СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ФАЗ ГЕНЕРАЛИЗАЦИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ Российский патент 2010 года по МПК C12Q1/04 C12R1/07 

Изобретение относится к области ветеринарии и медицины, а именно к изучению инфекционных заболеваний, и может быть использовано для моделирования стадийности течения инфекции, прогнозирования клинического исхода и оценки схем лечения в эксперименте.

Известен способ моделирования и диагностики т.н. «конечной стадии» развития сибиреязвенной инфекции (токсического шока) у крыс линии Фишер 344 [Lincoln R.E., Walker J.S., Klein F., Rosen-Wald A.J., Jones W.J. Value of field data for extrapolation in anthrax. - Red Procceed. - 1967. - Vol.26, N5. - P.1558-1562. Ezzel J.W., Ivins B.E., Leppla S.H., Immunoelectrophoretic analysis, toxicity, and kinetics of in vitro production of the protective antigen and letal factor components of Bacillus anthracis toxin. - Infect. Immun. - 1984. - Vol.45, N3. - P.761-767. Ivins B.E., Welcos S.L. Cloning and expression of the Bacillus anthracis protective antigen in Bacillus subtilis. - Infect. Immun. - 1986. - Vol.54, N2. - P.537-542].

Способ предусматривает получение компонентов сибиреязвенного токсина в жидкой питательной среде, концентрирование, смешивание и парентеральное введение фильтрата крысам линии Фишер 344 с регистрацией симптоматики и времени их гибели. Способ имеет ряд недостатков: сложен в приготовлении препарата, применим только для изучения патогенетического действия токсина, не диагностирует инфекционно-токсический шок ввиду отсутствия этиологического фактора, а следовательно, не обеспечивает возможности определения степени генерализации (нарастания бактериемии и токсемии). Эти недостатки обусловлены чрезвычайно высокой чувствительностью крыс к токсину (для их гибели его требуется в 70 раз меньше, чем для гибели мышей, и в 170 раз меньше, чем для кроликов и обезьян) и их высокой резистентностью к заражению спорами (величина ЛД₅₀ в 140·10³ раз больше, чем у белых мышей, и в 140 раз больше, чем у кроликов и обезьян). По вышеизложенным причинам этот способ не позволяет осуществить оценку эффективности комплексных (антибактериальная + антитоксическая) схем лечения шока.

Известен способ посмертной анатомо-морфологической диагностики остропротекающей сибиреязвенной интоксикации у белых мышей, моделируемой внутрибрюшинным введением культуры спор вирулентного штамма 1СО в дозе 100-200 млн микробных клеток с регистрацией гибели животных через 12-14 часов [Патент RU №2173346. Проскурина В.А., Борисов И.В., Шиянова Е.С. Способ моделирования сибиреязвенного токсико-инфекционного шока, 2001]. Этот способ позволяет моделировать быстрое развитие сибиреязвенной инфекции у белых мышей с проявлением токсико-инфекционного шока, но обеспечивает лишь анатомо-морфологическую диагностику шока и воспроизводит условия его моделирования на биологической модели, далеко стоящей от человека по степени адекватности (подобия), что затрудняет осуществить прижизненную лабораторную диагностику степени (фазности) инфекционного процесса в организме и оценку полноты из-леченности в каждой из фаз генерализации.

Наиболее близким является способ, в котором для оценки эффективности лекарственных средств моделируется скрытая (инкубационный период), либо продромальная, или начальная (с появлением клинических признаков) стадия развития сибиреязвенной инфекции у животных [Проскурина В.А., Гребенкина М.Б., Фунтикова Т.Н. и др. Лечение сибиреязвенного токсического шока в условиях экспериментального заражения // Тезисы доклада к II Российскому Национальному конгрессу «Человек и лекарство», 10-15 апреля 1995, - М., 1995, - С.255. Инструкция по единой методике экспериментального изучения и клинических испытаний новых антибиотиков и химиопрепаратов для экстренной профилактики и лечения особо опасных инфекций. - М., 1980. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В. и др. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. - М., 1999]. В данном способе в качестве условий моделирования и диагностических критериев стадийности используют заражение животных небольшими дозами 10-30 ЛД₅₀, повышение температуры к 24 часам, фиксированные сроки начала лечения: 3 и 24 часа.

Однако заданные условия моделирования и диагностики фиксируют лишь начало развития инфекции, при которой общепринятые лекарственные средства являются эффективными, но не позволяют выявлять различий в эффективности антибактериальной и комбинированной схем лечения экспериментальной сибирской язвы. Кроме того, данный способ вследствие применения низких доз заражения и отсутствия объективных лабораторных критериев определения более поздних фаз развития инфекции не моделирует в заданные отрезки времени и не диагностирует токсико-инфекционный шок.

Задачей изобретения является создание условий моделирования фаз генерализации и комплекса критериев их прижизненной диагностики для изучения эффективности схем лечения поздних стадий сибирской язвы и прогнозирования клинического исхода.

Поставленная задача решается следующим образом.

Кроликам породы Шиншилла вводят подкожно суспензию спор сибиреязвенного штамма Ч-7 в дозе, соответствующей величине 500 ЛД₅₀. Клиническое наблюдение и определение I-V фаз (стадий) генерализации осуществляют по следующим критериям: уровню бактериемии методом подсчета цепочек в мазках крови и высевом на плотную питательную среду (БК - биологическая концентрация) [Методические указания по микробиологической диагностике инфекционных заболеваний. - Горький, 1964]; уровню токсемии - методом иммуноферментного анализа содержания протективного антигена [Kobiler D., Weiss S., Levy H. et al. Protective antigen as a Correlative Marker for Anthrax // Infect. Immun. - 2006, - Vol.74, - P.5871-5876]; биохимической активности: поглотительной способности нейтрофилов и цитоморфологии клеток крови цитохимическими методами определения лизосомальных белков (ЛКТ), фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) и степени деструкции нейтрофильных лейкоцитов и эритроцитов [Педиатрия. Руководство. Инфекционные заболевания / Под ред. Р.Е.Бермана, В.К.Вагана. - М., 1992].

С использованием комплекса микробиологических, цитологических и иммунологических методов детекции достигается возможность прижизненной диагностики фаз (стадий) генерализации экспериментальной сибиреязвенной инфекции и выбора наиболее эффективных схем лечения поздних стадий за счет использования более адекватной человеку биологической модели, клинико-лабораторных показателей, метода математического моделирования инфекции и прогнозирования клинического исхода у леченых и нелеченых животных.

Предложенное решение осуществляется следующим образом. Экспериментально определяют значения показателей функционального состояния организма, бактериемии, токсемии и цитоморфологии клеток крови. С учетом граничных значений показателей (таблица 1) выделяют в патологическом процессе соответствующую фазу (стадию) генерализации инфекции. Для первой - начальной фазы (стадии) характерен сравнительно невысокий уровень бактериемии: до 9·10³ колониеобразующих единиц (КОЕ)·см^-3, или появление одной цепочки в 10-20 полях зрения на фоне незначительного ухудшения общего функционального состояния животных и без существенного изменения цитохимических (от 1,9 до 2,4 усл. ед.) и цитоморфологических (отсутствует агрегация и дефекты в клеточной оболочке нейтрофилов и эритроцитов) показателей. Концентрация токсина в крови (по содержанию протективного антигена - ПА) составляет 0,005-0,090 мкг·см^-3.

Вторая (активация патологического процесса) и третья («разгар») фазы генерализованного процесса различаются между собой в основном по концентрации возбудителя и токсина в крови. Для второй фазы развития генерализации инфекционного процесса характерны следующие диапазоны значений показателя бактериемии: 1 цепочка в 1-2 полях зрения при микроскопии и 1,0·10⁴-4,0·10⁴ КОЕ·см^-3 по высеву, содержание токсина 0,1-0,3 мкг·см^-3. В третьей фазе («разгара») имеет место существенное увеличение этих показателей: 2-4 цепочки в каждом поле зрения, 0,5·10⁵-1,0·10⁶ КОЕ·см^-3, 1-3 мкг·см³ токсина соответственно. При этом наблюдается ухудшение функционального состояния кроликов. Величины таких показателей, как ФАН и ЛКТ, по мере утяжеления инфекционного процесса имеют тенденцию к снижению с 2,1-2,3 (II фаза) до 1,4-2,2 усл. ед. (III фаза) - для ФАН, и с 1,9-2,1 (II фаза) до 1,7-2,2 усл. ед. (III фаза) - для ЛКТ.

Следует подчеркнуть, что значение показателя ФАН, равное 1,5 усл. ед., встречающееся в III фазе в 50% случаев, является прогностически неблагоприятным признаком, поскольку эффективность антибактериального лечения резко снижается: со 100% при ФАН, равной 1,9-2,2 усл. ед., до 0-33% при ФАН, равной 1,5±0,1 усл. ед. При этом отмечается выраженная агрегация (по 3-11) эритроцитов.

На четвертой (предтерминальной или преморбидной) и пятой (терминальной) фазах генерализации концентрация возбудителя в крови составляет 2,0·10⁶-6,0·10⁶ КОЕ·см^-3 и 7,0·10⁶-4,0·10⁷ соответственно или 5-17 и 18-35 цепочек в каждом поле зрения; содержание токсина в крови увеличивается до 4,0-7,0 мкг·см^-3 (IV фаза) и до 8-25 мкг·см^-3 и более - в V фазе. При этом для четвертой фазы характерной особенностью является выраженная агрегация эритроцитов и их деформация (более чем у 40% клеток), превышение индекса дегенерации лейкоцитов величины 50. Пятая фаза сопровождается лизисом эритроцитов и усилением дегенерации нейтрофилов. Значения цитохимических показателей резко уменьшаются - до 1,1-1,5 усл. ед. (ЛКТ) и 1,00-1,45 усл. ед. (ФАН). Более того, если на первых четырех фазах заболевания отмечается подъем температуры, то на пятой фазе генерализации обнаруживается резкое ее падение - с 40°С до 37°С.

Усиление тяжести течения сибиреязвенной инфекции при ее генерализации связано с нарастанием бактериемии и токсемии. Наличие агрегации клеток крови и их деформация на III-V фазах генерализации (т.н. «каркасы» нейтрофилов, эритроцитов, т.е. базофильных окрашенных зон клеток), как и угнетение фагоцитарной и биохимической активности лейкоцитов свидетельствует об усилении цитопатогенного действия сибиреязвенного токсина и гемолизина. Вышеуказанные изменения являются характерными признаками диссеминированного васкуляторного синдрома при инфекционно-токсическом шоке, интенсивность которого в заданных экспериментом условиях нарастает от III к V фазе.

Для прогнозирования времени начала I-V фаз (t_iD) и срока гибелей (t_п) кроликов в зависимости от инфицирующей дозы (D) используются следующие аппроксимирующие соотношения:

и t_п=88,397·D^-0,1145.

Сравнение рассчитанных и экспериментальных данных, приведенных в таблице 2, показывает, что прогнозируемые и реально получаемые характеристики близки или совпадают. Вышеуказанные соотношения наиболее удовлетворительно прогнозируют наступление времени начала I-V фаз генерализации и гибели кроликов при дозе, соответствующей величине 500 ЛД₅₀.

Прогнозируемый уровень бактериемии (с_п) рассчитывается по формулам, аппроксимирующим экспериментальные данные для инфицирующей дозы 500 ЛД₅₀ и отрезков времени 7-25 ч и 26-29 ч соответственно.

с_п=ехр(а+в·t+c·t²),

где a=5,0953, в=-0,3475, с=0,02487 при 7 ч≤t≤25 ч;

c_п=ехр (-389,4259+28,0734·t-0,48494·t²), при 26 ч≤t≤29 ч.

Из данных, представленных в таблице 3, следует, что прогнозируемые уровни бактериемии для моментов времени 12, 20, 23, 26, 27, 29 ч удовлетворительно согласуются с экспериментальными данными.

Оценку эффективности новых средств и схем лечения генерализованной формы экспериментальной сибирской язвы проводят с учетом определения фаз генерализации и коэффициентов эффективности общепринятых схем лечения.

Результаты оценки эффективности двух типов схем терапии кроликов, приведенные в таблице 4, свидетельствуют о возможности использования способа определения генерализации инфекции для изучения новых лекарственных средств и выбора схем лечения, дающих максимальный терапевтический эффект на ранних или поздних стадиях заболевания.

Таблица 1 Фазность (стадийность) генерализации сибиреязвенной инфекции у кроликов по комплексу критериев тяжести течения заболевания Показатель, единицы Среднее значение показателя и его колебания (min-max) на … час после заражения в фазе № … 20 (12-24) 23 (20-25) 26 (22-29) 27 (25-28) 28 (24-30) измерений I II III IV V Количество цепочек в поле зрения при нижеприведенных диапазонах величин БК 0,2 0,7 3 12 23 1 цепочка в 10-20 полях зрения в 67% случаев при БК=(2-9)·10³ КОЕ·см^-3 1 цепочка в 1-2 полях зрения в 33% случаев 2-4 цепочки в каждом поле зрения в 30% случаев 5-17 цепочек в каждом поле зрения в 60% случаев и 1-2 цепочки - в 40% случаев 18-35 цепочек в каждом поле зрения в 70% случаев и 3-6 цепочек - в 30% случаев Количество члеников в 1 цепочке 2 2 2 3 3 (1-3) (1-3) (1-3) (1-5) (1-8) Концентрация возбудителя в крови (БК), КОЕ·см^-3 2·10³ 0,2·10⁵ 0,5·10⁶ 4,0·10⁶ 18·10⁶ (50-9·10³) (1·10⁴-4·10⁴) (0,5·10⁵-1,0·10⁶) (2,0·10⁶-6,0·10⁶) (7,0·10⁶-40,0·10⁶) Концентрация токсина в крови (по содержанию ПА), мкг·см^-3 0,03 0,2 1,0 6,0 20 (0,005-0,09) (0,1-0,3) (1,0-3,0) (4,0-7,0) (8-25 и более) ФАН, усл. ед.     1,8     2,1 2,2 (1,4-2,2), 1,4 1,3 (1,9-2,4) (2,1-2,3) частота встречаемости прогнозных величин 1,5 и 1,4 - 50% (1,20-1,45) (1,00-1,45)   20 2,0 1,9 1,4 1,3 ЛКТ, усл. ед. (1,9-2,4) (1,9-2,1) (1,7-2,2) (1,2-1,6) (1,1-1,5)

Продолжение таблицы 1 Показатель, единицы измерений Среднее значение показателя и его колебания (min-max) на … час после заражения в фазе № … 20 (12-24)
I 23 (20-25)
II 26 (22-29)
III 27 (25-28)
IV 28 (24-30)
V Функциональное состояние животных: температура, °С 39,3 (39,0-39,5) 39,6 (39,5-40,0) 40,7 (40,5-41,0) 40,7 (40,5-41,0) 37,3 (37,0-37,5) вялость ± + + + + заторможенность - - - + + отказ от пищи ± + + + + частота дыхания Норма Тахипноэ Тахипноэ Тахипноэ Куссмауля Состояние кожных покровов на ощупь Норма Горячие Горячие Горячие, сменяющиеся на цианотичные, холодные Цианотичные, холодные Цитоморфология эритроцитов Агрегации, дефектов в клеточной оболочке нет, нормально окрашены Агрегации нет (или незначительная), дефектов в клеточной оболочке нет Агрегация (по 3-11 эритроцитов) при концентрации (С) более или равной 2 цепочкам в каждом поле зрения Агрегация при С, равной 6-8 и более цепочкам в поле зрения со «слитым» окрашиванием, с разрыхлением клеточной оболочки (встречаются только клеточные «каркасы»), деформация клеток более или равна 40%, пойкилоцитоз, анизоцитоз Агрегация с деформацией клеток более или равной 50% при С более или равной 20 цепочкам в поле зрения;
Разрушение клеточной оболочки при С от 20 до 35 и более цепочек, пойкилоцитоз, анизоцитоз

Продолжение таблицы 1 Показатель, единицы измерений Среднее значение показателя и его колебания (min-max) на … час после заражения в фазе № … 20 (12-24) 23 (20-25) 26 (22-29) 27 (25-28) 28 (24-30) I II III IV V Цитоморфология нейтрофильных лейкоцитов Вакуолизация, пикноз, тельца ДЕЛЕ, индекс дегенерации менее 50 Вакуолизация, пикноз, тельца ДЕЛЕ, индекс дегенерации менее 50 Вакуолизация, пикноз, тельца ДЕЛЕ, индекс дегенерации менее 50 Вакуолизация, пикноз, тельца ДЕЛЕ, индекс дегенерации более 50 Вакуолизация, пикноз, тельца ДЕЛЕ, индекс дегенерации более 50 Примечание - Приведены обобщенные данные с учетом количества кроликов, леченных доксициклином, а также другими антибиотиками и комплексами

Таблица 2 Прогнозируемые и реально получаемые сроки начала I-V фаз генерализации и гибели кроликов в зависимости от инфицирующей дозы   Время начала   Инфицирующая доза, количество ЛД₅₀ I-V фаз (t_1D), ч Сроки гибели …, ч прогнозируемые / в эксперименте прогнозируемые, t_п в эксперименте, t_э превышение (+) или снижение (-) t_п относительно t_э, ч 1 24-44-52-54-58/       40-48-54-58-63 60,6 66,0 -5,4 3 - 53,9 52,0 +1,9 5 - 50,4 54,0 -3,6 30 - 47,5 48,5 -1,0 50 - 39,5 38,0 -1,5 500 12-22-26-27-29/       18-23-26-27-28 30,5 30,0 +0,5

Таблица 3 Прогнозируемые и реально получаемые уровни бактериемии при инфицировании кроликов дозой живых спор, соответствующей 500 ЛД₅₀ Время после инфицирования, ч/фаза Прогнозируемый уровень бактериемии (c_п), КОЕ·см^-3 Реально полученные уровни бактериемии (с_э), КОЕ·см^-3 Превышение (+) или снижение (-) c_п относительно c_э, % 12/I 91,00 50,00 +80 20/I 3,28·10³ 2,50·10³ +31 23/II 2,86·10⁴ 4,00·10⁴ -29 26/III 3,90·10⁵ 5,00·10⁵ -22 27/IV 3,38·10⁶ 4,00·10⁶ -16 29/V 2,11·10⁷ 2,00·10⁷ -5,6

Таблица 4 Коэффициенты эффективности схем лечения, применяемых на различных фазах генерализации сибиреязвенной инфекции   Коэффициенты эффективности схем лечения, применяемых на … фазах генерализации Тип (вид) схемы   I II III IV V Моноантибактериальный ≥10 3,0 1,2 1,0 1,0 Комплексный ≥10 ≥10 8,0 1,9 1,0 Примечания: 1. Монопрепарат - антибиотик 1-й очереди парентерального применения (доксициклин, ампицилин, ципрофлоксацин). 2. Комплексный - (антибиотики 1-й очереди применения или комбинация сочетающихся антибиотиков + иммунопрепараты: F(ab)₂ фрагменты, иммуноглобулин (человеческий или лошадиный) + иммуномодулятор (полиоксидоний, галавит) + патогенетические средства + фармакологический антитоксин). 3. Коэффициент эффективности определяется по формуле где n - количество (в долях) леченых, но погибших животных.

Способ по изобретению предусматривает создание условий моделирования фаз генерализации экспериментальной сибирской язвы и комплекса критериев их прижизненной диагностики для изучения эффективности схем лечения поздних стадий сибирской язвы и прогнозирования клинического исхода. Для осуществления способа используют кроликов, которым вводят подкожно суспензию спор сибиреязвенного штамма Ч-7. Определяют фазы генерализации по результатам анализа крови: по количеству цепочек в мазках крови, концентрации живых клеток, содержанию сибиреязвенного токсина и лизосомально-катионных белков, фагоцитарной активности нейтрофилов, агломерации и деформации эритроцитов, степени дегенерации лейкоцитов. Установлены 5 фаз (стадий) генерализации сибиреязвенной инфекции, определены диапазоны значений клинико-лабораторных показателей и эффективность антибактериального лечения. Способ по изобретению может быть использован для моделирования стадийности течения инфекции, вызванной возбудителем сибирской язвы, прогнозирования клинического исхода и оценки схем лечения в эксперименте. 4 табл.

Способ прижизненной диагностики фаз генерализации экспериментальной сибирской язвы, включающий заражение лабораторных животных инфектом и диагностику функциональных систем, отличающийся тем, что в качестве лабораторных животных используют кроликов, вводят им подкожно суспензию спор сибиреязвенного штамма Ч-7 в дозе, соответствующей величине 500 ЛД₅₀, и в процессе клинического наблюдения определяют фазы генерализации по результатам анализов крови по следующим критериям: количеству цепочек в мазках крови, концентрации живых клеток в крови при высеве на плотную питательную среду, содержанию сибиреязвенного токсина в крови, фагоцитарной активности нейтрофилов, содержанию лизосомально-катионных белков, агломерации и деформации эритроцитов, степени дегенерации лейкоцитов, причем I фазе соответствуют:
I цепочка в 10-20 полях зрения микроскопа,
от 50 до 9·10³ КОЕ·см^-3 при высеве,
от 0,005 до 0,090 мкг·см^-3 токсина,
от 1,9 до 2,4 усл. ед. фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН),
от 1,9 до 2,4 усл. ед. лизосомально-катионных белков (ЛКТ),
отсутствие агломерации и деформации эритроцитов,
индекс дегенерации лейкоцитов менее 50;
II фазе соответствуют:
1 цепочка в 1-2 полях зрения микроскопа,
от 1,0·10⁴ до 4,0·10⁴ КОЕ·см^-3 при высеве,
от 0,1 до 0,3 мкг·см^-3 токсина,
от 2,1 до 2,3 усл. ед. фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН),
от 1,9 до 2,1 усл. ед. лизосомально-катионных белков (ЛКТ),
отсутствие агломерации и деформации эритроцитов,
индекс дегенерации лейкоцитов менее 50;
III фазе соответствуют:
от 2 до 4 цепочек в каждом поле зрения микроскопа,
от 0,5·10⁵ до 1,0·10⁶ КОЕ·см^-3 при высеве,
от 1,0 до 3,0 мкг·см^-3 токсина,
от 1,4 до 2,2 усл. ед. фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН),
от 1,7 до 2,2 усл. ед. лизосомально-катионных белков (ЛКТ),
наличие агломерации по 3-11 эритроцитов,
индекс дегенерации лейкоцитов менее 50;
IV фазе соответствуют:
от 5 до 17 цепочек в каждом поле зрения микроскопа,
от 2,0·10⁶ до 6,0·10⁶ КОЕ·см^-3 при высеве,
от 4,0 до 7,0 мкг·см^-3 токсина,
от 1,20 до 1,45 усл. ед. фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН),
от 1,2 до 1,6 усл. ед. лизосомально-катионных белков (ЛКТ), наличие агломерации и разрыхления (деформации) оболочек у менее чем 50% эритроцитов,
индекс дегенерации лейкоцитов более 50;
V фазе соответствуют:
от 18 до 35 цепочек в каждом поле зрения микроскопа,
от 7,0·10⁶ до 40,0·10⁶ КОЕ·см^-3 при высеве,
от 8,0 до 25,0 мкг·см^-3 токсина и более,
от 1,00 до 1,45 усл. ед. фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН),
от 1,1 до 1,5 усл. ед. лизосомально-катионных белков (ЛКТ),
наличие агломерации и деформации оболочек у более чем 50% эритроцитов, индекс дегенерации лейкоцитов более 50.