СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕОГЛИКАНА Российский патент 2010 года по МПК C07K1/12 C07K14/435 A61P19/00 

Область техники

Настоящее изобретение касается способа получения протеогликана, который может быть использован как материал для получения лекарственных средств, материалов медицинского назначения, косметики, продуктов питания, промышленных изделий и так далее, включающего стадии его выделения из биологического образца, содержащего протеогликан, например хрящевой ткани рыбы, моллюска, птицы и млекопитающего, и получения его оттуда.

Протеогликан - это общее название, относящееся к гликопротеину с очень сложными и разнообразными типами структуры и обычно состоящему из одного корового белка с несколькими - несколькими десятками ковалентно присоединенных линейных полисахаридных цепей. Наиболее типичной полисахаридной цепью, входящей в состав протеогликана из хрящевой ткани, является хондроитин сульфат.

Хондроитин сульфат является компонентом, привлекающим внимание в промышленности в свете высокой применимости, как имеющий хорошие увлажняющие свойства, биосовместимость или смазывающие свойства, и разработано множество способов для эффективного получения и приготовления хондроитин сульфата из природных источников.

В хрящевой ткани хондроитин сульфат сам по себе не представлен. Вернее, он представлен в комплексной форме с белком, то есть в форме протеогликана. При этом выделение протеогликана без каких-либо изменений часто затруднено из-за сложной структуры гликопротеинового комплекса. По этой причине обычно использовали способ выделения только хондроитин сульфата после полного разрушения части коревого белка гликопротеина. Результатом такого способа выделения является мукополисахарид, такой как хондроитин сульфат и так далее.

Между тем, также были попытки получения, приготовления и использования собственно протеингликана вместо хондроитин сульфата. Особенно в хрящевой ткани рыбы, птицы и млекопитающего содержится протеогликан с хондроитин сульфатом в качестве основной полисахаридной цепи. Более того, в свете факта, что хрящевая ткань обычно выбрасывается как отходы, было предложено несколько способов получения протеогликана из хрящевой ткани, также в качестве эффективного пути использования промышленных отходов.

Например, сообщалось о способах выделения протеогликана из хрящей носа лосося с использованием гуанидиний гидрохлорида (Патентный документ 1) и с использованием уксусной кислоты (Патентный документ 2). Однако, к сожалению, нельзя сказать, что такие традиционные способы достигают уровня коммерческой применимости, так как стоимость выделения и очистки весьма высока.

Патентный документ 1: Выложенная заявка на патент Японии №2001-172296

Патентный документ 2: JP-A №2002-69097

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задача, решаемая в настоящем изобретении

Целью настоящего изобретения является разработка малозатратного способа получения протеогликана для перорального приема внутрь из рыбы, моллюска, птицы или млекопитающего, особенно из их частей, являющихся отходами.

Способы решения задач

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что используя щелочной раствор, который считался неподходящим для выделения и приготовления белка или белкового комплекса, в определенных условиях, протеогликан, являющийся гликопротеиновым комплексом, можно успешно выделять из хрящевой ткани и других биологических образцов, содержащих протеогликан, и поэтому осуществили каждое из изобретений, описанных ниже.

(1) Способ получения протеогликана, включающий стадии иммерсии биологического образца, содержащего протеогликан, в 0,0025-0,1 н. растворе щелочи и получение раствора после иммерсии.

(2) Способ, описанный выше в (1), который дополнительно включает стадию выделения протеогликана из полученного раствора.

(3) Способ, описанный выше в (1) или (2), где щелочной раствор является раствором соли щелочного металла.

(4) Способ, описанный выше в любом из (1)-(3), где биологический образец, содержащий протеогликан, представляет собой хрящевую ткань, мышечные волокна или кожу рыбы, моллюска, птицы или млекопитающего.

(5) Способ, описанный выше в (4), где биологический образец, содержащий протеогликан, представляет собой хрящевую ткань рыбы, птицы или млекопитающего.

Эффект изобретения

По сравнению с обычными способами экстракции, согласно способу по настоящему изобретению протеогликан может быть легко извлечен в неизмененной и нераспавшейся форме в течение короткого отрезка времени, тем самым достигается существенное снижение стоимости производства протеогликана. Более того, протеогликан, очень полезный в промышленности, может быть получен из частей рыбы, птицы или млекопитающего, являющихся отходами и преимущественно выбрасывающихся, таким образом содействуя эффективному использованию промышленных отходов и снижению объема промышленных отходов как таковых.

Более того, по настоящему изобретению не обязательно должен быть добавлен ингибитор протеолитических ферментов для инактивации протеолитических ферментов, содержащихся в биологических тканях. Поскольку такой ингибитор не всегда эффективен для каждого протеолитического фермента, и многие ингибиторы сами по себе вредны для человека, нежелательно использовать ингибитор для производства протеогликана в качестве сырья для пищевых продуктов. В этой связи, поскольку согласно настоящему изобретению ингибитор не требуется, вышеупомянутых проблем можно избежать.

Краткое описание чертежей

Чертеж. Диаграмма, показывающая количество протеогликана, полученного с использованием гидроксида натрия и уксусной кислоты.

Лучший способ осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к способу экстракции и получения протеогликана, содержащего белки, которые обычно нестабильны при нагревании и в щелочи, основанному на идее использования щелочного раствора, хотя это несомненно идет вразрез с общепринятым мнением.

Протеогликан является комплексным соединением из сахара и белка. Однако поскольку соединение полисахаридной цепи и корового белка имеет слабую силу связывания, они имеют тенденцию к легкому отделению друг от друга. По этой причине выделение или очистка протеогликана являются чрезвычайно тяжелыми сами по себе, и требуется более аккуратный подход по сравнению с коллагеном, который состоит только из белка, или хондроитин сульфатом, который состоит только из углевода. Таким образом, обычные способы не подходят для массового производства протеогликана из-за сложных или ручных действий и так далее.

В дополнение к вышеупомянутому, белки обычно нестабильны при нагреве, действии кислоты, и особенно щелочи, таким образом, они легко денатурируемы и разрушаемы. Известен способ разрушения белков с активным использованием щелочи, основанный на таких свойствах белков. Однако не было известно, что протеогликан, который является гликопротеиновым комплексом, может быть экстрагирован щелочью, поскольку его белковые части оказываются защищены от разрушения.

Способ по настоящему изобретению может быть применен к биологическому образцу, содержащему протеогликан, такому как хрящевая ткань, мышечные волокна или кожа рыбы, моллюска, птицы или млекопитающего. Преимущественно, однако, из вышеуказанного он применим к хрящевой ткани. Хрящевая ткань, используемая в настоящем изобретении, может быть хрящевой тканью из рыбы, птицы или млекопитающего, особенно части, являющиеся отходами. Хрящевая ткань, описанная в настоящем изобретении, означает собственно хрящевую ткань, или все другие ткани, содержащие область, окружающую хрящевую ткань, такие как кость, мышечные волокна, кожа и так далее.

По настоящему изобретению преимущественно используется хрящевая ткань носа лосося, средний вес которой в голове лосося составляет около 6%, и обычно называемая «hiz». Когда лососи пойманы в море вблизи Хоккайдо (большинство из них являются лососями, относящимися к Oncorhynchus keta) и разделаны, их головные части обычно считаются отходами. Хотя некоторые из отделенных головных частей используются для производства рыбного порошка, в большинстве своем они выбрасываются как промышленные отходы. Таким образом, «hiz» может быть удобно и стабильно получен из таких отходов по низкой цене.

Согласно настоящему изобретению в дополнение к вышеупомянутому «hiz» может быть использована хрящевая ткань из таких рыб, как скат и акула, и так далее, хрящевая ткань птицы, такой как цыпленок, и хрящевая ткань млекопитающих, такая как хрящи шей или бронхов коровы и хрящ кита, и так далее. К тому же известно, что протеогликан также находится в эпидермисе моллюсков, таких как кальмар или осьминог, кожа таких моллюсков также может быть использована по настоящему изобретению. Особенно для эпидермиса осьминога, сообщалось, что найден хондроитин-белковый комплекс, который практически свободен от сульфатов, и этот хондроитин составляет до 70% и более всех мукополисахаридов, найденных в эпидермисе осьминога (Suyama et al., "Use of a squid", опубликовано в ноябре 1980, стр.93, Kouseisha). Таким образом, в настоящем изобретении кожа осьминога удобна в качестве примера биологического образца, содержащего протегликан. Большинство описанных выше биологических образцов, содержащих протеогликан, являются промышленными отходами, вследствие чего могут быть легко получены. Эти материалы предпочтительно нарезаются до как можно более мелкого размера для увеличения площади их поверхности для экстракции большего количества протеогликана перед их иммерсией в щелочном растворе как описано ниже.

Что касается щелочного раствора по настоящему изобретению, то соответствующим образом может быть использован водный раствор, такой как водный раствор щелочного металла или его солей и водный раствор щелочноземельного металла или его солей. Впрочем, в виду эффективности экстракции протеогликана и удобства последующей обработки и так далее, предпочтительно используются водный раствор щелочного металла, а именно гидроксид натрия (NaOH), гидрокарбонат натрия, карбонат кальция и гидроксид калия. Наиболее предпочтительно использование гидроксида натрия.

Концентрация щелочного раствора составляет 0,0025-0,1 н., предпочтительно 0,01-0,05 н. Когда используется 0,0025-0,01 н. щелочной раствор, предпочтительнее проводить иммерсию в течение как минимум 9 часов. Далее, когда используется 0,01-0,05 н. щелочной раствор, предпочтительнее проводить иммерсию около 9 часов. Более того, когда используется 0,05-0,1 н. щелочной раствор, предпочтительнее проводить иммерсию 9 часов или менее. Более того, когда используется 0,01-0,1 н. щелочной раствор, предпочтительнее проводить иммерсию около 2 часов, чтобы могла быть ингибирована деградация корового белка протеогликана. В соответствии с такими условиями обработки протеогликан с более высоким молекулярным весом может быть получен и приготовлен.

Иммерсия хрящевой ткани в щелочном растворе проводится при температуре между 0°С и комнатной температурой, предпочтительнее между 0°С и 10°С, и наиболее предпочтительно между 0°С и 4°С. В частности, когда температура иммерсии установлена между 0°С и 4°С, протеогликан деградирован лишь слегка, таким образом, он может быть выделен как полимерный гликопротеиновый комплекс.

Иммерсия может проводиться с 2-15-кратным избытком щелочного раствора по весу, предпочтительно 4-12-кратным, наиболее предпочтительно 6-13-кратным по весу по сравнению с весом хрящевой ткани. Предпочтительно, иммерсия проводится при перемешивании миксером или мешалкой.

Экстракция протеогликана из хрящевой ткани может контролироваться путем определения и подсчета количества уроновой кислоты в соответствии с известным способом, таким как метод Galambos (John et el., ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, 1967, том 19, стр.119-132). Впрочем, другие известные способы могут быть также использованы для определения и отслеживания уроновой кислоты.

В щелочном растворе, полученном после прекращения иммерсии, после экстракции протеогликана содержится множество остаточных продуктов. Как таковые, они предпочтительно удаляются фильтрацией, центрифугированием или другими способами. Экстракт, содержащий протеогликан, может быть использован в качестве продукта сам по себе. Однако предпочтительнее его выделить и очистить соответствующим методом до степени чистоты, необходимой для его различного использования.

По настоящему изобретению необязательно требуется специальный способ очистки протеогликана. Однако упоминается центрифугирование как предпочтительный способ. Способом центрифугирования мелкие твердые частицы могут быть удобно отделены как осадок, а масляная фаза из сырьевого материала может быть удобно отделена как плавающая на поверхности примесь.

Кроме того, полученная после центрифугирования жидкая фаза, содержащая протеогликан, может быть дополнительно отфильтрована с помощью фильтровальной бумаги или устройства для разделения с ультрафильтрующей мембраной с подходящим отбрасываемым молекулярным весом и тому подобное. Для молекулярной массы исключаемого размера может использоваться диапазон от примерно 50000 Дальтон до 1000000 Дальтон. Для такого способа, при использовании фильтра с отбрасываемым молекулярным весом 500000 Дальтон или более, даже коллаген может быть удален из жидкой фазы, чтобы чистота протеогликана могла быть увеличена. Кроме того, проникновение через мембрану может быть облегчено уменьшением вязкости жидкой фазы при добавлении воды к жидкой фазе, содержащей протеогликан. Более того, путем повторения этой стадии может быть также удален запах рыбы, который слегка образуется в процессе.

Кроме того, при добавлении таким образом полученного концентрата к этанолу, насыщенному хлоридом натрия, может быть выделен протеогликан в гелеобразном состоянии. Такой гелеобразный протеогликан может быть превращен в твердый с использованием вакуумного лиофилизатора. Иначе он может быть высушен с использованием распылительной сушилки, что дает твердое вещество в форме порошка.

Ниже в этом документе настоящее изобретение описано более детально со ссылкой на последующие примеры. Однако настоящее изобретение не ограничивается ими.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Носовой хрящ, извлеченный из головной части лосося Oncorhynchus keta, который был заморожен и хранился при -40°С, был измельчен с использованием электрической мясорубки на маленькие рубленые кусочки. 200,00 г таких измельченных кусочков были использованы в качестве стартового материала. В 5-литровый экстракционный сосуд наливали 2397,60 г предварительно охлажденной до 0°С дистиллированной воды, и далее туда добавляли 2,40 г твердого гидроксида натрия, чтобы получить в итоге 2400,00 г водного раствора гидроксида натрия (0,025 н.). Вышеописанный стартовый материал был добавлен в этот экстракционный сосуд и проводилась иммерсия в течение 9 часов при перемешивании содержимого на мешалке.

После окончания иммерсии содержимое было перенесено в другой сосуд, поверх которого был помещен фильтр из нержавеющей стали (1 мм), чтобы экстракт, содержащий протеогликан, мог быть получен.

Экстракт был подвергнут центрифугированию на центрифуге (IWAKI CFS-400 тип) 20 минут при 3500 об/мин. Как результат, твердые частицы и масляная фаза были отделены, и жидкая фаза, содержащая протеогликан, была получена.

Далее, жидкая фаза была профильтрована через бумажный фильтр (произведено Advantec) с последующим добавлением дистиллированной воды объемом, в 6 раз превышающим объем фильтрата. Затем, с использованием мембраны PREP/SCALE TFF (отбрасываемый молекулярный вес 100000 Дальтон, произведено Millipore, Япония), отделение и концентрация были проведены одновременно.

Была взята проба полученного концентрата и использована для определения доли сухого вещества в растворе. Проба концентрата сушилась в сушильном шкафу (YAMATO DX401) при 105°С в течение 16 часов для полного испарения влаги. Тонкое взвешивание оставшегося сухого остатка было проведено с использованием цифровых весов (GF-400, произведено A&D Corp.). Как результат, было установлено, что из 200,00 г стартового материала было получено 6,64 г сухого вещества, что соответствует 3,32% стартового материала в пересчете.

Кроме того, количество аминокислот было определено при анализе концентрата на автоматическом аминокислотном анализаторе (L-8500 Amino Acid Analyzer, произведен Hitachi Ltd.) для определения количества коллагена, содержащегося в концентрате. Более того, по последующему методу Galambos было определено количество уроновой кислоты, чтобы посчитать количество протеогликана.

Более того, с помощью высокоскоростной жидкостной хроматографии (колонка TSK-GEL G4000PWXL, произведена Shimadzu Corporation) был определен молекулярный вес протеогликана.

В результате этих анализов было найдено, что сухой остаток содержит 25,0% белка, 21,5% зольных компонентов, 52,9% углеводов и 0,6% липидов. На основании описания Патентного документа 1 массовая доля корового белка в протеогликане составляет около 7,0%. Поскольку количество углеводов, полученное в настоящем опыте, было около 52,9%, предположено, что протеогликан по настоящему изобретению имеет чистоту около 57%. Кроме того, было показано, что молекулярный вес протеогликана составляет около 2200000 Дальтон.

Что касается рабочих процессов, описанных для приведенного выше примера, концентрация гидроксида натрия была изменена до 0,0025 н., 0,025 н. или 0,05 н. и 0,666 н. уксусная кислота была использована вместо гидроксида натрия для иммерсии и экстракции в течение 24 часов. Как результат, наблюдаемое изменение в выделенном количестве протеогликана (то есть количестве уроновой кислоты) в зависимости от промежутка времени показано на чертеже.

Пример 2

Носовой хрящ, извлеченный из головной части лосося Oncorhynchus keta, который был заморожен и хранился при -40°С, был измельчен с использованием электрической мясорубки на маленькие рубленые кусочки и проведена иммерсия в ацетоне, и носовой хрящ был обезвожен и обезжирен. 24,00 г обработанного носового хряща, после высушивания на воздухе или при пониженном давлении, было использовано в качестве стартового материала. В 5-литровый экстракционный сосуд наливали 2997,75 г предварительно охлажденной до 5°С дистиллированной воды и далее туда добавляли 2,25 г твердого гидроксида натрия, чтобы получить в итоге 3000,00 г водного раствора гидроксида натрия (0,02 н.). Вышеописанный стартовый материал (24,00 г) был добавлен в этот экстракционный сосуд и проводилась иммерсия в течение 9 часов при перемешивании содержимого на мешалке.

После окончания иммерсии содержимое было перенесено в другой сосуд, поверх которого был помещен фильтр из нержавеющей стали (1 мм), чтобы был убран носовой хрящ и мог быть получен экстракт, содержащий протеогликан.

Экстракт был подвергнут центрифугированию на центрифуге (Hitachi himacCF7D2 тип) 20 минут при 3000 об/мин. Как результат, твердые частицы и масляная фаза были отделены, и жидкая фаза, содержащая протеогликан, была получена.

Далее, жидкая фаза была профильтрована через бумажный фильтр (произведено Advantec) с последующим добавлением дистиллированной воды объемом, в 6 раз превышающим объем фильтрата. Затем, с использованием BIOMAX 100K POLYETHERSULFONE (отбрасываемый молекулярный вес 100000 Дальтон, произведено Millipore, Япония), отделение и концентрация были проведены одновременно.

Была взята проба полученного концентрата и использована для определения доли сухого вещества в растворе. Пробу концентрата сушили в сушильном шкафу (YАМАТО DX401) при 105°С в течение 16 часов для полного испарения влаги. Тонкое взвешивание оставшегося сухого остатка было проведено с использованием цифровых весов (GF-400, произведено A&D Corp.). Как результат, было установлено, что из 24,00 г стартового материала было получено 7,50 г сухого вещества, что соответствует 30,29% стартового материала в пересчете.

Кроме того, количество аминокислот было определено при анализе концентрата на автоматическом аминокислотном анализаторе (L-8500 Amino Acid Analyzer, произведен Hitachi Co. Ltd.) для определения количества коллагена, содержащегося в концентрате. Более того, по методу Galambos было определено количество уроновой кислоты, чтобы подсчитать количество протеогликана. Более того, с помощью высокоскоростной жидкостной хроматографии (колонка TSK-GEL G4000PWXL, произведена Shimadzu Corporation) был определен молекулярный вес протеогликана.

В результате этих анализов было найдено, что сухой остаток содержит 11,8% белка, 18,4% зольных компонентов, 67,8% углеводов и 0,0% липидов. На основании описания Патентного документа 1 массовая доля корового белка в протеогликане около 7,0%. Таким образом, предполагаемая чистота протеогликана по настоящему изобретению по подсчетам составила 91,1% (то есть (углеводы×0,07+липиды)/(углеводы+белки+липиды)×100=91,1%). Кроме того, было показано, что молекулярный вес протеогликана около 1200000 Дальтон.

Пример 3

Носовой хрящ, извлеченный из головной части лосося Oncorhynchus keta, который был заморожен и хранился при -40°С, был измельчен с использованием электрической мясорубки на маленькие рубленые кусочки, была проведена иммерсия в ацетоне, и носовой хрящ был обезвожен и обезжирен. 17,90 г обработанного носового хряща, после высушивания на воздухе или при пониженном давлении, было использовано в качестве стартового материала. В 5-литровый экстракционный сосуд наливали 2322,67 г предварительно охлажденной до 5°С дистиллированной воды и далее туда добавляли 2,33 г твердого гидроксида калия, чтобы получить в итоге 2325 г водного раствора гидроксида калия (0,018 н.). Вышеописанный стартовый материал (17,90 г) был добавлен в этот экстракционный сосуд, и проводилась иммерсия в течение 9 часов при перемешивании содержимого на мешалке.

После окончания иммерсии содержимое было перенесено в другой сосуд, поверх которого был помещен фильтр из нержавеющей стали (1 мм), чтобы носовой хрящ был убран и экстракт, содержащий протеогликан, мог быть получен.

Экстракт был подвергнут центрифугированию на центрифуге (Hitachi himacCF7D2 тип) 20 минут при 3000 об/мин. Как результат, твердые частицы и масляная фаза были отделены, и жидкая фаза, содержащая протеогликан, была получена.

Далее, жидкая фаза была профильтрована через бумажный фильтр (произведено Advantec) с последующим добавлением дистиллированной воды объемом, в 6 раз превышающим объем фильтрата. Затем, с использованием BIOMAX 100K POLYETHERSULFONE (отбрасываемый молекулярный вес 100000 Дальтон, произведено Millipore, Япония), отделение и концентрация были проведены одновременно.

Была взята проба полученного концентрата и использована для определения доли сухого вещества в растворе. Проба концентрата сушилась в сушильном шкафу (YAMATO DX401) при 105°С в течение 16 часов для полного испарения влаги. Тонкое взвешивание оставшегося сухого остатка было проведено с использованием цифровых весов (GF-400, произведено A&D Corp.). Как результат, было установлено, что из 17,90 г стартового материала было получено 5,29 г сухого вещества, что соответствует 29,61% стартового материала в пересчете.

Кроме того, количество аминокислот было определено при анализе концентрата на автоматическом аминокислотном анализаторе (L-8500 Amino Acid Analyzer, произведен Hitachi Co. Ltd.) для определения количества коллагена, содержащегося в концентрате. Кроме того, по методу Galambos было определено количество уроновой кислоты, чтобы посчитать количество протеогликана. Более того, с помощью высокоскоростной жидкостной хроматографии (колонка TSK-GEL G4000PWXL, произведена Shimadzu Corporation) был определен молекулярный вес протеогликана.

В результате этих анализов было найдено, что сухой остаток содержит 14,0% белка, 22,4% зольных компонентов, 63,6% углеводов и 0,0% липидов. На основании описания Патентного документа 1 массовая доля корового белка в протеогликане около 7,0%. Таким образом, предполагаемая чистота протеогликана по настоящему изобретению по подсчетам составила 87/7% (то есть (углеводы×0,07+липиды)/(углеводы+белки+липиды)×100=87,7%). Кроме того/ было показано, что молекулярный вес протеогликана около 1200000 Дальтон.

Пример 4

Хрящ, извлеченный из куриного киля, с которого вручную была убрана мышечная ткань, был измельчен с использованием электрической мясорубки на маленькие рубленые кусочки, проведена иммерсия в ацетоне, и хрящ из киля курицы был обезвожен и обезжирен. 44,40 г обработанного хряща, после высушивания на воздухе или при пониженном давлении, было использовано в качестве стартового материала. В 5-литровый экстракционный сосуд наливали 2997,75 г предварительно охлажденной до 5°С дистиллированной воды и далее туда добавляли 2,25 г твердого гидроксида натрия, чтобы получить в итоге 3000,00 г водного раствора гидроксида натрия (0,02 н.). Вышеописанный стартовый материал (44,40 г) был добавлен в этот экстракционный сосуд, и проводилась иммерсия в течение 9 часов при перемешивании содержимого на мешалке.

После окончания иммерсии содержимое было перенесено в другой сосуд, поверх которого был помещен фильтр из нержавеющей стали (1 мм), чтобы был убран хрящ и экстракт, содержащий протеогликан, мог быть получен.

Экстракт был подвергнут центрифугированию на центрифуге (Hitachi himacCF7D2 тип) 20 минут при 3000 об/мин. Как результат, твердые частицы и масляная фаза были отделены, и была получена жидкая фаза, содержащая протеогликан.

Далее, жидкая фаза была профильтрована через бумажный фильтр (произведено Advantec) с последующим добавлением дистиллированной воды объемом, в 6 раз превышающим объем фильтрата. Затем, с использованием BIOMAX 100K POLYETHERSULFONE (отбрасываемый молекулярный вес 100000 Дальтон, произведено Millipore, Япония), отделение и концентрация были проведены одновременно.

Проба полученного концентрата была взята и использована для определения доли сухого вещества в растворе. Проба концентрата сушилась в сушильном шкафу (YAMATO DX401) при 105°С в течение 16 часов для полного испарения влаги. Тонкое взвешивание оставшегося сухого остатка было проведено с использованием цифровых весов (GF-400, произведено A&D Corp.). Как результат, было установлено, что из 44,40 г стартового материала было получено 9,87 г сухого вещества, что соответствует 22,23% стартового материала в пересчете.

Кроме того, количество аминокислот было определено при анализе концентрата на автоматическом аминокислотном анализаторе (L-8500 Amino Acid Analyzer, произведен Hitachi Co. Ltd.) для определения количества коллагена, содержащегося в концентрате. Кроме того, по методу Galambos было определено количество уроновой кислоты, чтобы посчитать количество протеогликана. Более того, с помощью высокоскоростной жидкостной хроматографии (колонка TSK-GEL G4000PWXL, произведена Shimadzu Corporation) был определен молекулярный вес протеогликана.

В результате этих анализов было найдено, что сухой остаток содержит 31,3% белка, 16,9% зольных компонентов, 51,8% углеводов и 0,0% липидов. На основании описания Патентного документа 1 массовая доля корового белка в протеогликане около 7,0%. Таким образом, предполагаемая чистота протеогликана по настоящему изобретению по подсчетам составила 66,7% (то есть (углеводы×0,07+липиды)/(углеводы+белки+липиды)×100=66,7%). Кроме того, было показано, что молекулярный вес протеогликана около 920000 Дальтон (16%) и около 460000 Дальтон (84%).

Пример 5

Хрящ, вручную извлеченный из ската (Dipturus kwangtungensis), был измельчен с использованием электрической мясорубки на маленькие рубленые кусочки, проведена иммерсия в ацетоне, и хрящ был обезвожен и обезжирен. 12,00 г обработанного хряща, после высушивания на воздухе или при пониженном давлении, было использовано в качестве стартового материала. В 5-литровый экстракционный сосуд наливали 1678,74 г предварительно охлажденной до 5°С дистиллированной воды и далее туда добавляли 1,26 г твердого гидроксида натрия, чтобы получить в итоге 1680,00 г водного раствора гидроксида натрия (0,02 н.). Вышеописанный стартовый материал (12,00 г) был добавлен в этот экстракционный сосуд, и проводилась иммерсия в течение 9 часов при перемешивании содержимого на мешалке.

После окончания иммерсии содержимое было перенесено в другой сосуд, поверх которого был помещен фильтр из нержавеющей стали (1 мм), чтобы был убран носовой хрящ и экстракт, содержащий протеогликан, мог быть отделен.

Экстракт был подвергнут центрифугированию на центрифуге (Hitachi himacCF7D2 тип) 20 минут при 3000 об/мин. Как результат, твердые частицы и масляная фаза были отделены, и жидкая фаза, содержащая протеогликан, была получена.

Далее, жидкая фаза была профильтрована через бумажный фильтр (произведено Advantec) с последующим добавлением дистиллированной воды объемом, в 6 раз превышающим объем фильтрата. Затем, с использованием BIOMAX 100K POLYETHERSULFONE (отбрасываемый молекулярный вес 100000 Дальтон, произведено Millipore, Япония), отделение и концентрация были проведены одновременно.

Проба полученного концентрата была взята и использована для определения доли сухого вещества в растворе. Проба концентрата сушилась в сушильном шкафу (YAMATO DX401) при 105°С в течение 16 часов для полного испарения влаги. Тонкое взвешивание оставшегося сухого остатка было проведено с использованием цифровых весов (GF-400, произведено A&D Corp.). Как результат, было установлено, что из 12,00 г стартового материала было получено 2,15 г сухого вещества, что соответствует 17,92% стартового материала в пересчете.

Кроме того, количество аминокислот было определено при анализе концентрата на автоматическом аминокислотном анализаторе (L-8500 Amino Acid Analyzer, произведен Hitachi Co. Ltd.) для определения количества коллагена, содержащегося в концентрате. К тому же, по методу Galambos было определено количество уроновой кислоты, чтобы посчитать количество протеогликана. Более того, с помощью высокоскоростной жидкостной хроматографии (колонка TSK-GEL G4000PWXL, произведена Shimadzu Corporation) был определен молекулярный вес протеогликана.

В результате этих анализов было найдено, что сухой остаток содержит 43,5% белка, 19,5% зольных компонентов, 37,0% углеводов и 0,0% липидов. На основании описания Патентного документа 1 массовая доля корового белка в протеогликане около 7,0%. Таким образом, предполагаемая чистота протеогликана по настоящему изобретению по подсчетам составила 49,2% (то есть (углеводы×0,07+липиды)/(утлеводы+белки+липиды)×100=49,2%). Кроме того, было показано, что молекулярный вес протеогликана около 1700000 Дальтон.

Пример 6

Хрящ, извлеченный вручную из акулы, был измельчен с использованием электрической мясорубки на маленькие рубленые кусочки, проведена иммерсия в ацетоне, и хрящ был обезвожен и обезжирен. 12,00 г обработанного хряща, после высушивания на воздухе или при пониженном давлении, было использовано в качестве стартового материала. В 5-литровый экстракционный сосуд наливали 1678,74 г предварительно охлажденной до 5°С дистиллированной воды и далее туда добавляли 1,26 г твердого гидроксида натрия, чтобы получить в итоге 1680,00 г водного раствора гидроксида натрия (0,02 н.). Вышеописанный стартовый материал (12,00 г) был добавлен в этот экстракционный сосуд и проводилась иммерсия в течение 9 часов при перемешивании содержимого на мешалке.

После окончания иммерсии содержимое было перенесено в другой сосуд, поверх которого был помещен фильтр из нержавеющей стали (1 мм), чтобы носовой хрящ был убран и экстракт, содержащий протеогликан, мог быть отделен.

Экстракт был подвергнут центрифугированию на центрифуге (Hitachi himacCF7D2 тип) 20 минут при 3000 об/мин. Как результат, твердые частицы и масляная фаза были отделены, и жидкая фаза, содержащая протеогликан, была получена.

Далее, жидкая фаза была профильтрована через бумажный фильтр (произведено Advantec) с последующим добавлением дистиллированной воды объемом, в 6 раз превышающим объем фильтрата. Затем, с использованием BIOMAX 100K POLYETHERSULFONE (отбрасываемый молекулярный вес 100000 Дальтон, произведено Millipore, Япония), отделение и концентрация были проведены одновременно.

Проба полученного концентрата была взята и использована для определения доли сухого вещества в растворе. Проба концентрата сушилась в сушильном шкафу (YAMATO DX401) при 105°С в течение 16 часов для полного испарения влаги. Тонкое взвешивание оставшегося сухого остатка было проведено с использованием цифровых весов (GF-400, произведено A&D Corp.). Как результат, было установлено, что из 12,00 г стартового материала было получено 1,36 г сухого вещества, что соответствует 11,36% стартового материала в пересчете.

Кроме того, количество аминокислот было определено при анализе концентрата на автоматическом аминокислотном анализаторе (L-8500 Amino Acid Analyzer, произведен Hitachi Co. Ltd.) для определения количества коллагена, содержащегося в концентрате. Более того, по методу Galambos было определено количество уроновой кислоты, чтобы посчитать количество протеогликана. Более того, с помощью высокоскоростной жидкостной хроматографии (колонка TSK-GEL G4000PWXL, произведена Shimadzu Corporation) был определен молекулярный вес протеогликана.

В результате этих анализов было найдено, что сухой остаток содержит 37,8% белка, 27,4% зольных компонентов, 37,8% углеводов и 0,0% липидов. На основании описания Патентного документа 1 массовая доля корового белка в протеогликане около 7,0%. Таким образом, предполагаемая чистота протеогликана по настоящему изобретению по подсчетам составила 55,7% (то есть (углеводы×0,07+липиды)/(углеводы+белки+липиды)×100=55,7%). Кроме того, было показано, что молекулярный вес протеогликана около 1500000 Дальтон.

Пример 7

Кожа осьминога была вручную ободрана, проведена иммерсия в ацетоне, и она была обезвожена и обезжирена. Обработанная кожа, после высушивания на воздухе или при пониженном давлении, была использована в качестве стартового материала. После нарезки кожи ножницами на мелкие кусочки и измельчения в ступке высушенная кожа осьминога была приготовлена. В 10-литровый экстракционный сосуд наливали 5036,20 г предварительно охлажденной до 5°С дистиллированной воды и далее туда добавляли 3,80 г твердого гидроксида натрия, чтобы получить в итоге 5040 г водного раствора гидроксида натрия (0,02 н.). Вышеописанная высушенная кожа (33,70 г) была добавлена в этот экстракционный сосуд и проводилась иммерсия в течение 9 часов при перемешивании содержимого на мешалке.

После окончания иммерсии содержимое было перенесено в другой сосуд, поверх которого был помещен фильтр из нержавеющей стали (1 мм), чтобы кожа была убрана и мог быть отделен экстракт, содержащий протеогликан.

Экстракт был подвергнут центрифугированию на центрифуге (Hitachi himacCF7D2 тип) 20 минут при 3000 об/мин. Как результат, твердые частицы и масляная фаза были отделены, и жидкая фаза, содержащая протеогликан, была получена.

Далее, жидкая фаза была профильтрована через бумажный фильтр (произведено Advantec) с последующим добавлением дистиллированной воды объемом, в шесть раз превышающим объем фильтрата. Затем, с использованием BIOMAX 100K POLYETHERSULFONE (отбрасываемый молекулярный вес 100000 Дальтон, произведено Millipore, Япония), отделение и концентрация были проведены одновременно.

Проба полученного концентрата была взята и использована для определения доли сухого вещества в растворе. Пробу концентрата сушили в сушильном шкафу (Ямато DX401) при 105°С в течение 16 часов для полного испарения влаги. Тонкое взвешивание оставшегося сухого остатка было проведено с использованием цифровых весов (GF-400, произведено A&D Corp.). Как результат, было установлено, что из 33,70 г высушенной кожи было получено 16,10 г сухого вещества, что соответствует 47,7% стартового материала в пересчете.

Кроме того, количество аминокислот было определено при анализе концентрата на автоматическом аминокислотном анализаторе (L-8500 Amino Acid Analyzer, произведен Hitachi Co. Ltd.) для определения количества коллагена, содержащегося в концентрате. К тому же, по методу Galambos было определено количество уроновой кислоты, чтобы посчитать количество протеогликана. Более того, с помощью высокоскоростной жидкостной хроматографии (колонка TSK-GEL G4000PWXL, произведена Shimadzu Corporation) был определен молекулярный вес протеогликана.

В результате этих анализов было найдено, что сухой остаток содержит 91,7% белка, 1,9% зольных компонентов, 6,4% углеводов и 0,0% липидов. На основании описания Патентного документа 1 массовая доля корового белка в протеогликане около 7,0%. Таким образом, предполагаемая чистота протеогликана по настоящему изобретению по подсчетам составила 7,0% (то есть (углевода×0,07+липиды)/(углеводы+белки+липиды)×100=7,0%). Кроме того, было показано, что молекулярный вес протеогликана около 1700000 Дальтон.

Примеры дополнительных экспериментов

Эксперимент 1

Получение протеогликана из оболочки печени кальмара.

Оболочка печени кальмара была снята вручную и подвергалась иммерсии в ацетоне, затем была обезвожена и обезжирена. Обработанная оболочка печени, после высушивания воздухом или высушивания под пониженным давлением, была использована в качестве исходного материала. После нарезки оболочки ножницами на мелкие кусочки с последующим растиранием их в ступке была получена высушенная внешняя оболочка печени кальмара. В 3-литровый экстракционный сосуд добавляли 1678,74 г дистиллированной воды, предварительно охлажденной до 5°С, и затем добавяли 1,26 г твердого гидроксида натрия, чтобы получить в итоге 1680 г водного раствора гидроксида натрия (0,02 н.). Вышеописанная высушенная оболочка печени кальмара (12 г) была добавлена в этот экстракционный сосуд и проводилась иммерсия в течение 24 часов при 5°С при перемешивании содержимого на мешалке.

После окончания иммерсии содержимое было перенесено в другой сосуд через помещенный сверху сосуда фильтр из нержавеющей стали (1 мм), так чтобы верхняя оболочка могла быть удалена, и экстракт, содержащий протеогликан, мог быть выделен.

Экстракт был подвергнут центрифугированию на центрифуге (тип Hitachi himacCF7D2) 20 минут при 3000 об/мин. Как результат, твердые частицы и масляная фаза были отделены, и была выделена жидкая фаза, содержащая протеогликан.

Далее жидкая фаза была профильтрована через бумажный фильтр (произведено Advantec) с последующим добавлением дистиллированной воды объемом, в 6 раз превышающим объем фильтрата. Затем, с использованием мембраны BIOMAX 100K POLYETHERSULFONE (отсекаемый молекулярный вес 100000 Дальтон, произведено Millipore, Япония), отделение и концентрирование были проведены одновременно.

Была взята проба полученного концентрата и использована для определения доли твердого вещества в жидкости. Проба концентрата сушилась в сушильном шкафу (YAMATO DX401) при 105°С в течение 16 часов для полного испарения влаги. Точное взвешивание оставшегося твердого вещества было проведено с использованием цифровых весов (GF-400, произведено A&D Corp.). Как результат, было установлено, что из 12 г высушенной оболочки печени было получено 5,31 г сухого вещества, что соответствует 44,25% в пересчете на исходный материал.

Кроме того, количество аминокислот было определено при анализе концентрата на автоматическом аминокислотном анализаторе (L-8500 Amino Acid Analyzer, произведен Hitachi Ltd.) для определения количества коллагена, содержащегося в концентрате. Более того, по последующему методу Galambos было определено количество уроновой кислоты, чтобы вычислить количество протеогликана.

Более того, с помощью высокоскоростной жидкостной хроматографии (колонка TSK-GEL G4000PWXL, произведена Shimadzu Corporation) был определен молекулярный вес протеогликана.

В результате этих анализов было найдено, что сухой остаток содержит 82,7% белка, 2,43% зольных компонентов, 14,87% углеводов и 0,0% липидов. На основании описания Патентного документа 1 массовая доля корового белка в протеогликане составляет около 7,0%. Таким образом, предполагаемая чистота протеогликана настоящего изобретения была вычислена, как составляющая 16,3% (то есть, (углеводы×1,07+липиды)/(углеводы+белки+липиды)×100=(14,87×1,07+0,0)/(82,7+14,87+0,0)×100=16,3%). Кроме того, было найдено, что молекулярный вес протеогликана составляет около 1450000 Дальтон.

Эксперимент 2

Получение протеогликана из спинного хребта higfish(сименхел, тупорылый угорь, обезьяний угорь).

Хребет угря (сименхела) был подвергнут иммерсии в ацетоне, затем был обезвожен и обезжирен. Обработанный хребет, после высушивания на воздухе или при пониженном давлении, был использован в качестве исходного материала. После нарезки хребта ножницами на мелкие кусочки и измельчения в ступке был получен высушенный хребет угря. В 3-литровый экстракционный сосуд добавляли 1678,74 г дистиллированной воды, предварительно охлажденной до 5°С, и затем добавляли 1,26 г твердого гидроксида натрия, чтобы получить в итоге 1680 г водного раствора гидроксида натрия (0,02 н.). Вышеописанный высушенный хребет (12 г) был добавлен в этот экстракционный сосуд, и проводилась иммерсия в течение 9 часов при 5°С при перемешивании содержимого на мешалке.

После окончания иммерсии содержимое было перенесено в другой сосуд, поверх которого был помещен фильтр из нержавеющей стали (1 мм), чтобы удалить сам хребет, и выделить экстракт, содержащий протеогликан.

Экстракт был подвергнут центрифугированию на центрифуге (Hitachi himacCF7D2 тип) 20 минут при 3000 об/мин. Как результат, твердые частицы и масляная фаза были отделены, и жидкая фаза, содержащая протеогликан, была выделена.

Далее жидкая фаза была профильтрована через бумажный фильтр (произведено Advantec) с последующим добавлением дистиллированной воды объемом, в шесть раз превышающим объем фильтрата. Затем, с использованием BIOMAX 100K POLYETHERSULFONE (отсекаемый молекулярный вес 100000 Дальтон, произведено Millipore, Япония), отделение и концентрирование были проведены одновременно.

Проба полученного концентрата была взята и использована для определения доли твердого вещества в жидкости. Пробу концентрата сушили в сушильном шкафу (YAMATO DX401) при 105°С в течение 16 часов для полного испарения влаги. Точное взвешивание оставшегося сухого остатка было проведено с использованием цифровых весов (GF-400, произведено A&D Corp.). Как результат, было установлено, что из 12 г высушенного хребта было получено 3,83 г сухого вещества, что соответствует 31,9% в пересчете на исходный материал.

Кроме того, количество аминокислот было определено при анализе концентрата на автоматическом аминокислотном анализаторе (L-8500 Amino Acid Analyzer, произведен Hitachi Co. Ltd.) для определения количества коллагена, содержащегося в концентрате. К тому же, по методу Galambos было определено количество уроновой кислоты, чтобы вычислить количество протеогликана. Более того, с помощью высокоскоростной жидкостной хроматографии (колонка TSK-GEL G4000PWXL, произведена Shimadzu Corporation) был определен молекулярный вес протеогликана.

В результате этих анализов было найдено, что сухой остаток содержит 86,68% белка, 3,32% зольных компонентов, 10,0% углеводов и 0,0% липидов. На основании описания Патентного документа 1, массовая доля коревого белка в протеогликане составляет около 7,0%. Таким образом, предполагаемая чистота протеогликана по настоящему изобретению по подсчетам составила 11,07% (то есть (углеводы×1,07+липиды)/(углеводы+белки+липиды)×100=(10,0×1,07+0,0)/(86,68+10,0+0,0)×100=11,07%). Кроме того, было показано, что молекулярный вес протеогликана около 1450000 Дальтон.

Эксперимент 3

Получение протеогликана из хряща кита - малого полосатика (Balaenoptera acutorostrata).

Хрящ, извлеченный из кита - малого полосатика (Balaenoptera acutorostrata), который был заморожен и хранился при -40°С, был измельчен с использованием электрической мясорубки на маленькие кусочки, проведена иммерсия в ацетоне, и хрящ был обезвожен и обезжирен. Обработанный хрящ, после высушивания на воздухе или при пониженном давлении, был использован в качестве исходного материала. После нарезки хряща ножницами на мелкие кусочки и измельчения в ступке высушенный хрящ кита бал получен. В 3-литровый экстракционный сосуд добавляли 1678,74 г предварительно охлажденной до 0°С дистиллированной воды и далее туда добавляли 1,26 г твердого гидроксида натрия, чтобы получить в итоге 1680,00 г водного раствора гидроксида натрия (0,02 н.). Вышеописанный исходный материал (12, 00 г) был добавлен в этот экстракционный сосуд, и проводилась иммерсия в течение 24 часов при перемешивании содержимого на мешалке.

После окончания иммерсии содержимое было перенесено в другой сосуд, поверх которого был помещен фильтр из нержавеющей стали (1 мм), чтобы был удален хрящ, и экстракт, содержащий протеогликан, мог быть выделен.

Экстракт был подвергнут центрифугированию на центрифуге (IWAKI CFS-400 тип) 20 минут при 3500 об/мин. Как результат, твердые частицы и масляная фаза были отделены, и была выделена жидкая фаза, содержащая протеогликан.

Далее жидкая фаза была профильтрована через бумажный фильтр (произведено Advantec) с последующим добавлением дистиллированной воды объемом, в 6 раз превышающим объем фильтрата.

Затем, с использованием PREP/SCALE TFF мембраны (отсекаемый молекулярный вес 100000 Дальтон, произведено Millipore, Япония), отделение и концентрирование были проведены одновременно.

Проба полученного концентрата была взята и использована для определения доли твердого вещества в жидкости. Проба концентрата сушилась в сушильном шкафу (YAMATO DX401) при 105°С в течение 16 часов для полного испарения влаги. Точное взвешивание оставшегося сухого остатка было проведено с использованием цифровых весов (GF-400, произведено A&D Corp.). Как результат, было установлено, что из 12,00 г стартового материала было получено 4,61 г сухого вещества, что соответствует 38,42% в пересчете на исходный материал.

Кроме того, количество аминокислот было определено при анализе концентрата на автоматическом аминокислотном анализаторе (L-8500 Amino Acid Analyzer, произведен Hitachi Co. Ltd.) для определения количества коллагена, содержащегося в концентрате. К тому же, по методу Galambos было определено количество уроновой кислоты, чтобы вычислить количество протеогликана. Более того, с помощью высокоскоростной жидкостной хроматографии (колонка TSK-GEL G4000PWXL, произведена Shimadzu Corporation) был определен молекулярный вес протеогликана.

В результате этих анализов было найдено, что сухой остаток содержит 12,76% белка, 20,4% зольных компонентов, 66,84% углеводов и 0,0% липидов. На основании описания Патентного документа 1 массовая доля корового белка в протеогликане около 7,0%. Таким образом, предполагаемая чистота протеогликана по настоящему изобретению по подсчетам составила 89,8% (то есть (углеводы×1,07+липиды)/(углеводы+белки+липиды)×100=(66,84×1,07+0,0)/(66,84+12,76+0,0)×100=89,8%). Кроме того, было показано, что молекулярный вес протеогликана около 1250000 Дальтон.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в различных областях промышленности. Способ предусматривает следующее. Исходный материал, в качестве которого, например, может быть использована хрящевая ткань рыб, птиц, моллюсков, млекопитающих, подвергают измельчению. Измельченный исходный материала подвергали иммерсии в 0,0025-0,05 н. растворе соли щелочного металла. Полученный экстракт подвергали центрифугированию с последующим отделением твердой и масляной фазы. Полученную жидкую фазу подвергали центрифугированию с получением фильтрата. Полученный фильтрат промывали дистиллированной водой, в 6 раз превышающей объем фильтрата, с последующим отделением и концентрированием с получением целевого продукта. Изобретение позволяет получить протеогликан в неизмененной нераспавшейся форме, сокращение сроков его получения. 3 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ получения протеогликана, включающий стадии:
иммерсии биологического образца, содержащего протеогликан, в 0,0025-0,05 н. щелочном растворе при 0-10°С, получения раствора после иммерсии; и выделения протеогликана из полученного раствора.

2. Способ получения протеогликана по п.1, где щелочной раствор является раствором соли щелочного металла.

3. Способ получения протеогликана по п.1, где биологический образец, содержащий протеогликан, является хрящевой тканью, или кожей рыбы, моллюска, птицы или млекопитающего.

4. Способ получения протеогликана по п.3, где биологический образец, содержащий протеогликан, является хрящевой тканью рыбы, птицы или млекопитающего или кожей моллюска.