СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕКТИНА ИЗ КОРЫ ЛИСТВЕННИЦЫ, ОБЛАДАЮЩЕГО МЕМБРАНОСТАБИЛИЗИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ И СПОСОБНОСТЬЮ ВОССТАНАВЛИВАТЬ ИОНЫ СЕРЕБРА, НАНОБИОКОМПОЗИТЫ СЕРЕБРА, СТАБИЛИЗИРОВАННЫЕ ПЕКТИНОМ Российский патент 2010 года по МПК C08B37/06 B82B1/00 

Изобретение относится к химии природных полисахаридов и нанобиокомпозитов на их основе, а именно к способам получения пектиновых полисахаридов из древесных отходов и изучению их свойств. Оно может быть использовано в деревоперерабатывающей, фармацевтической, химической, медицинской, пищевой и других отраслях промышленности, поскольку касается способа получения пектиновых полисахаридов из коры лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и/или коры лиственницы Гмелина (даурской) [Larix gmelinii Rupr. (Rupr.)] и изучения свойств получаемого продукта - это восстанавливающая способность пектина по отношению к ионам благородных металлов, например серебра, и его способность образовывать нанобиокомпозиты. Кроме того, показана мембраностабилизирующая активность полученных пектиновых полисахаридов.

Пектиновые полисахариды могут быть получены из различных растительных источников и различными методами. Так для выделения пектиновых полисахаридов используют надземную часть свежесобранного растительного сырья [патент RU 2176515, патент RU 2149642], а также биомассу культивируемых тканей растений [патент RU 2175843]. Недостатками первых двух методов является то, что при использовании свежесобранного сырья ограничено время его переработки, а недостатком третьего метода является необходимость культивации тканей растений, т.е. специальная технология подготовки сырья - выращивание культуры тканей из ограниченного круга пектинсодержащих растений, на что требуются дополнительные расходы.

По выбору исходного сырья для извлечения пектина близким к заявляемому является объект - кора лиственницы сибирской, используемый в работе: [Ефремов А.А., Кондратюк Т.А. Химия растительного сырья, 2008, № 4, С.171-176].

Недостатками этого способа является то, что в качестве исходного сырья для получения пектиновых веществ использована кора только одного вида лиственницы - лиственницы сибирской, и для выделения пектинов применен метод гидролиз-экстракции с использованием сильного кислотного агента - соляной кислоты, что, как известно, приводит к деструкции получаемого продукта - нарушению нативности структуры пектина и, как следствие, к изменению его биологических свойств.

Наиболее близким к заявляемому изобретению по методу извлечения является способ получения полисахаридов, обладающих иммуностимулирующим действием [патент RU 2176515]. Суть этого патента заключается в следующем: сырье - свежесобранные пресноводные цветковые растения или предварительно измельченная свежая надземная часть высших растений обрабатывается формалином для удаления пигмента, выдерживается в подкисленной воде при рН 3,8-4,2 и 45-52°С, затем осуществляется экстракция пектиновых полисахаридов водным раствором оксалата аммония. Экстракт концентрируется и обрабатывается 96% этиловым спиртом. Полученный целевой продукт отфильтровывается и высушивается лиофильно.

Недостатками этого способа является то, что он распространяется только на свежесобранное растительное сырье, а также на первой стадии обработки сырья используется формалин, который в настоящее время внесен в список канцерогенных веществ, и при изготовлении продукта для внутреннего приема человеком требует дополнительного анализа на его наличие в конечном продукте.

Задачи предлагаемого изобретения.

1. Расширение сырьевой базы для получения пектиновых полисахаридов за счет использования отходов деревоперерабатывающей промышленности: коры лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и/или коры лиственницы даурской (Гмелина) (Larix gmelinii Rupr. (Rupr.)).

2. Разработка нового способа выделения пектиновых полисахаридов, лишенных вышеуказанных недостатков

3. Определение свойств (химических и биологических) получаемого продукта.

Технический результат достигается за счет использования последовательных экстракций многотоннажного отхода деревоперерабатывающей промышленности - лиственничной коры для освобождения ее от липидов и фенольных веществ, затем от танинов и в результате получается суммарная фракция пектиновых полисахаридов с выходом до 12%. Неоспоримым достоинством и преимуществом предлагаемого способа является то, что он позволяет получать ценный продукт для фармацевтической, медицинской, пищевой и других видов промышленности из бросового сырья - лиственничной коры, являющейся отходом при заготовке древесины. Кроме того, нами показано, что выделенные таким образом пектиновые полисахариды обладают мембраностабилизирующей активностью. Установлено, что пектин обладает свойством восстановителя ионов благородных металлов, в частности Ag(0), до нуль-валентного состояния с образованием устойчивой фазы металлического серебра с размерами частиц 3-27 нм, в результате чего образуется нанобиокомпозит, где пектин одновременно играет роль стабилизатора металлических частиц в наноразмерном состоянии.

Решение поставленных задач достигается следующим образом.

В качестве сырья для получения пектиновых полисахаридов используют многотоннажный отход деревоперерабатывающей промышленности - кору лиственницы сибирской {Larix sibirica Ledeb.) или кору лиственницы Гмелина (даурской) (Larix gmelinii Rupr. (Rupr.)), а также их смесь. Сырье обрабатывают последовательно этилацетатом для освобождения от липидных и фенольных соединений, затем водой для освобождения от танинов, далее для разрушения протопектина выдерживают в подкисленной щавелевой кислотой воде при рН 3,8-4,2 при температуре 45-52°С в течение 3-4 часов. Экстракцию пектиновых полисахаридов осуществляют водным раствором оксалата аммония, экстракт концентрируют, полисахариды осаждают 96%-ным этиловым спиртом, сушку целевого продукта ведут лиофильно.

Нами впервые доказано, что пектину, выделенному из коры лиственницы, свойственна мембраностабилизирующая активность, а также способность играть роль восстановителя ионов серебра, при этом результатом является образование нанобиокомпозитов, состоящих из наноразмерных частиц серебра, которые стабилизированы аморфной полисахаридной матрицей пектина.

Изучение мембраностабилизирующей активности пектиновых полисахаридов осуществлялось с помощью метода цейтрафферной компьютерной видеосъемки микроскопических объектов [ДАН, 2003, Т.389, № 2, С.283-285] с использованием в качестве мембранной модели изолированные из клеток растений вакуоли. На фиг.1 проиллюстрированы результаты экспериментов по влиянию пектина, выделенного из коры лиственницы посредством предлагаемого способа, на стабильность структуры мембран и их барьерные свойства. Результаты свидетельствуют о том, что период полураспада фракции изолированных вакуолей при действии водного раствора пектина с концентрацией 0,66 мг/мл увеличивается в 2,5 раза по сравнению с контролем. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что пектину свойственна мембраностабилизирующая активность.

На примере исследования редокс-реакций пектина из коры лиственницы с AgNO₃ установлено, что пектин восстанавливает Ag(I) до Ag(0). Кроме того, обнаружено, что в результирующих продуктах он является стабилизирующей матрицей частиц металлического серебра и их размер находится в диапазоне 3-27 нм.

Для получения наноразмерных металлических (Ag) частиц мы использовали методику, описанную в патенте [RU 2278669 "Средство, обладающее антимикробной активностью"]. Вместо арабиногалактана - полисахарида, полученного из древесины лиственницы, мы использовали выделенный из коры лиственницы по предлагаемому выше способу пектин. К 5% водному раствору пектина при интенсивном перемешивании добавляли водные растворы с содержанием нитрата серебра от 0,0058 до 0,294 моль/л и оставляли при комнатной температуре в течение 20-40 мин. После этого рН раствора доводили до 10-12. Для этого применяли 30% раствор гидроксида натрия. Полученные смеси выдерживали при температуре 20-90°С в течение 5-60 мин. Раствор фильтровали, и целевой продукт выделяли высаживанием фильтрата в этанол. Полученный осадок отфильтровывали и сушили в вакууме. В полученных образцах определяли по методу Фольгарда содержание серебра, которое варьировалось в зависимости от взятого количества нитрата серебра и условий реакции от 1,3 до 36,91% по массе.

Рентгенографический фазовый анализ (дифрактометр Дрон-3.0, Cu Кα) полученных образцов свидетельствует, что они представляют собой смесь рентгеноаморфной и кристаллической фаз. На дифракционной картине рентгеноаморфной фазы, соответствующей исходному пектину (фиг.2а), в интервале углов 2θ от 8 до 60Е наблюдается широкое гало с максимумом интенсивности при d~0.46 нм. При введении серебра на дифрактограммах продуктов реакции на фоне широкого отражения пектина появляются достаточно интенсивные, но уширенные линии, характерные для металлического серебра (фиг.2б). Расчет параметра элементарной ячейки серебра показывает, что в данных образцах его величина меньше, чем для массивного серебра, и меняется от 0.4036 до 0.4050 нм (∀0.0008 нм). При этом средние размеры областей когерентного рассеяния (ОКР), рассчитанные по формуле Селякова-Шеррара [Липсон Г., Стилл Г. Интерпретация порошковых рентгенограмм. - М.: Мир, 1972, 384 с.], находятся в области 3 нм. Полученные данные свидетельствуют о наличии в составе образцов наноразмерных (от 3 до 27 нм) частиц Ag(0), стабилизированных аморфной фазой - пектином.

Анализ полученных образцов посредством применения просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) (прибор LEO 906E) свидетельствует о том, что полученные нанобиокомпозиты состоят из изолированных частиц нуль-валентного серебра, некоторые из которых представлены в глобулярной форме. Их размер находится в интервале от 3 до 27 нм с преобладанием (до 80%) в области 8-9 нм.

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет выделить из отхода деревоперерабатывающей промышленности - коры лиственницы сибирской и/или лиственницы Гмелина пектиновые полисахариды, обладающие мембраностабилизирующими свойствами, а также проявляющие способность восстанавливать ионы благородных металлов до нуль-валентного состояния и при этом одновременно служащие стабилизирующей аморфной матрицей получаемых при этом нанобиокомпозитов.

Ниже приведены примеры получения пектина и экспериментального подтверждения его мембраностабилизирующих и восстанавливающих металлы свойств, а также его способности образовывать нанобиокомпозиты.

Пример 1.

Кору лиственницы сибирской {Larix sibirica Ledeb.) (100 г - а.с.н.) помещают в круглодонную колбу, снабженную мешалкой, обратным холодильником, термометром, заливают этилацетатом (гидромодуль 1:5-10) и помещают на водяную баню. Ведут экстракцию при температуре 60-70°С в течение 3 часов. Экстракт отфильтровывают с использованием вакуума. Процесс повторяют дважды. Далее проэкстрагированную этилацетатом кору заливают водой и выдерживают при перемешивании и при температуре 45-52°С в течение 3 часов. Водный экстракт отфильтровывают. Процесс повторяют дважды. Освобожденную таким образом от фенольных соединений, низкомолекулярных углеводов и танинов кору обрабатывают водным раствором щавелевой кислоты (рН 3,8-4,2) в соотношении сырье: раствор 1:7-10 при температуре 45-52°С в течение 3-4 часов. Экстракцию пектиновых полисахаридов проводят дважды 0,5-0,7% раствором оксалата аммония в соотношении 1: 8-12 при температуре 60-70°С в течение 3-5 часов. Далее экстракт концентрируют, осаждают 96% этанолом в соотношении экстракт-спирт 1:3-4, фильтруют, полученный осадок - пектиновые полисахариды, лиофильно высушивают. Выход целевого продукта - до 10% от а.с.н. исходного сырья.

Пример 2.

В качестве исходного сырья используют кору лиственницы Гмелина (даурской) (Larix gmelinii Rupr. (Rupr.)). Далее обработку осуществляют так же, как описано в примере 1. Выход целевого продукта - до 12% от а.с.н.

Пример 3.

В качестве сырья используют смесь коры лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и коры лиственницы Гмелина (даурской) (Larix gmelinii Rupr. (Rupr.)) - отход деревоперерабатывающего предприятия. Далее обработку осуществляют, как описано в примере 1. Выход целевого продукта - до 10% от а.с.н.

Характеристика целевого продукта - пектина из коры лиственницы приведена в таблице 1.

Пример 4.

Определение мембраностабилизирующих свойств пектина коры лиственницы

Мембранотропную активность оценивают по изменению динамики разрушения изолированных вакуолей по сравнению с контролем. Для этого применяют компьютерную обработку серии телевизионных изображений, отражающих динамику процесса разрушений вакуолей, полученных с помощью экспериментальной установки, которая состоит из инвертированного микроскопа (Биолам П-1) с коллектором на 12 микроскопических образцов, телевизионной камеры (КТП-67), фиксатора телевизионного кадра на базе приборного интерфейса КАМАК, персонального компьютера (ПК) и программного обеспечения. Через телевизионную камеру и фиксатор кадра в заданный момент времени изображение фракций изолированных вакуолей заносится в память ПК. Серию изображений обрабатывают с помощью специальной программы и по полученным данным вычисляют период полураспада изолированных вакуолей относительно контроля по формуле

Для проведения эксперимента вакуоли изолируют по методу [Саляев Р.К., Кузеванов В.Я., Озолина П.В. и др. // Физиология растений. 1982. Т.29. № 5. С.933-940] из клеток корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) в растворе, содержащем (мМ): 100 KCl, 5 ЭДТА, 15 HEPES / KOH, рН 8.3, аланин (до осмотической концентрации 1 Осм·кг^-1), переносят в микрокамеры и помещают в коллектор.

Инкубационный раствор содержит (мМ): 100 КС1, 15 HEPES / КОН, рН 7.3, аланин (до осмотической концентрации 1 Осм·кг^-1).

Результаты по наличию мембранотропной активности, полученные с использованием растворов пектина коры лиственницы с различной концентрацией, проиллюстрированы на фиг.1 и свидетельствуют, что ему свойственна мембраностабилизирующая активность.

Получение нанобиокомпозитов пектина с частицами металлического серебра.

Пример 5

К 2 мл водного раствора с содержанием пектина 0,1 г прибавляют 2 мл водного раствора с содержанием нитрата серебра 0,05 г (0,147 моль/л) и полученную смесь в течение 20 мин перемешивают с использованием магнитной мешалки при комнатной температуре. Измеряют рН полученного раствора 2,85, затем посредством добавления по каплям 30% водного раствора NaOH доводят рН до 12 и полученный раствор нагревают на кипящей водяной бане 20 мин, охлаждают, добавляют 96% этанол в избытке, при этом образуется осадок - искомый нанобиокомпозит «Пектин - Ag(0)», который отфильтровывают и высушивают в вакууме. Выход - 86,67%.

Содержание серебра в полученном нанобиокомпозите, определенное по методу Фольгарда, составляет 23,88% по массе.

Пример 6

К 2 мл водного раствора с содержанием пектина 0,1 г прибавляют 2 мл водного раствора с содержанием нитрата серебра 0,1 г (0,294 моль/л) и полученную смесь в течение 20 мин перемешивают с использованием магнитной мешалки при комнатной температуре. Измеряют рН полученного раствора 2,95, затем посредством добавления по каплям 30% водного раствора гидроксида натрия доводят рН до 12 и полученный раствор нагревают на кипящей водяной бане 20 мин, охлаждают, добавляют 96% этанол в избытке, при этом образуется осадок - искомый нанобиокомпозит «Пектин - Ag(0)», который отфильтровывают и высушивают в вакууме. Выход - 78,33%. Содержание серебра в полученном нанобиокомпозите, определенное по методу Фольгарда, составляет 36,61% по массе.

Данные рентгеноструктурного анализа и ПЭМ нанобиокомпозита «Пектин - Ag(0) (23,88 мас.%)» представлены на фиг.2а, 2б и фиг.3 и свидетельствуют, что в состав образца входят частицы Ag(0), стабилизированные пектином, находящимся в аморфной фазе. Параметр элементарной ячейки серебра равен 0,40500 нм, размеры областей ОКР находятся в области 3 нм. Результаты ПЭМ (фиг.3) свидетельствуют, что частицы Ag(0) имеют сферическую форму, некоторые из них обладают глобулярным характером и их размер находится в области от 3 до 27 нм.

В табл. 1приведена характеристика пектиновых полисахпридов.

Таблица 1. Характеристика пектиновых полисахаридов Сырье Выход, %* Содержание, %* белков галактуроновой кислоты Кора лиственницы сибирской 2-10 2-7 65-78 Кора лиственницы Гмелина 3,5-12 7-12 60-75 Кора смеси лиственниц сибирской и Гмелина 2 -10 2-10 60-70 * - диапазон данных представлен для пектиновых полисахаридов, выделенных из сырья, заготовленного в различное время года

Изобретение относится к способам получения пектиновых полисахаридов из древесных отходов и может быть использовано в пищевой, фармацевтической, химической и других отраслях промышленности. Кору лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и/или кору лиственницы даурской (Гмелина) (Larix gmelinii Rupr. (Rupr.)) подготавливают для полного извлечения пектиновых полисахаридов последовательной обработкой этилацетатом, водой и раствором щавелевой кислоты. Затем остаток коры экстрагируют раствором оксалата аммония при 60-70°С в течение 3-5 часов и концентрируют. Целевой продукт высаживают в 96% этанол и лиофильно высушивают. Предлагаемый способ позволяет получать из коры лиственницы пектиновые полисахариды с высоким выходом до 12%, обладающие мембраностабилизирующей активностью и свойством восстановителя ионов серебра из растворов солей до наноразмерных частиц нулевой валентности, причем во время реакции происходит образование нанобиокомпозита, сформированного из наночастиц серебра с размером 3-27 нм, которые стабилизированы аморфной матрицей - пектином. 4 н.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.

1. Способ получения пектиновых полисахаридов из коры лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и/или коры лиственницы даурской (Гмелина) (Larix gmelinii Rupr. (Rupr.)), включающий предварительную обработку сырья, экстракцию целевого продукта водным раствором оксалата аммония при 60-70°С в течение 3-5 ч, концентрирование, высаживание целевого продукта в 96%-ный этанол и лиофильную сушку, при этом предварительную обработку сырья ведут этилацетатом для удаления липидных и фенольных соединений, затем водой для удаления танинов, а затем щавелевой кислотой для разрушения протопектина.

2. Пектиновые полисахариды, полученные способом по п.1, обладающие мембраностабилизирующей активностью.

3. Нанобиокомпозиты серебра, в которых в качестве стабилизирующей матрицы используют пектиновые полисахариды по п.2.

4. Способ получения нанобиокомпозитов серебра по п.3, включающий восстановление серебра до металлических наноразмерных частиц из водных растворов соли серебра в присутствии гидроксида натрия с дальнейшим высаживанием в 96%-ный этанол, фильтрованием, отделением осадка и высушиванием, при этом в качестве восстановителя и стабилизатора серебра используют водный раствор пектинового полисахарида, а содержание серебра в нанокомпозите составляет от 23 до 37% с размерами частиц от 3 до 27 нм.