СТАБИЛЬНАЯ КЛЕТОЧНАЯ ЛИНИЯ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ЯИЧНИКА ЧЕЛОВЕКА SKOV-kat Российский патент 2010 года по МПК C12N5/71 C12N5/10 

Изобретение относится к биотехнологии и экспериментальной онкологии и может быть использовано для скрининга противоопухолевых препаратов in vivo, в частности для скрининга синтетических и природных веществ с потенциальной противоопухолевой активностью.

При отборе синтетических и природных веществ с потенциальной противоопухолевой активностью широко используется их тестирование на линиях опухолевых клеток in vivo.

Использование панелей многообразных по генетическим и фенотипическим признакам клеточных линий дает возможность максимально эффективного скрининга синтетических соединений, природных веществ и физических воздействий на предмет поиска их биологической активности на клеточном и молекулярном уровнях. Одним из направлений в противоопухолевой терапии является разработка препаратов с механизмами направленной доставки к раковым клеткам. При работе с опухолевыми моделями in vivo чрезвычайно важно иметь объективные методы наблюдения и контроля за опухолевыми клетками. За последние годы была развита область флуоресцентной томографии. Она позволяет наблюдать раковые образования неинвазивным методом, что особенно важно для детального анализа эффективности противораковых препаратов.

Известны раковые клеточные линии, обладающие гиперэкспрессией онкомаркера HER2/neu (Oncogene, 11; 19(53):6102-14, 2000):

- SKOV-3 - клеточная линия аденокарциномы яичника человека (J. Natl. Cancer Inst. 59, 221-226, 1977);

- SK-BR-3 - клеточная линия рака молочной железы человека (New York: Plenum Publishing Corp, pp.115-145, 1975).

Однако эти HER2/neu положительные линии не имеют выраженной флуоресценции, что делает их непригодными для прямого наблюдения с помощью флуоресцентной томографии.

Известны раковые клеточные линии, модифицированные зеленым флуоресцирующим белком GFP:

1) клеточные линии рака груди человека MF-7, MDA, МВ468, MDA-MB435;

2) человеческие клеточные линии рака простаты РС3, DU145;

3) клеточная линия глиобластомы человека 324;

4) клеточные линии рака легкого человека Anip-73, Н460;

5) клеточные линии рака толстой кишки человека Соlо-205, НСТ-15, WiDr;

6) клеточная линия рака желудка человека NVGC-4;

7) клеточная линия рака почки человека SN12C;

8) клеточная линия рака языка человека SCC-25;

9) клеточные линии меланомы человека LOX, SK-mel-5;

10) клеточная линия рака яичника китайского хомяка СНО-К1;

11) клеточная линия меланомы мыши В 16.

(WO/1998/049336,1 998).

Известны раковые клеточные линии, модифицированные красными флуоресцирующими белками:

- клеточная линия рака поджелудочной человека МIА-РаСа-2, модифицированная RFP (Clinical and Experimental Metastasis, Volume 21, Number 1 7-12, 2004);

- клеточная линия альвеолярной рабдомиосаркомы человека Rh30, модифицированная DsRed2 (Cell Proliferation, Vol.41 Issue 2 Page 365, 2008);

- клеточная линия меланомы B16F0, модифицированная RFP (Proceedings of the National Academy of Science, vol. 100, Issue 24, p.14259-14262, 2003);

- клеточная линия рака предстательной железы мыши ММТ060562, модифицированная RFP (Proceedings of the National Academy of Science, vol. 100, Issue 24, p.14259-14262, 2003);

- клеточная линия рака предстательной железы человека РС-3, модифицированная RFP (Proceedings of the National Academy of Science, vol. 100, Issue 24, p.14259-14262, 2003);

- клеточная линия рака толстой кишки НСТ-116, модифицированная RFP (Proceedings of the National Academy of Science, vol. 100, Issue 24, p.14259-14262, 2003).

Известна наиболее близкая к заявленной клеточная линия рака груди человека MDA-MB-231, модифицированная tdTomato (Neoplasia, 8(10): 796-806, 2006).

Известные флуоресцирующие линии не имеют гиперэкспрессии онкомаркера HER2/neu, в связи с чем они не могут быть использованы для скрининга синтетических противоопухолевых соединений и природных веществ с направленной доставкой к HER2/neu или направленным механизмом действия на HER2/neu.

Задачей изобретения является создание модельной клеточной линии, несущей онкомаркер HER2/neu и флуоресцирующей в дальней красной области, для расширенного анализа и скрининга in vivo веществ с направленной противоопухолевой активностью и детальных исследований результатов воздействий на данный тип рака in vivo.

Поставленная задача решается за счет клеточной линии аденокарциномы яичника человека SKOV-kat, гиперэкспрессирующей онкомаркер HER2/neu и флуоресцирующей в дальней красной области спектра 600-700 нм, для использования в скрининге противоопухолевых препаратов in vivo.

Для получения заявленной клеточной линии ген флуоресцирующего белка Katushka, содержащийся в векторной плазмиде pKatushka-N, вводят с помощью препарата Unifectin⁵⁶ (Унифект Групп) в линию раковых клеток SKOV-3 и проводят селекцию на антибиотике гентамицин G418 (Sigma).

Известно, что ткани животных более прозрачны для длинноволновых излучений (Neoplasia, 8(10): 796-806, 2006).

Белок Katushka флуоресцирует в дальнем красном спектре, имеет максимум флуоресценции при 635 нм и максимум поглощения при 588 нм и является самым ярким на длине волны свыше 650 нм, другие белки имеют 40-60% яркости Katushka в этом диапазоне волн (Nature Methods, 4, 741-746, 2007) - это делает его одним из лучших инструментов для наблюдения за привитыми опухолями в тканях живого организма при помощи флуоресцентной томографии.

После выведения клеток из криоконсервации они сохраняют флуоресценцию в полной мере. Измерение флуоресценции производят с помощью проточного цитофлуориметра (Beckman-Coulter, USA) (гистограммы 1, 2).

Клетки полученной линии SKOV-kat стабильно воспроизводят приобретенную флуоресценцию на протяжении полугода культивирования in vitro (более 500 генераций).

При помощи тест-системы на основе иммуноспецифичного прокрашивания (патент РФ №2303783, 2007) показывают наличие HER2/neu рецептора на поверхности трансфицированных клеток в количестве, идентичном для линии SKOV-3 (см. таблицу).

Клетки линии SKOV-kat обладают интенсивной флуоресценцией в дальней красной области спектра (600-700 нм) в отличие от исходных клеток линии SKOV-3 (гистограммы 1, 2).

Клетки линии SKOV-kat резистентны к антибиотику G418 в отличие от клеток исходной линии SKOV-3.

Клетки линии SKOV-kat имеют уровень экспрессии онкомаркера HER2/neu на поверхности, идентичный уровню экспрессии HER2/neu на поверхности SKOV-3.

Морфологические признаки

Клетки линии SKOV-kat морфологически сходны с клетками родительской линии SKOV-3 - клетками аденокарциномы яичника.

Культуральные свойства

Культура адгезионного типа. Во флаконы площадью 25 см² засевают 1.0-9.0×10⁵ клеток на 5 мл ростовой среды. Пассируют через каждые три дня. Клетки линии не требовательны к условиям культивирования и могут персистировать прикрепленными к планшету в виде монослоя.

Ростовая среда: среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM), L-glu, 10% сыворотка.

Маркерные признаки следующие.

- Гиперэкспрессия поверхностного антигена HER2/neu.

- Интенсивная флуоресценция в дальней красной области спектра (600-700 нм).

Криоконсервация.

Клетки линии SKOV-kat ресуспендируют в бессывороточной среде, содержащей

7, 5% диметилсульфоксида (ДМСО), в концентрации 2-10×10⁶ клеток/мл, разливают в пластиковые ампулы, помещают в теплоизолирующий материал (пенополиуретан) и переносят в низкотемпературный холодильник при -70°С на 24 часа, после первичного замораживания помещают на длительное хранение при -135°С. Размораживают быстро, при 37°С. Клетки разводят в 10 мл бессывороточной среды и осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл среды, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и переносят в культуральный флакон. Жизнеспособность клеток оценивают по адгезии на пластик в течение 20-50 часов.

Таким образом, полученная трансфицированная геном Katushka линия SKOV-kat обладает рядом качеств, существенно отличающих ее от исходной линии SKOV-3, а также от других раковых клеточных линий:

- клетки линии SKOV-kat резистентны к антибиотику G418 в отличие от клеток исходной линии SKOV-3;

- клетки линии SKOV-kat обладают значительной флуоресценцией в дальней красной области спектра (600-700 нм) в отличие от исходных клеток линии SKOV-3 (гистограммы 1, 2);

- клетки линии обладают гиперэкспрессией онкомаркера HER2/neu в отличие от других флуоресцирующих клеточных линий.

Изобретение иллюстрируют графические материалы

На фиг.1 - гистограмма 1.

Сравнительная характеристика флуоресценции клеточных линий SKOV-kat и SKOV-3 на 620 нм.

Данные с проточного цитофлуориметра (Beckman-Coulter,USA) представлены в виде гистограммы количества регистраций (клеток) от логарифма светимости, представленной в условных единицах светимости (у.е.с). В скобках указанно среднее значение флуоресценции, приведенное к 100 для SKOV-kat, усреднение проводилось по 10300 регистрациям.

На фиг.2 - гистограмма 2.

Сравнительная характеристика флуоресценции клеточных линий SKOV-kat и SKOV-3 на 675 нм.

Данные с проточного цитофлуориметра (Beckman-Coulter,US А) представлены в виде гистограммы количества регистраций (клеток) от логарифма светимости, представленной в условных единицах светимости (у.е.с). В скобках указанно среднее значение флуоресценции, приведенное к 100 для SKOV-kat, усреднение проводилось по 10300 регистрациям.

Изобретение иллюстрируют примеры.

Пример 1.

Получение клеточной линии.

Трансфекцию производят следующим образом: 200 нг плазмидной ДНК (ген флуоресцирующего белка Katushka, содержащийся в векторной плазмиде pKatushka-N) в 10 мкл среды Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (панэко) без сыворотки смешивают с 1 мкл Unifectin⁵⁶ (Унифект Групп) в 40 мкл (среды без сыворотки), инкубируют 15 минут и добавляют к клеткам SKOV-3 (расчет на 60 мм чашку, 70% монослоя). Через сутки после трансфекции в среду добавляют антибиотик G418 (Sigma)

в количестве 500 мкг/мл и продолжают добавлять в том же количестве каждые 5 дней, вместе со сменой среды. Через 20 дней в селективных условиях на чашках формируются флуоресцирующие колонии, которые отбирают с помощью платиновой петли в лунки планшета со средой и антибиотиком. Затем после формирования колонии проводят повторный отбор в лунки со средой без антибиотика. В течение 50 дней наблюдают стабильный уровень флуоресценции. Численный анализ флуоресценции производят с помощью проточной цитофлуометрии (гистограммы 1, 2). Для этого клетки снимают раствором Версена (Hyclone) и с помощью центрифугирования с частотой 800 об/мин клетки переводят в раствор PBS (КН₂РO₄ 1.7 mM; Na₂HPO₄ 5.2 mМ; NaCl 150 mМ) для наблюдения на приборе. Данные с проточного цитофлуориметра (Beckman-Coulter, USA) обрабатывают для 30000 регистраций.

Пример 2.

Демонстрация наличия клеточного маркера.

Клетки помещают в раствор PBS 0,5 млн кл./мл с молекулярными конструкциями 4D5-barnase-4D5+barstar-EGFP 4 мкг/мл и инкубируют 45 минут при +4°С. В качестве отрицательного контроля неспецифичного связывания используют клеточную линию HeLa (Cancer Res., 12: 264-265, 1952), а в качестве положительного контроля - исходную клеточную линию SKOV-3. Для численного анализа на проточном цитофлуориметре клетки снимают с планшета в растворе PBS (таблица). Данные с проточного цитофлуориметра (Beckman-Coulter, USA) обрабатывают для 30000 регистраций. Количество HER2/neu на поверхности клеток прямо пропорционально добавочному сигналу от красителя за вычетом неспецифического прокрашивания.

Клеточная линия SKOV-kat HER2/neu положительной аденокарциномы яичника человека, флуоресцирующая в дальней красной области спектра (600-700 нм), получена при трансфекции клеток линии SKOV-3 геном белка Katushka. Стабильная клеточная линия SKOV-kat в полной мере сохраняет фенотип HER2/neu положительной аденокарциномы яичника, а также продуцирует внутриклеточно флуоресцирующий белок Katushka. Клетки полученной флуоресцирующей линии воспроизводят приобретенный признак на протяжении не менее полугода культивирования in vitro.

Вышеуказанные свойства и результаты оценки данных свойств позволяют использовать клеточную линию SKOV-kat аденокарциномы яичника человека для скрининга противоопухолевых препаратов in vivo с направленным механизмом доставки к поверхностному онкомаркеру клетки HER2/neu.

Изобретение относится к биотехнологии и экспериментальной онкологии, в частности к стабильной клеточной линии аденокарциномы яичника человека SKOV-kat. Представленное изобретение может быть использовано для скрининга противоопухолевых препаратов in vivo, в частности для скрининга синтетических и природных веществ с потенциальной противоопухолевой активностью. Предложенное изобретение позволяет создать стабильную клеточную линию аденокарциномы яичника человека, несущую онкомаркер HER2/neu и флуоресцирующую в дальней красной области спектра 600-700 нм. 2 ил.

Стабильная клеточная линия аденокарциномы яичника человека SKOV-kat, устойчивая к антибиотику G418, гиперэкспрессирующая онкомаркер HER2/neu и флуоресцирующая в дальней красной области спектра 600-700 нм, полученная способом, включающим следующие стадии:
а. обеспечение плазмиды, содержащей ген флуоресцирующего белка Katushka;
b. трансфекция клеток SKOV-3 плазмидой, содержащей ген флуоресцирующего белка Katushka;
с. отбор флуоресцирующих колоний в среде в присутствии антибиотика G418;
d. повторный отбор флуоресцирующих колоний в среде в отсутствие антибиотика G418.