СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И ЕЕ ТИПА У B.ANTHRACIS Российский патент 2004 года по МПК C12N1/20 C12Q1/02 C12Q1/08 C12Q1/02 C12R1/07 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при определении типа и уровня гемолитической активности изолятов, клональном анализе, изучении характера популяционной изменчивости и массовом скрининге популяций штаммов В. anthracis по признаку гемолитической активности.

В бактериологии широко используются методы определения гемолитической активности микроорганизмов, в частности, для кокковых инфекций, листериоза, клостридиозов, гемофилезов, колибактериозов, йерсинеозов, микобактериозов и др. Однако эти методы, по доступным литературным данным, не используются для определения уровня гемолитической активности отдельных колониеобразующих единиц В. anthracis, так как отсутствие гемолитической активности долгое время считалось классическим признаком В. anthracis (Гинсбург Н.Н. “Сибирская язва”, М., 1975. - 157 с.; Коротич А.С., Погребняк Л.И. “Сибирская язва”, Киев, 1976. - 160 с; Бургасов П.Н., Рожков Г.И. “Сибиреязвенная инфекция”, М., 1984. - 206 с.; Лобзин Ю.В., Волжанин В.М., Захаренко С.М. “Сибирская язва”, “Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия”, №2, Том 4, 2002. - 104-127 с.). Это мнение основывалось на данных, получаемых в соответствии со стандартной методикой определения гемолитической активности сибиреязвенного микроба на агаре Хоттингера или 2%-ном МПА с 5-10% дефибринированной крови барана. При выращивании при 37°С в течение суток вокруг колоний В. anthracis зон лизиса эритроцитов не образуется, что обусловлено низкой чувствительностью метода.

В литературе описаны методы изучения гемолитических свойств фильтратов 48-часовых бульонных культур сибиреязвенного микроба, в которых гемолитическая активность оценивалась визуально по степени окрашивания фильтратов после их суточной инкубации с отмытыми эритроцитами барана (Trbic B.V., Mihajlovic B.H. "Haemolytic activity of Bacillus anthracis", "Acta vet", Beograd, 1953, v.3, p. 151-156) и спектрофотометрическим измерением выхода гемоглобина из лизируемых культуральной жидкостью или клеточными лизатами В. anthracis эритроцитов при 420 нм (Маринин Л.И., Онищенко Г.Г и др. “Микробиологическая диагностика сибирской язвы”, М., 1999. – 224 с.). Чувствительность этих методов довольно низкая, а получение стерильных фильтратов бульонных культур, особенно при работе с вирулентными штаммами, требует времени и высококачественных фильтрующих устройств. Кроме того, результаты определения суммарной гемолитической активности популяции в значительной степени зависят от состава питательной среды и скорости роста культуры конкретного микроорганизма. Чем выше скорость роста культуры, тем большее количество клеток выделяет гемолизин и тем выше результат определения гемолитической активности. При этом штаммы с низким уровнем экспрессии гемолизинов и высокой репродуктивной способностью могут ошибочно быть отнесены к группе штаммов с высокой гемолитической активностью.

Шевченко О.В. разработан способ определения гемолитической активности на однослойной среде (1,5% L-агар) с добавлением 5-% взвеси эритроцитов барана, отмытых буферным раствором ASE (Шевченко О.В. "Протеолитическая активность возбудителя сибирской язвы". Дисс.канд. наук. - Саратов, 1999. - 99 с.). Этот способ позволяет определять гемолитическую активность колоний возбудителя сибирской язвы по ширине формирующейся зоны гемолиза. Определение гемолитической активности возбудителя сибирской язвы производится следующим образом: колонии В. anthracis отбирают стеклянными палочками и однократным касанием наносят на поверхность однослойной среды с эритроцитами. Посевы инкубируют при 36 (±1)°С. Учет результатов проводят через 48-96 ч. Недостатками метода является то, что в 1,5%-ном L-агаре затруднена диффузия секретируемых гемолизинов в толщу среды, содержащей эритроциты. При низком и среднем уровнях гемолитической активности изолятов и высокой репродуктивной способности зона роста колонии может перекрывать зону гемолиза или совпадать с ней. Кроме того, уровень экспрессии гемолизинов клетками В. anthracis при концентрации эритроцитов 5-6% недостаточен для их полного лизиса в зоне гемолиза.

Ближайшим аналогом изобретения является способ определения гемолитической активности В. anthracis луночным методом по О.И.Цыганковой, основанный на диффузии гемолитически активных продуктов в двухслойный агар “Дифко” на физиологическом растворе с содержанием 6% эритроцитов, трижды отмытых физиологическим раствором (Цыганкова О.И. “Гемолитическая и протеолитическая активность сибиреязвенного микроба”, Дис.канд. мед. наук. - Ставрополь, 1993. - 179 с.). При определении гемолитической активности данным методом в лунки, пробитые в двухслойном агаре, вносится по 0,1 мл суточной бульонной культуры какого-либо штамма В. anthracis, после чего посевы инкубируются при 36 (±1)°С. Учет проводится через 24 и 48 часов путем измерения зоны гемолиза (от края лунки до четко ограниченной зоны деградации эритроцитов). По мнению автора метод позволяет выявлять качественные различия между штаммами в их способности лизировать эритроциты человека и животных различных видов, а также ориентировочно оценивать уровень активности гемолизина по ширине зоны гемолиза. Чувствительность этого способа выше, чем при использовании фильтратов, однако метод не позволил авторам выявить гемолитическую активность в отношении эритроцитов барана у штаммов, продуцирующих β-гемолизины, и поэтому штаммы, атипичные по капсулообразованию и некоторым другим признакам (антибиотикорезистентность, отклонения в питательных потребностях и др.), были отнесены к группе гемнегативных. Кроме того, недостатком метода является то, что он позволяет определять лишь суммарную гемолитическую активность всей популяции, поскольку в лунки могут вноситься либо фильтраты бульонной культуры, либо непосредственно бульонная культура, в которой сибиреязвенный микроб находится в вегетативной форме. Результаты метода также сильно зависят от репродуктивной способности штаммов.

Целью изобретения является разработка более совершенного способа определения гемолитической активности и ее типа у культур В. anthracis, позволяющего исследовать уровень экспрессии гемолизинов отдельными колониеобразующими единицами (спорами), определять тип гемолиза различных изолятов, изучать характер популяционной изменчивости, проводить клональный анализ, массовый скрининг и дифференциацию популяций штаммов В. anthracis по признаку гемолитической активности.

Поставленная цель достигается способом определения гемолитической активности и ее типа у В.anthracis, включающим посев исследуемой культуры, инкубирование посевов при температуре 36 (+1)°С в течение 24-48 часов и измерение ширины зоны гемолиза, заключающимся в том, что посев исследуемой культуры либо в споровой, либо в вегетативной форме осуществляют на поверхность питательной среды, в качестве питательной среды используют двухслойный кровяной агар со следующим содержанием компонентов, мл на чашку Петри: подложечный агар (1%-ный агар “Дифко”, приготовленный на физиологическом растворе) - 15-20; покрывной агар (на 100 мл: 50 мл мясо-пептонного бульона, 0,7 г агара “Дифко”, NaCl с учетом его содержания в МПБ до 0,85 г, дистиллированная вода до 100 мл, 3-4 мл эритроцитов барана) – 5 и после инкубирования по характеру изменения окраски колонии и зоны гемолиза визуально определяют тип гемолитической активности, а по соотношению радиуса колонии (r_к) и ширины зоны гемолиза - ее уровень.

При посеве материала культур В. anthracis (в споровой или вегетативной форме) на чашку Петри на поверхности агара вырастают отдельные колонии микроорганизма. Через 24-48 часов вокруг колоний образуется четко ограниченная прозрачная зона гемолиза (β-гемолиз) или прозрачная зона с зеленящим эффектом (α-гемолиз). Об уровне гемолитической активности судят по соотношению радиуса колонии (r_K) и ширины зоны гемолиза через 48 часов (от края колонии до границы зоны гемолиза):

r_к<ширины зоны гемолиза - высокий;

r_к=или превышает ширину зоны гемолиза менее чем в

2 раза - средний;

r_K > ширины зоны гемолиза в 2 и более раза - низкий.

Приготовление покрывного слоя агара с содержанием в нем 50% мясо-пептонного бульона создает оптимальные условия роста для различных культур В. anthracis как с высокой, так и с низкой репродуктивной способностью. При увеличении процентного содержания мясо-пептонного бульона в покрывном слое агара (до 100-75%) размеры колоний штаммов, обладающих высокой репродуктивной способностью и низкой или средней гемолитической активностью, могут перекрывать зону гемолиза, искажая результаты исследований. Уменьшение процентного содержания мясо-пептонного бульона (до 25%) не создает условий для быстрого формирования колоний достаточной величины у штаммов с низкой репродуктивной способностью.

При определении уровня гемолитической активности необходимо измерять не только ширину зоны гемолиза (как в луночном способе), но и радиус колонии. Поскольку штаммы В. anthracis обладают различной репродуктивной способностью, размеры колоний значительно варьируют и простое измерение ширины зоны гемолиза, без учета размеров самой колонии, может несколько искажать результаты исследований.

Предлагаемый способ позволяет проводить наблюдения в динамике, выявляя степень ферментативной активности в любой из периодов развития колоний, обладает высокой чувствительностью и наглядностью.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1

Для определения уровня гемолитической активности и ее типа у отдельных колониеобразующих единиц В. anthracis споровый материал возбудителя получают его культивированием на картофельном агаре в течение 7 суток. Концентрацию жизнеспособных спор определяют путем высева из серийных (десятикратных) разведений на агаровую среду в чашки Петри.

Кровь у барана берут из яремной вены, соблюдая правила асептики, в сосуд с налитым в него раствором Алсивера в количестве, равном объему крови (для дефибринирования и консервирования).

Приготовление покрывного агара производят следующим образом (из расчета на 100 мл): к 50 мл МПБ (рН 7,2-7,4) добавляют 0,7 г агара “Дифко”, содержание NaCl в смеси доводят до 0,85 г (с учетом содержания его в МПБ) и стерильной дистиллированной водой доводят объем до 100 мл. Смесь расплавляют в водяной бане и стерилизуют автоклавированием при 121°С в течение 30 мин.

Готовят двухслойный агар: 1%-ный агар “Дифко”, приготовленный на физиологическом растворе, расплавляют, охлаждают и разливают в стерильные чашки Петри диаметром 90 мм по 15 мл. К покрывному агару, предварительно расплавленному и остуженному до 45°С, добавляют взвесь эритроцитов, трижды отмытых физиологическим раствором (из расчета 3-4 мл эритроцитов на 100 мл покрывного агара), после чего наносят по 5 мл на застывший нижний слой агара.

В чашку Петри с двухслойным агаром засевают 0,1 мл рабочего разведения споровой суспензии возбудителя, содержащего от 2 до 10 спор В. anthracis. Посевы инкубируют при температуре 36 (±1)°С. Учет результатов производят через 24, 48 ч путем измерения радиуса колонии и ширины зоны гемолиза (четко ограниченная, совершенно прозрачная зона вследствие полного разрушения эритроцитов) от края колонии до границы зоны гемолиза и визуально оценивают тип гемолиза (отсутствие или наличие “зеленящего” эффекта в зоне лизиса эритроцитов) (см. таблицу).

Пример 2

Для определения типа гемолиза популяции изолята (штамма) материал колонии или бульонной культуры В. anthracis (вегетативная форма) отбирают стеклянными палочками (иглой) и однократным касанием наносят на поверхность двухслойного агара, приготовленного, как описано выше (пример 1).

Посевы инкубируют при температуре 36 (±1)°С. Учет результатов производят через 24, 48 ч, визуально оценивая тип гемолиза. В том случае, если колония и формирующаяся вокруг нее зона гемолиза окрашиваются в зеленовато-коричневый цвет, тип гемолиза оценивается как α (альфа). Если зона лизиса эритроцитов остается совершенно прозрачной, а цвет колоний серо-белым - β-тип гемолиза. Путем измерения радиуса колонии и ширины зоны гемолиза (четко ограниченная совершенно прозрачная зона вследствие полного разрушения эритроцитов) от края колонии до границы зоны гемолиза оценивается уровень гемолитической активности популяции изолятов или штаммов В. anthracis.

Изобретение относится к микробиологии, в частности к определению типа и уровня гемолитической активности у В.anthracis. Способ включает посев исследуемой культуры в споровой или вегетативной форме на поверхность двухслойного кровяного агара со следующим содержанием компонентов, мл на чашку Петри: подложечный агар – 15-20, покрывной агар – 5. Подложечный агар представляет собой 1%-ный агар “Дифко”, приготовленный на физиологическом растворе. Для приготовления 100 мл покрывного агара используют 50 мл мясо-пептонного бульона, 0,7 г агара “Дифко”, NaCl с учетом его содержания в МПБ до 0,85 г, дистиллированная вода до 100 мл с последующим внесением 3-4 мл взвеси эритроцитов барана. Инкубируют посев 24-48 часов. Визуально по характеру изменения окраски колонии и зоны гемолиза определяют тип гемолитической активности (α, β-гемолиз), а по соотношению радиуса колонии (r_к) и ширины зоны гемолиза - ее уровень. Предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью и наглядностью. 1 табл.

Способ определения гемолитической активности и ее типа у В.anthracis, включающий посев исследуемой культуры, инкубирование посевов при температуре (36±1)°С в течение 24-48 ч и измерение ширины зоны гемолиза, отличающийся тем, что посев исследуемой культуры либо в споровой, либо в вегетативной форме осуществляют на поверхность питательной среды, в качестве питательной среды используют двухслойный кровяной агар со следующим содержанием компонентов, мл на чашку Петри:

Подложечный агар (1%-ный агар “Дифко”,

приготовленный на физиологическом растворе) 15-20

Покрывной агар (на 100 мл: 50 мл мясо-пептонного

бульона, 0,7 г агара “Дифко”, NaCl с учетом его

содержания МПБ до 0,85 г, дистиллированная вода до

100 мл, 3-4 мл взвеси эритроцитов

барана) 5

и после инкубирования по характеру изменения окраски колонии и зоны гемолиза визуально определяют тип гемолитической активности, а по соотношению радиуса колонии (r_к) и ширины зоны гемолиза - ее уровень.