H5N1) вызывает наибольшее количество случаев тяжелейшего заболевания птиц с летальным исходом и потенциально опасен для людей - периодически имеют место вспышки заболевания, в основном у обслуживающего персонала птицеводческих хозяйств и лиц, тесно контактирующих с домашней птицей, в том числе со смертельным исходом.

Высокопатогенный птичий грипп - очень контагиозное заболевание, которое может привести к 100% падежу поголовья. Так, в 1983-1984 г.г. в США в результате вспышки птичьего гриппа было уничтожено 17 млн птиц, а экономический ущерб составил 65 млн долларов. В 1999-2001 г.г. в Италии распространение заболевания, вызванного вирусом птичьего гриппа A(H7N1), привело к уничтожению 13 млн птиц. Увеличение случаев заболевания птичьим гриппом A (H5N1) в Юго-Восточной Азии и других географических регионах, в том числе и на территории Российской Федерации, а также возможность появления у этого возбудителя способности распространяться в человеческой популяции респираторным путем (передача возбудителя от человека к человеку) свидетельствуют об опасности возникновения пандемической разновидности этого вируса.

Кроме того, вакцинация против высокопатогенного гриппа А (H5N1) и A(H7N1) несет огромную опасность распространения заболевания в другие хозяйства из-за неполного подавления инфекции. В связи с этим многие страны ввели запрет на вакцинацию против птичьего гриппа.

Поэтому единственным средством борьбы с этими возбудителями является создание высокоэффективных химиотерапевтических препаратов, обладающих высокой активностью, биодоступностью и низкой токсичностью.

Идентичность вирусов гриппа птиц А (H5N1) и A (H7N1) по признакам принадлежности к одному семейству и роду вирусов, а также вызываемому заболеванию, определяет тот факт, что препараты, представленные производными ряда адамантана, эффективные для лечения инфекций, вызванных вирусом гриппа А, в том числе А (H7N1), эффективны также и в отношении вируса А(H5N1) [6]. Как показано на примере исследования амантадина и ремантадина, в спектре противовирусного действия противогриппозных препаратов на основе производных адамантана находятся большинство штаммов вируса гриппа А человека, в том числе современные вирусы гриппа A(H3N2) и A (H1N1) [7-9].

Изобретение может быть использовано в медицине и ветеринарии. Для выработки окончательных рекомендаций по применению заявляемых аминопроизводных адамантана с целью лечения и профилактики гриппа, необходимы изучение безвредности, разработка лекарственной формы, клинические (натурные) испытания и отработка оптимальных схем применения.

Литература

1. Prichard W.W. Adamantanes and tricyclo[4.3.1.13,8]undecanes. Пат. 3,352,912 USA. C07D 295/00 (20060101); C07D 295/03 (20060101); C07C 49/00 (20060101); C07C 49/323 (20060101).

2. Prichard W. W. Pharmaceutical compositions and methods of controlling influenza A virus infection utilizing substituted adamantanes and tricycio[4.3.1.13'8]uridecanes. Пат.3,592,934 USA. C07D 295/03 (20060101); C07D 295/00 (20060101).

3. Бореко Е.И., Павлова Н.И. Амантадин и ремантадин в профилактике и лечении гриппа. Мед. новости. - 1999. - №3(47). - С.20-25.

4. Davies W.L. et al. Antiviral activity of 1-adamantanamine (amantadine). Science, 1964, V. 144, P. 862-863.

5. Вотяков В.И., Бореко Е.И., Владыко Г. В. и др. Первичное изучение антивирусных свойств синтетических и природных соединений. Методич. рекомендации. Утв. УМС МЗ СССР 28.05.86 г. - Минск, 1986, 26 с.

6. Львов Д.К., Федякина И. Т., Щелканов М.Ю., Прилипов А.Г., Дерябин П.Г., Галегов Г.А. Действие in vitro противовирусных препаратов на репродукцию высокопатогенных штаммов вируса гриппа А (H5N1), вызвавших эпизоотию среди домашних птиц летом 2005 г. Вопр. вирусол., 2006, т.51, « 2, С.20-22.

7. Grunert R.R., Hoffmann С.Е. Sensitivity of influenza A/New Jersey/8/76 (Hsw1N1) virus to amantadine HC1. J. Inf. Dis., 1977, V. 136, No 2, P. 297-300.

8. Oxford J.S., Schild G.C. Inhibition of swine influenza virus A/New Jersey/76 (Hsw1N1) multiplication and polypeptide synthesis by amantadine. FEMS Microbiol. Letters, 1977, 1, P. 223-226.

9. Ротонов М., Гребенникова Т.В., Бурцева Е.И., Шевченко Е.С. Молекулярно-генетический анализ эпидемических штаммов вируса гриппа А, характеризующихся различной чувствительностью к римантадину, на основе нуклеотидной последовательности М2 белка. Клин. микробиол. антимикроб. химиотер., 2007, Т. 9, №4, С.369-374.

Изобретение относится к средству, обладающему противовирусной активностью в отношении вируса гриппа, представляющему собой аминопроизводное адамантанового ряда общей формулы (1),

где R=OH, R₁=R₂=R₃=H, R₄=C₂H₅, X=Cl, n=1 (I);

R=Br, R₁=R₂=R₃=H, R₄=C₂H₅, X=Br, n=1 (II);

R=OH, R₁=R₂=H, R₃+R₄=-СН₂СН₂СН₂СН₂-, Х=Cl, n=1 (III);

R=Br, R₁=R₂=H, R₃+R₄=-CH₂CH₂CH₂CH₂-, X=Br, n=1 (IV);

R=OH, R₁=R₂=CH₃, R₃=R₄=H, X=Cl, n=1 (V);

R=СН₃, R₁=-CH₂OH, R₂=R₃=R₄=H, X=Cl, n=1 (VI).

1 табл.

Средство, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гриппа, представляющее собой аминопроизводное адамантанового ряда общей формулы (1),

где R=OH, R₁=R₂=R₃=H, R₄=C₂H₅, X=Cl, n=1 (I);
R=Br, R₁=R₂=R₃=H, R₄=C₂H₅, X=Br, n=1 (II);
R=OH, R₁=R₂=H, R₃+R₄=-СН₂СН₂СН₂СН₂-, Х=Cl, n=1 (III);
R=Br, R₁=R₂=H, R₃+R₄=-CH₂CH₂CH₂CH₂-, X=Br, n=1 (IV);
R=OH, R₁=R₂=CH₃, R₃=R₄=H, X=Cl, n=1 (V);
R=СН₃, R₁=-CH₂OH, R₂=R₃=R₄=H, X=Cl, n=1 (VI).