ПОЛИПЕПТИДНЫЙ МАРКЕР ДЛЯ ДИАГНОЗА АРТЕРИОСКЛЕРОЗА Российский патент 2010 года по МПК G01N33/68 

Настоящее изобретение относится к применению фактора присутствия или отсутствия одного или нескольких пептидных маркеров в пробе индивидуума для диагноза артериосклероза, а также к способу диагноза артериосклероза, причем присутствие или отсутствие пептидного маркера или пептидных маркеров является указанием на наличие артериосклероза.

Артериосклероз - или также атеросклероз, кальцинация сосудов, соответственно артерий - представляет собой наиболее частое болезненное изменение сосудов. Артериосклероз представляет собой изменение кровеносных сосудов, которое возникает в течение многих лет и сначала протекает нераспознаваемо. На стенках сосудов накапливаются содержащиеся в крови жировые вещества и лейкоциты (бляшкообразование), сосуды подвергаются кальцинации, теряют свою эластичность и в возрастающей степени сужается диаметр сосудов. В качестве факторов риска для возникновения артериосклероза считают гиперхолестеринемию, высокое кровяное давление, курение, сахарный диабет, ожирение, низкую физическую активность и низкий социальный статус, который, однако, тесно связан с другими факторами. Обсуждаются другие факторы риска, такие как гипертриглицеридемия, повышенные концентрации в крови липопротеина (а), гомоцистеина и определенных параметров воспаления, как с-реактивный белок (CRP) или фибриноген, а также пилорическая инфекция Chlamidien или Helicobacter.

Артериосклероз длительное время не вызывает никаких симптомов. Лишь когда диаметр сосуда за счет бляшки отчетливо уменьшается или в области бляшки образуется сгусток крови (тромб), возникают симптомы. Наиболее частыми артериосклеротическими сердечными и сосудистыми заболеваниями являются коронарная болезнь сердца, цереброваскулярные заболевания и периферическое артериальное облитерирующее заболевание, опасные осложнения которых, такие как инфаркт миокарда, инсульт или потеря нижних конечностей, в Германии встречаются чрезвычайно часто по сравнению с более бедными странами и являются причиной крайне высоких расходов на здравоохранение.

Обусловленные артериосклерозом сердечно-сосудистые заболевания, также называемые как кардиоваскулярные заболевания, находятся на самом первом месте в статистике причин смерти в Германии. Так, сердечно-сосудистые заболевания в 1999 г. по данным Статистического Федерального Ведомства ФРГ составили 48% наиболее частой причины смерти, причем ишемические (коронарные) болезни сердца составили 21% и заболевания цереброваскулярной системы составили 10%. По сравнению с этим доля раковых заболеваний со смертельным исходом составила 26%, в случае заболеваний дыхательной системы и пищеварительной системы доля составила 6%, соответственно 5%.

Хотя артериосклеротические изменения часто возникают уже в подростковом возрасте, клинические проявления чаще всего возникают в среднем и более старшем возрасте.

Артериосклероз нельзя лечить лекарствами, а только можно избегать его путем профилактики. Уже начавшиеся кальцинозы нельзя разрушать, ригидным стенкам сосудов нельзя возвращать эластичность. Однако можно отчетливо замедлять прогрессирование артериосклероза тем, что оказывают влияние на факторы риска путем изменения образа жизни, например путем никотиновой абстиненции, или медикаментозно (например, с помощью ацетилсалициловой кислоты). Наряду с этим, в случае тяжелых артериальных кальцинозов также существуют хирургические способы, как, например, баллонная дилатация (РТА, чрезкожная внутрипросветная ангиопластика), шунтирование и использование стентов.

Так как, как уже сообщалось, артериосклеротическое изменение нельзя лечить терапевтически, а только можно его избегать или замедлять, особенно важным является раннее распознавание артериосклеротических изменений.

В обычных условиях лишь диагноз заболевания, являющегося следствием предыдущего, допускает заключение, что пораженный индивидуум болен артериосклерозом. В настоящее время для этого выявляют сужения кровеносных сосудов, например, с помощью контрастных средств или рентгена или посредством ультразвука. Сверх того, обычно исследуют факторы риска, как, например, повышенные уровни холестерина или сахарный диабет. Все эти способы, однако, недостаточны для раннего и достоверного диагноза артериосклероза. В особенности существует потребность в, по возможности, малоинвазивном, быстром и требующем меньших затрат раннем распознавании артериосклероза.

В настоящее время неожиданно найдено, что определенные пептидные маркеры в пробе индивидуума можно использовать для диагноза артериосклероза.

Следовательно, объектом настоящего изобретения является применение фактора присутствия или отсутствия по меньшей мере одного полипептидного маркера в пробе индивидуума для диагноза артериосклероза, причем полипептидный маркер выбирают из полипептидных маркеров № 1, № 2, № 3, № 4, № 5, № 6, № 7, № 8 или № 9, которые характеризуются указанными в таблице 1 величинами молекулярной массы:

Таблица 1 Полипептидные маркеры для диагноза артериосклероза и их молекулярные массы Полипептидный маркер № Молекулярная масса [Да] 1 2511,8 2 1864,7 3 2799,8 4 1340,6 5 1422,8 6 5882,0 7 1397,4 8 1886,6 9 4642,6

При использовании настоящего изобретения можно очень рано диагностировать артериосклероз. Благодаря этому болезнь можно лечить на ранней стадии или до ее проявления с помощью известных лекарственных средств и, таким образом, ослаблять ее дальнейшее протекание. Согласно изобретению, далее, становится возможным требующий меньших затрат, быстрый и достоверный диагноз артериосклероза при отчасти без или только минимальных инвазивных вмешательствах.

Согласно особому варианту осуществления изобретения полипептидный маркер характеризуется не только своей молекулярной массой, но и также его временем миграции (см. таблицу 2):

Таблица 2 Полипептидные маркеры для диагноза артериосклероза, а также молекулярные массы и времена миграции Полипептидный маркер № Молекулярная масса [Да] Время миграции [мин] 1 2511,8 26,4 2 1864,7 49,2 3 2799,8 46,0 4 1340,6 66,7 5 1422,8 61,2 6 5882,0 33,3 7 1397,4 24,9 8 1886,6 44,7 9 4642,6 37,5

Время миграции определяют посредством капиллярного электрофореза (capillary electrophoresis, CE), как указано, например, в примере, в пункте 2. При этом используют стеклянный капилляр длиной 90 см с внутренним диаметром (ID) 75 мкм и наружным диаметром (OD) 360 мкм при напряжении 30 кВ. В качестве растворителя для пробы используют 30% метанола, 0,5% муравьиной кислоты в воде.

Известно, что время миграции при капиллярном электрофорезе может варьировать. Однако последовательность, с которой элюируются полипептидные маркеры, в случае любой используемой СЕ-системы обычно одинаковая. Для сбалансирования различий во времени миграции систему можно нормировать при использовании стандартов, для которых известны времена миграции. Этими стандартами могут быть, например, указанные в примерах полипептиды (см. пример, пункт 3 «Стандарты для СЕ-измерения»).

Характеристику полипептидных маркеров, которые указаны в таблицах 1-3, определяют посредством капиллярного электрофореза - масс-спектрометрии (capillary electrophoresis - mass spectrometry, CE-MS), способа, который подробно описан, например, Neuroff и др. (Rapid Communications in mass spectrometry, 20, 149-156 (2004)). Вариация молекулярных масс между отдельными измерениями или между различными масс-спектрометрами является относительно небольшой, обычно она находится в пределах ±0,1%, предпочтительно в пределах ±0,05%.

Предлагаемые согласно изобретению полипептидные маркеры представляют собой белки или пептиды или продукты расщепления белков или пептидов. Они могут быть химически модифицированы, например, путем посттрансляционных модификаций, как гликозилирование, фосфорилирование, алкилирование или образование дисульфидных мостиков, или могут быть изменены путем других реакций, например, в рамках реакции расщепления. Кроме того, полипептидные маркеры также могут быть химически изменены в рамках очистки проб, например окислены.

Исходя из параметров, которые определяют полипептидные маркеры (молекулярная масса и время миграции), путем известных в уровне техники способов можно идентифицировать последовательность соответствующих полипептидов.

Предлагаемые согласно изобретению полипептиды (см. таблицу 1 или 2) используют для диагностирования артериосклероза. Под диагнозом понимают процесс распознавания путем идентификации симптомов или феноменов заболевания или поражения. В настоящем случае по присутствию или отсутствию определенных полипептидных маркеров делают вывод о наличии артериосклероза. Для этого в пробе индивидуума определяют предлагаемые согласно изобретению полипептидные маркеры, причем по их присутствию или отсутствию можно сделать вывод о наличии артериосклероза. Присутствие или отсутствие полипептидного маркера можно определять любым, известным в уровне техники способом. Способы, которые можно использовать, указываются, например, далее.

Полипептидный маркер присутствует, когда его измеряемое значение является по меньшей мере таким же высоким, как пороговое значение. Если измеряемое значение находится ниже порогового значения, то полипептидный маркер отсутствует. Пороговое значение можно определять либо по высокой чувствительности способа измерения (предел обнаружения), либо можно находить опытным путем.

Согласно настоящему изобретению пороговое значение предпочтительно превышается, когда измеряемое значение пробы в отношении определенной молекулярной массы по меньшей мере вдвое выше, чем таковое холостой пробы (например, только буфер или растворитель), более предпочтительно измеряемое значение по меньшей мере втрое выше, еще более предпочтительно по меньшей мере в четыре раза выше и в высшей степени предпочтительно в пять раз выше, чем таковое холостой пробы.

Полипептидный маркер или полипептидные маркеры используют таким образом, что определяют его/их присутствие или отсутствие, причем присутствие или отсутствие является показательным для артериосклероза. Так, существуют полипептидные маркеры, которые обычно имеются у пациента с артериосклерозом (больной), как, например, полипептидные маркеры № 1, № 7, № 8 и № 9, однако отсутствуют у пробандов без артериосклероза (контроль). Сверх того, существуют полипептидные маркеры, которые имеются у индивидуумов без артериосклероза (контроль), однако более редко или вовсе не встречаются у индивидуумов с артериосклерозом. Это, например, полипептидные маркеры № 2, № 3, № 4, № 5 и № 6.

Таблица 3 Полипептидные маркеры для диагноза артериосклероза, их молекулярные массы и времена миграции, а также их присутствие или отсутствие у больных артериосклерозом пациентов и контролей
(подготовка проб и определение как описывается в примере) Полипептидный маркер № Молекулярная масса [Да] Время миграции [мин] больной контроль Δ 1 2511,8 26,4 0,60 0,00 0,60 2 1864,7 49,2 0,20 0,78 0,58 3 2799,8 46,0 0,20 0,78 0,58 4 1340,6 66,7 0,10 0,67 0,57 5 1422,8 61,2 0,00 0,56 0,56 6 5882,0 33,3 0,00 0,56 0,56 7 1397,4 24,9 0,50 0,00 0,50 8 1886,6 44,7 0,50 0,00 0,50 9 4642,6 37,5 0,50 0,00 0,50 больной доля индивидуумов с артериосклерозом, у которых полипептидный маркер имеется в пробе контроль доля индивидуумов без артериосклероза, у которых полипептидный маркер имеется в пробе Δ в сумме (больной-контроль)

Индивидуумом, у которого берут пробу, в которой определяют присутствие или отсутствие одного или нескольких полипептидных маркеров, может быть любой индивидуум, который может страдать артериосклерозом, например животное или человек. Предпочтительно в случае индивидуума речь идет о млекопитающем, таком как, например, собака, лошадь, кошка, и в высшей степени предпочтительно человек.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения для диагностирования артериосклероза используют не только один полипептидный маркер, но и комбинацию полипептидных маркеров, причем по их присутствию или отсутствию можно делать апостериорный вывод о наличии артериосклероза. Путем сравнения множества полипептидных маркеров можно уменьшать или избегать фальсификации окончательного результата за счет отдельных индивидуальных отклонений от типичной вероятности присутствия у больного или контрольного индивидуума.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения, следовательно, используют два полипептидных маркера из указанных в таблице 1 или 2 для диагноза артериосклероза. В особенности это комбинации полипептидных маркеров:

- № 1 и № 2, № 1 и № 3, № 1 и № 4, № 1 и № 5, № 1 и № 6, № 1 и № 7, № 1 и № 8, № 1 и № 9;

- № 2 и № 3, № 2 и № 4, № 2 и № 5, № 2 и № 6, № 2 и № 7, № 2 и № 8, № 2 и № 9;

- № 3 и № 4, № 3 и № 5, № 3 и № 6, № 3 и № 7, № 3 и № 8, № 3 и № 9;

- № 4 и № 5, № 4 и № 6, № 4 и № 7, № 4 и № 8, № 4 и № 9;

- № 5 и № 6, № 5 и № 7, № 5 и № 8, № 5 и № 9;

- № 6 и № 7, № 6 и № 8, № 6 и № 9;

- № 7 и № 8, № 7 и № 9; или

- № 8 и № 9.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения используют три полипептидных маркера из указанных в таблице 1 или в таблице 2 для диагноза артериосклероза. В особенности это комбинации полипептидных маркеров:

- № 1 и № 2 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 3, № 4, № 5, № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 1 и № 3 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 4, № 5, № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 1 и № 4 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 5, № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 1 и № 5 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 1 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 1 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2 и № 3 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 4, № 5, № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 2 и № 4 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 5, № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 2 и № 5 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 2 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 2 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 2 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 3 и № 4 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 5, № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 3 и № 5 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 3 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 3 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 3 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 4 и № 5 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 4 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 4 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 4 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 5 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 5 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 5 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 6 и № 7 в комбинации с № 8 или № 9;

- № 6 и № 8 в комбинации с № 9; или

- № 7 и № 8 в комбинации с № 9.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения используют четыре полипептидных маркера из указанных в таблице 1 или в таблице 2 для диагноза артериосклероза. В особенности это комбинации полипептидных маркеров:

- № 1, № 2 и № 3 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 4, № 5, № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 2 и № 4 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 5, № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 2 и № 5 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 2 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 2 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 2 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 1, № 3 и № 4 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 5, № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 3 и № 5 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 3 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 3 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 3 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 1, № 4 и № 5 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 4 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 4 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 4 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 1, № 5 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 5 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 5 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 1, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 6 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 1, № 7 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 2, № 3 и № 4 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 5, № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 2, № 3 и № 5 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 2, № 3 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 2, № 3 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 2, № 3 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 2, № 4 и № 5 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 2, № 4 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 2, № 4 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 2, № 4 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 2, № 5 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 2, № 5 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 2, № 5 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 2, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 2, № 6 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 2, № 7 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 3, № 4 и № 5 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 3, № 4 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 3, № 4 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 3, № 4 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 3, № 5 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 3, № 5 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 3, № 5 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 3, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 3, № 6 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 3, № 7 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 4, № 5 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 4, № 5 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 4, № 5 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 4, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 4, № 6 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 4, № 7 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 5, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 5, № 6 и № 8 в комбинации с № 9;

- № 5, № 7 и № 8 в комбинации с № 9; или

- № 6, № 7 и № 8 в комбинации с № 9.

Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения используют пять полипептидных маркеров из указанных в таблице 1 или в таблице 2 для диагноза артериосклероза. В особенности это комбинации полипептидных маркеров:

- № 1, № 2, № 3 и № 4 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 5, № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 3 и № 5 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 3 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 3 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 3 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 4 и № 5 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 4 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 4 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 4 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 5 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 5 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 2 и № 5, № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2 и № 6, № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или 3 9;

- № 1, № 2, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 3, № 4 и № 5 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 3, № 4 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 3, № 4 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 3, № 4 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 3, № 5 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 3, № 5 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 3, № 5 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 3, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 3, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 3, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 4, № 5 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 4, № 5 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 4, № 5 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 4, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 4, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 4, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 5, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 5, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 5, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 3, № 4 и № 5 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 2, № 3, № 4 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 2, № 3, № 4 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 2, № 3, № 4 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 3, № 5 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 2, № 3, № 5 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 2, № 3, № 5 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 3, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 2, № 3, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 3, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 4, № 5 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 2, № 4, № 5 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 2, № 4, № 5 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 4, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 2, № 4, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 4, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 5, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 2, № 5, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 5, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 3, № 4, № 5 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 3, № 4, № 5 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 3, № 4, № 5 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 3, № 4, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 3, № 4, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 3, № 4, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 3, № 5, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 3, № 5, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 3, № 5, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 3, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 4, № 5, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 4, № 5, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 4, № 5, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 4, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9; или

- № 5, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9.

Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения используют шесть полипептидных маркеров из указанных в таблице 1 или в таблице 2 для диагноза артериосклероза. В особенности это комбинации полипептидных маркеров:

- № 1, № 2, № 3, № 4 и № 5 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 6, № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 4 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 4 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 4 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 5 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 5 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 5 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 4, № 5 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 4, № 5 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 4, № 5 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 4, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 4, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 4, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 5, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 5, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 5, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 3, № 4, № 5 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 3, № 4, № 5 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 3, № 4, № 5 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 3, № 4, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 3, № 4, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 3, № 4, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 3, № 5, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 3, № 5, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 3, № 5, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 3, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 4, № 5, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 4, № 5, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 4, № 5, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 4, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 5, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 3, № 4, № 5 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 2, № 3, № 4, № 5 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 2, № 3, № 4, № 5 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 3, № 4, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 2, № 3, № 4, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 3, № 4, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 3, № 5, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 2, № 3, № 5, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 3, № 5, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 3, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 4, № 5, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 2, № 4, № 5, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 4, № 5, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 4, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 5, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 3, № 4, № 5, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 3, № 4, № 5, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 3, № 4, № 5, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 3, № 4, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 3, № 5, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 4, № 5, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9.

Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения используют семь полипептидных маркеров из указанных в таблице 1 или в таблице 2 для диагноза артериосклероза. В особенности это комбинации полипептидных маркеров:

- № 1, № 2, № 3, № 4, № 5 и № 6 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 7, № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 4, № 5 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 4, № 5 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 4, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 4, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 4, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 5, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 5, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 5, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 4, № 5, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 2, № 4, № 5, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 4, № 5, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 4, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 2, № 5, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 3, № 4, № 5, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 1, № 3, № 4, № 5, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 3, № 4, № 5, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 3, № 4, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 3, № 5, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 1, № 4, № 5, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 3, № 4, № 5, № 6 и № 7 в комбинации с одним из полипептидных маркеров № 8 или № 9;

- № 2, № 3, № 4, № 5, № 6 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 3, № 4, № 5, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 3, № 4, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 3, № 5, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9;

- № 2, № 4, № 5, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9; или

- № 3, № 4, № 5, № 6, № 7 и № 8 в комбинации с полипептидным маркером № 9.

Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения используют восемь полипептидных маркеров из указанных в таблице 1 или в таблице 2 для диагноза артериосклероза. В особенности это комбинации полипептидных маркеров:

- № 1, № 2, № 3, № 4, № 5, № 6, № 7 и № 8;

- № 1, № 2, № 3, № 4, № 5, № 6, № 7 и № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 4, № 5, № 6, № 8 и № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 4, № 5, № 7, № 8 и № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 4, № 6, № 7, № 8 и № 9;

- № 1, № 2, № 3, № 5, № 6, № 7, № 8 и № 9;

- № 1, № 2, № 4, № 5, № 6, № 7, № 8 и № 9;

- № 1, № 3, № 4, № 5, № 6, № 7, № 8 и № 9; или

- № 2, № 3, № 4, № 5, № 6, № 7, № 8 и № 9.

Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения используют девять полипептидных маркеров из указанных в таблице 1 или в таблице 2 для диагноза артериосклероза. В особенности это комбинации полипептидных маркеров:

- № 1, № 2, № 3, № 4, № 5, № 6, № 7, № 8 и № 9.

Дополнительно к вышеуказанным полипептидным маркерам в качестве маркера для диагноза артериосклероза можно использовать фактор присутствия или отсутствия по меньшей мере одного другого полипептида, если этот полипептид является показательным для артериосклероза или указывающим на отсутствие артериосклероза (контроль, например, здоровое состояние). Указанный полипептид состоит, например, из по меньшей мере десяти аминокислот, которые связаны пептидными связями. Предпочтительно пептид состоит из максимально 100 аминокислот. Далее, предпочтительно полипептид имеет молекулярную массу от примерно 500 Да до 15000 Да, еще более предпочтительно от примерно 750 Да до примерно 10000 Да, в особенности от примерно 1000 Да до примерно 7500 Да. При этом маркеры могут быть химически модифицированы, например, путем посттрансляционных модификаций, как гликозилирование, фосфорилирование, алкилирование или образование дисульфидных мостиков, или может быть изменен за счет других реакций, например, в рамках реакции расщепления. Кроме того, полипептидные маркеры могут быть также химически изменены, например окислены, в рамках очистки проб.

В случае пробы, в которой определяют присутствие или отсутствие предлагаемого согласно изобретению полипептидного маркера или предлагаемых согласно изобретению полипептидных маркеров, речь может идти о любой пробе, которую получают из организма индивидуума. В случае пробы это может быть проба, имеющая полипептидный состав, который пригоден для получения показаний о состоянии индивидуума (больной артериосклерозом или здоровый, то есть индивидуум без артериосклероза). Например, это может быть кровь, моча, синовиальная жидкость, тканевая жидкость, секрет организма, пот, спинномозговая жидкость, лимфа, кишечный сок, желудочный сок, панкреатический сок, желчь, слезы, тканевая проба, сперма, вагинальная жидкость или проба кала. Предпочтительно проба является жидкой пробой.

Согласно предпочтительному варианту осуществления в случае пробы она является пробой мочи или пробой крови, наиболее предпочтительной является проба сыворотки или плазмы крови.

Пробы мочи предпочтительно отбирают в соответствии с уровнем техники. Предпочтительно, согласно настоящему изобретению, в качестве пробы мочи используют среднюю часть мочи при мочеиспускании. Пробу мочи можно отбирать также, например, с помощью мочеприемника, как описывается в Международной заявке WO-01/74275.

Пробы крови можно отбирать известными в уровне техники способами, например из вены, артерии или капилляра. Обычно пробу крови получают тем, что у индивидуума берут венозную кровь с помощью шприца, например, из руки. Понятие «проба крови» также включает пробы, которые получают из крови путем дальнейших способов очистки и разделения, как, например, плазма крови или сыворотка крови.

Плазму крови получают из крови тем, что удаляют клеточные компоненты, например, путем центрифугирования. Центрифугирование можно осуществлять, например, в присутствии антикоагулянтов, таких как, например, цитрат натрия, так как в плазме еще находятся факторы свертывания. Сыворотка крови по существу соответствует плазме крови, из которой удалены активные в отношении свертывания белки - главным образом, фибриноген, например, путем свертывания крови.

Способы получения плазмы крови и сыворотки крови общеизвестны в уровне техники. Кроме того, в Международной заявке WO-04/65958 описывается способ удаления фибриногена из плазмы. Составы для отделения сыворотки или плазмы описываются, например, в Международной заявке WO-03/48764 (см. также патент США 2004/129631). Устройства и способы для аккумуляции проб плазмы или сыворотки из крови описываются, например, в патенте США 2004/31746.

Присутствие или отсутствие полипептидного маркера в пробе можно определять любым известным в уровне техники способом, который пригоден для определения полипептидных маркеров. Специалисту такие способы известны. В принципе, присутствие или отсутствие полипептидного маркера можно определять прямыми способами, как, например, масс-спектрометрия, или непрямыми способами, как, например, с помощью лигандов.

Если необходимо или желательно, пробу, взятую у индивидуума, например пробу мочи или крови, перед определением присутствия или отсутствия полипептидного маркера или полипептидных маркеров можно подвергать предварительной обработке любым пригодным средством и, например, подвергать очистке или разделению. Обработка может включать, например, очистку, разделение, разведение или концентрирование. Способами могут быть, например, центрифугирование, фильтрация, ультрафильтрация, диализ, осаждение или хроматографические способы, как аффинное разделение или разделение посредством ионообменной хроматографии, электрофоретическое разделение, то есть разделение за счет различного характера миграции электрически заряженных частиц в растворе при наложении электрического поля. Конкретными примерами этого являются гель-электрофорез, двухмерный электрофорез в полиакриламидном геле (2D-PAGE), капиллярный электрофорез, металлаффинная хроматография, иммобилизованная металлаффинная хроматография (IMAC), аффинная хроматогрфия на основе лектинов, жидкостная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), обычная и с обращенной фазой ВЭЖХ, катионообменная хроматография и селективное связывание с поверхностями. Все эти способы хорошо известны специалисту и специалист может выбрать способ в зависимости от используемой пробы и способа определения присутствия или отсутствия полипептидного маркера или полипептидных маркеров.

Согласно одному варианту осуществления изобретения пробу, перед ее разделением, подвергают разделению посредством капиллярного электрофореза, очищают путем ультрацентрифугирования и/или посредством ультрафильтрации разделяют на фракции, которые содержат полипептидные маркеры определенной молекулярной величины.

Для определения присутствия или отсутствия полипептидного маркера предпочтительно используют масс-спектрометрический способ, причем к этому способу может быть предвключена очистка или разделение пробы. Масс-спектрометрический анализ, по сравнению с распространенными в настоящее время способами, имеет то преимущество, что концентрацию многих (>100) полипептидов в пробе можно определять путем единственного анализа. Можно использовать любой тип масс-спектрометра. С помощью масс-спектрометрии из комплексной смеси можно определять обычно 10 фмоль полипептидного маркера, следовательно, 0,1 нг белка массой 10 кДа, с точностью измерения примерно ±0,01%. В случае масс-спектрометров устройство для образования ионов связано с пригодным анализатором. Например, чаще всего используют интерфейсные блоки для ионизаций электронным распылением (ESI) в целях определения ионов из жидких проб, тогда как лазерную матрично-десорбционную ионизацию (MALDI) чаще всего используют для получения ионов из индивидуально приготовленных проб. Коммерчески доступны различные типы анализаторов, например анализаторы типа ионной ловушки или времяпролетные (TOF) анализаторы. Как ESI, так и также MALDI по существу можно комбинировать с любыми типами масс-спектрометров, хотя ESI обычно комбинируют с ионными ловушками, а MALDI комбинируют с TOF.

В случае ионизации электронным распылением (ESI) находящиеся в растворе молекулы распыляются, в частности, под влиянием высокого напряжения (например, 1-8 кВ), причем сначала образуются заряженные капельки, которые за счет испарения растворителя становятся меньше. Наконец, происходит образование свободных газообразных ионов.

В случае масс-спектрометрии при использовании времяпролетного масс-спектрометра (TOF) прикладывают определенное ускоряющее напряжение, которое придает ионам одинаково большую кинетическую энергию. Затем очень точно измеряют время, которое необходимо соответствующим ионам для прохождения определенного дрейфового участка по пролетной трубе, так как при одинаковой кинетической энергии скорость ионов зависит от их массы. TOF-Масс-спектрометры имеют очень высокую скорость сканирования и поэтому достигают хорошего разрешения.

Предпочтительные способы определения присутствия или отсутствия полипептидных маркеров включают газофазную ионную спектрометрию, как масс-спектрометрия с лазерной десорбцией/ионизацией, SELDI-TOF-масс-спектрометрия (времяпролетная масс-спектрометрия с поверхностно-усиленной лазерной десорбцией/ионизацией), MALDI-TOF-масс-спектрометрия (времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной матрично-десорбционной ионизацией), 2D-PAGE-масс-спектрометрия и капиллярный электрофорез - масс-спектрометрия (СЕ-MS).

2D-PAGE обычно используют для разделения полипептидов и его можно использовать вместе с масс-спектрометрией для идентификации отдельных полипептидов (2D-PAGE/MS). Посредством 2D-PAGE можно распознавать свыше 1000 белковых сайтов. Однако каждый отдельный полипептидный сайт нужно идентифицировать отдельно с помощью масс-спектрометрического способа.

В SELDI-системе важнейшим компонентом является белковый чип. Анализируемые пробы наносят прямо на находящиеся на матрицах участки. Существуют различные матрицы, как, например, хроматографические матрицы, которые представляют собой гидрофобные, гидрофильные, катионообменные, анионообменные и иммобилизованные поверхности с аффинностью к ионам металлов, и предактивированные матрицы с химическими группами, которые позволяют осуществляться ковалентному связыванию. Предпочтительны катионообменные поверхности. В случае SELDI-способа определяют только полипептиды, которые фактически связываются с поверхностью чипа. После связывания полипептидов проб используют абсорбирующий энергию матрикс на каждом участке. После кристаллизации матрикса совокупность белковый чип-матрица оценивают, как правило, в используемом для анализа устройстве для считывания белкового чипа.

Устройством для считывания является TOF-(времяпролетный)-масс-спектрометр, в котором белки десорбируются и ионизируются с помощью лазера. Так как подвергнувшиеся кристаллизации белки одинаково распределяются на поверхности участка, ионизирующий лазерный луч всегда касается репрезентативного сечения молекул в аналитах, что позволяет осуществлять количественное определение. После ионизации полипептиды повергают ускорению в электрическом поле прежде, чем они попадают в детектор. Продолжительность касания лазерного облучения поверхности матрицы вплоть до появления молекулы в детекторе позволяет осуществлять точное определение молекулярной массы полипептида в пробе (см., например, следующую обзорную статью Merchant M. Weinberger S.R., Electrophoresis, 212, 1164-1177 (2000)).

Особенно предпочтительным способом является СЕ-MS, в случае которого капиллярный электрофорез связан с масс-спектрометрией. Этот способ подробно описывается, например, в заявке на патент ФРГ 10021737, в статьях Kaiser и др. (J. Chromatogr. А, 1013, 157-171 (2003), а также Electrophoresis, 25, 2044-2055 (2004)) и в статье Wittke и др. (Journal of Chromatography A, 1013, 173-181 (2003)). СЕ-MS-Способ позволяет с высокой селективностью определять наличие сотен полипептидных маркеров одновременно в течение короткого времени и в незначительном объеме. После того как полипептидсодержащая проба исследована, готовят образец измеренного полипептидного маркера и его можно сравнивать с образцом больного, соответственно, здорового человека. В большинстве случае для диагноза артрита достаточно использовать только один или ограниченное число полипептидных маркеров. В особенности можно определять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 полипептидных маркеров, указанных в таблице 1 или 2, предпочтительно в вышеуказанных комбинациях полипептидных маркеров. Далее, предпочтителен CE-MS-способ, который включает капиллярный электрофорез, связанный, например, в режиме он-лайн с ESI-TOF-анализатором. В этом случае пробу вносят капилляр для электрофореза и прикладывают напряжение, например, вплоть до 50 кВ, в особенности вплоть до 30 кВ.

Для CE-MS предпочтительным является использование летучих растворителей и лучше всего работать в по существу бессолевых условиях. Примеры таких растворителей включают ацетонитрил, изопропанол, метанол и подобное. Растворители можно смешивать с водой или слабой кислотой (например, 0,1% муравьиная кислота) для протонирования аналитов. Полипептидные маркеры в пробе разделяются по их величине и заряду, которые определяют время пролета в капилляре.

С помощью капиллярного электрофореза молекулы можно разделять по их заряду и величине. При подводе тока нейтральные частицы мигрируют со скоростью электроосмотического потока, катионы ускоряются по направлению к катоду, а анионы замедляются. Преимущество капилляров при электрофорезе состоит в благоприятном соотношении поверхности к объему, что делает возможным хороший отвод выделяющегося при прохождении тока джоулева тепла. Это, в свою очередь, позволяет прикладывать высокие напряжения (обычно вплоть до 30 кВ) и вместе с тем достигать высокой разделительной мощности и короткого времени анализа.

В случае капиллярного электрофореза, как правило, используют капилляры из кварцевого стекла. Путем использования капилляров с узкой шириной в свету избегают как радиальной диффузии, так и также конвекции. Для того чтобы при приложенном напряжении возникающее в капилляре за счет прохождения тока тепло можно было в достаточной мере отводить в окружающую среду, внутренние диаметры капилляров должны быть небольшими. Используют, как правило, капилляры с внутренними диаметрами 50-75 мкм. Используемые длины составляют, например, 30-100 см. В случае капилляров с этими размерами, как правило, обеспечивается то, что повышение температуры в капилляре за счет высвобождающегося ионного тепла не приводит к образованию газовых пузырей в капилляре. Сверх того, разделительные капилляры, как правило, состоят из покрытого пластмассовой оболочкой кварцевого стекла. Капилляры могут быть как необработанными, то есть на внутренней стороне обладают присущими им гидрофобными группами, так и также на внутреннюю сторону может быть нанесено покрытие. Гидрофобное покрытие можно использовать для улучшения степени разделения. Дополнительно к напряжению можно прикладывать также давление, которое обычно находится в пределах 0-1 фунт/дюйм². Давление также можно прикладывать только во время применения или тем временем изменять.

Для улучшения степени разделения во время загрузки можно использовать протокол «штабелирования»: перед загрузкой пробы загружают основание, затем пробу, затем кислоту. Таким образом, ионы аналита находятся между кислотой и основанием. Когда прикладывают напряжение, положительно заряженные ионы аналита движутся в направлении основания. Там они заряжаются отрицательно и движутся в противоположном направлении, где они заряжаются положительно. Это повторяется вплоть до нейтрализации кислот и оснований. Таким образом получают концентрированную пробу. Перед загрузкой пробу можно разводить с помощью пригодного буфера.

Для определения разделенных посредством капиллярного электрофореза полипептидных маркеров устройство для капиллярного электрофореза предпочтительно связывают с масс-спектрометром. Масс-спектрометрия позволяет осуществлять определение молекулярных масс свободных ионов в высоком вакууме. Масс-спектрометр содержит анализатор масс, который разделяет ионы по их соотношению массы к заряду (m/z), и детектор.

Согласно другому предпочтительному способу определения полипептидных маркеров в пробе полипептидные маркеры пробы разделяют посредством капиллярного электрофореза, затем прямо ионизируют и для определения переводят в режиме он-лайн через интерфейсный блок в связанный с ним масс-спектрометр.

Другим объектом настоящего изобретения является способ диагноза артериосклероза:

а) определение присутствия или отсутствия по меньшей мере одного полипептидного маркера в пробе индивидуума, причем полипептидный маркер определен как в п. 1 или 2 формулы изобретения, и

b) установление вероятности наличия артериосклероза у индивидуума, причем

i) когда вероятность присутствия полипептидного маркера у больного индивидуума выше, чем вероятность присутствия этого полипептидного маркера у контрольного индивидуума, тогда присутствие полипептидного маркера указывает на более высокую вероятность наличия артериосклероза;

ii) когда вероятность присутствия полипептидного маркера у больного индивидуума ниже, чем вероятность присутствия полипептидного маркера у контрольного индивидуума, тогда отсутствие полипептидного маркера указывает на более высокую вероятность наличия артериосклероза;

iii) когда вероятность присутствия полипептидного маркера у больного индивидуума выше, чем вероятность присутствия этого полипептидного маркера у контрольного индивидуума, тогда отсутствие полипептидного маркера указывает на более высокую вероятность отсутствия артериосклероза; или

iv) когда вероятность присутствия полипептидного маркера у больного индивидуума ниже, чем вероятность присутствия полипептидного маркера у контрольного индивидуума, тогда присутствие полипептидного маркера указывает на более высокую вероятность отсутствия артериосклероза.

Согласно одному варианту осуществления предлагаемого в изобретении способа вероятности в случае стадии b) в отношении присутствия полипептидного маркера у больного артериосклерозом индивидуума (пациенты), соответственно у контрольного индивидуума являются следующими:

Полипептидный маркер № Молекулярная масса [Да] Время миграции [мин] Вероятность присутствия полипептидного маркера у больного индивидуума у контрольного индивидуума 1 2511,8 26,4 0,60 0,00 2 1864,7 49,2 0,20 0,78 3 2799,8 46,0 0,20 0,78 4 1340,6 66,7 0,10 0,67 5 1422,8 61,2 0,00 0,56 6 5882,0 33,3 0,00 0,56 7 1397,4 24,9 0,50 0,00 8 1886,6 44,7 0,50 0,00 9 4642,6 37,5 0,50 0,00

Согласно предпочтительному варианту осуществления контрольный индивидуум не является больным артериосклерозом индивидуумом. Согласно еще другому предпочтительному варианту осуществления, он является человеком без артериосклероза.

Согласно предлагаемому в изобретении способу предпочтительнее можно использовать для диагноза несколько полипептидных маркеров. В особенности можно использовать по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 полипептидных маркеров, указанных в таблице 1 или таблице 2. Далее, еще более предпочтительно в случае комбинаций полипептидных маркеров ими являются вышеуказанные комбинации.

Для определения вероятности наличия артериосклероза при использовании нескольких маркеров специалист может использовать известные статистические способы. Например, можно использовать описанный Weissinger и др. (Kidney Int., 65(6), 2426-24 (2004, июнь) способ (статистический Forests-способ) при использовании компьютерной программы, как, например, S-Plus.

Согласно предлагаемому в изобретении способу присутствие полипептидных маркеров № 1, № 7, № 8 и/или № 9 в пробе и/или отсутствие полипептидных маркеров № 2, № 3, № 4, № 5 и/или № 6 в пробе указывает на наличие артериосклероза.

Для определения присутствия или отсутствия в случае предлагаемого согласно изобретению способа можно использовать вышеуказанные способы очистки, разделения и обнаружения. Для обнаружения присутствия или отсутствия полипептидного маркера или полипептидных маркеров предпочтительно используют капиллярный электрофорез, газофазную ионную спектрометрию и/или масс-спектрометрию.

Согласно особенно предпочтительному варианту осуществления перед измерением молекулярной массы полипептидных маркеров осуществляют капиллярный электрофорез и/или используют масс-спектрометрию с целью обнаружения присутствия или отсутствия полипептидного маркера или полипептидных маркеров.

Пример

1. Подготовка проб

Для определения полипептидных маркеров с целью обнаружения артериосклероза использовали плазму. Плазму получали от здоровых доноров (контроль), а также пациентов с обязательным диализом, которые страдают артериосклерозом. Для взятия плазмы у здоровых доноров использовали S-Monovetten с гепарином (Sarstedt, Nürnbrecht, ФРГ), у подвергаемых диализу пациентов прямо отбирали плазму, так как их уже обрабатывали гепарином. Гепарин при этом служит для избежания свертывания крови и протеолитической активности и вместе с тем также для защиты содержащихся в плазме белков и пептидов от расщепления ферментами.

Для последующего СЕ-MS-измерения имеющиеся в плазме в очень высокой концентрации белки, как альбумин и иммуноглобулины, нужно было отделять путем ультрафильтрации. Для этого отбирали 500 мкл плазмы и смешивали с 2 мл буфера для фильтрации (4 моль/л мочевины, 0,1 моль/л NaCl, 0,01% аммиака). Эти объемы проб, составляющие 2,5 мл, подвергали ультрафильтрации (Centrisart 20 MWCO, Vivascience, Hannover, ФРГ). Ультрафильтрацию осуществляли в центрифуге при скорости 3400 оборотов в минуту вплоть до получения 2 мл ультрафильтрата.

Полученные 2 мл фильтрата затем вносили в колонку Pharmacia C-2 (Pharmacia, Uppsala, Швеция) для удаления мочевины, солей и других мешающих компонентов. Связанные полипептиды затем элюировали из С-2-колонки с помощью 50% ацетонитрила, 0,5% муравьиной кислоты в воде и лиофилизировали. Для СЕ-MS-измерения полипептиды затем ресуспендировали в 20 мкл воды (ВЭЖХ-чистота, Merk, Darmstadt, ФРГ).

2. СЕ-MS-Измерение

СЕ-MS-Измерения осуществляли с помощью системы для капиллярного электрофореза фирмы Beckman Coulter (P/ACE MDQ System; Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA, США) и ESI-TOF-масс-спектрометра фирмы Applied Biosystems (Mariner Biospectrometry Workstation; Applied Biosystems, Foster City, CA, США).

СЕ-Капилляры получали от фирмы Beckman Coulter (см. выше), они имели соотношение ID/OD, равное 75/360 мкм, и длину 90 см. Подвижная фаза для СЕ-разделения состояла из 30% метанола и 0,5% муравьиной кислоты в воде, такую же смесь использовали для «Sheath-Flow» в масс-спектрометре, в этом случае с расходом 2 мкл/мин. Связывание СЕ и MS осуществляли с помощью набора CE-ESI-MS Sprayer Kit (Agilent Technologies, Waldbronn, ФРГ).

Для инжекции 1 мкл пробы прикладывали давление 1 фунт/дюйм², продолжительность инжекции составляла 20 секунд. При использовании этих параметров в капилляр инжектировали примерно 100 нл пробы, это соответствует примерно 0,25% объема капилляра. Для концентрирования пробы в капилляре использовали технологию «штабелирования». При этом перед инжекцией пробы за 7 секунд (при давлении 1 фунт/дюйм²) инжектировали 1 моль/л NH₃, после инжекции пробы за 5 секунд вводили 2 моль/л раствора муравьиной кислоты. При приложении разделительного напряжения (30 кВ) аналиты автоматически концентрировали между этими растворами.

Следующее СЕ-разделение осуществляли по методу давления: 40 минут при давлении 0 фунт/дюйм², затем 2 минуты при давлении 0,1 фунт/дюйм², 2 минуты при давлении 0,2 фунт/дюйм², 2 минуты при давлении 0,3 фунт/дюйм², 2 минуты при давлении 0,4 фунт/дюйм², затем 32 минуты при давлении 0,5 фунт/дюйм². Общая продолжительность процесса разделения составила тем самым 80 минут.

Для получения со стороны MS по возможности хорошей интенсивности сигнала устраняли газ-распылитель. Прилагаемое к игле-распылителю напряжение для создания электроспрея составляло 3200 В, вследствие чего в результате достигали имеющегося распылительного напряжения по всему капилляру примерно 27 кВ. Остальные регулировки в случае Mariner-масс-спектрометра оптимизировали согласно указанию изготовителя для детектирования пептида. Спектры снимали в области масс от m/z 400 до m/z 2500 и все аккумулировали в течение 3 секунд.

3. Стандарты для СЕ-измерения

Для контроля и стандартизации СЕ-измерения использовали следующие белки, соответственно, полипептиды, которые характеризуются указанными СЕ-временами миграции:

(их можно использовать для нормирования СЕ-времен пептидных маркеров 1-9, а также измеряемых проб)

время миграции белок/полипептид

апротинин (SIGMA, Taufkirchen, ФРГ, регистрационный номер AI 153): 9,2 мин

рибонуклеаза (SIGMA, Taufkirchen, ФРГ, регистрационный номер R4875): 10,9 мин

лизозим (SIGMA, Taufkirchen, ФРГ, регистрационный номер L7651): 8,9 мин

“REV”, последовательность: REVQSKIGYGRQIIS: 15,6 мин

“ELM”, последовательность: ELMTGELPYSHINNRDQIIFMVGR: 23,4 мин

“KINCON”, последовательность: TGSLPYSHIGSRDQIIFMVGR: 20,0 мин

“GIVLY”, последовательность: GIVLYELMTGELPYSHIN: 36,8 мин.

Белки/полипептиды использовали, соответственно, в концентрации 10 пмоль/мкл в воде.

“REV”, “ELM”, “KINCON” и “GIVLY” представляют собой синтетические пептиды.

Молекулярные массы пептидов, а также найденные согласно масс-спектру массы отдельных заряженных состояний являются следующими:

Изобретение относится к области биологии и медицины, а именно к молекулярно-биологическим методам диагностики. Предложен способ диагноза артериосклероза, основанный на выявлении различных комбинаций определенных полипептидных маркеров. Для обнаружения присутствия или отсутствия полипептидного маркера используют капиллярный электрофорез, газофазную ионную спектрометрию и/или масс-спектрометрию. Способ позволяет с высокой вероятностью распознавать артериосклероз на ранней стадии при минимальных инвазивных вмешательствах. 12 з.п. ф-лы, 1 пр., 5 табл.

1. Способ диагноза артериосклероза, включающий стадии:
а) определение присутствия или отсутствия по меньшей мере одного полипептидного маркера в пробе индивидуума, причем полипептидный маркер выбирают из полипептидных маркеров № 1, № 2, № 3, № 4, № 5, № 6, № 7, № 8 или № 9, которые характеризуются следующими величинами молекулярной массы:
Полипептидный маркер № Молекулярная масса (Да) 1 2511,8 2 1864,7 3 2799,8 4 1340,6 5 1422,8 6 5882,0 7 1397,4 8 1886,6 9 4642,6

и
b) установление вероятности наличия артериосклероза у индивидуума, причем
i) когда вероятность присутствия полипептидного маркера у больного индивидуума выше, чем вероятность присутствия этого полипептидного маркера у контрольного индивидуума, тогда присутствие полипептидного маркера указывает на более высокую вероятность наличия артериосклероза;
ii) когда вероятность присутствия полипептидного маркера у больного индивидуума ниже, чем вероятность присутствия полипептидного маркера у контрольного индивидуума, тогда отсутствие полипептидного маркера указывает на более высокую вероятность наличия артериосклероза;
iii) когда вероятность присутствия полипептидного маркера у больного индивидуума выше, чем вероятность присутствия этого полипептидного маркера у контрольного индивидуума, тогда отсутствие полипептидного маркера указывает на более высокую вероятность отсутствия артериосклероза; или
iv) когда вероятность присутствия полипептидного маркера у больного индивидуума ниже, чем вероятность присутствия полипептидного маркера у контрольного индивидуума, тогда присутствие полипептидного маркера указывает на более высокую вероятность отсутствия артериосклероза.

2. Способ по п.1, где полипептидный маркер выбирают из полипептидных маркеров № 1, № 2, № 3, № 4, № 5, № 6, № 7, № 8 или № 9, которые характеризуются следующими величинами молекулярной массы и значениями времени миграции:
Полипептидный маркер № Молекулярная масса (Да) Время миграции (мин) 1 2511,8 26,4 2 1864,7 49,2 3 2799,8 46,0 4 1340,6 66,7 5 1422,8 61,2 6 5882,0 33,3 7 1397,4 24,9 8 1886,6 44,7 9 4642,6 37,5

3. Способ по п.1 или 2, где отдельные вероятности в случае стадии b) являются следующими:
Полипептидный маркер № Вероятность присутствия полипептидного маркера у больного индивидуума у контрольного индивидуума 1 0,60 0,00 2 0,20 0,78 3 0,20 0,78 4 0,10 0,67 5 0,00 0,56 6 0,00 0,56 7 0,50 0,00 8 0,50 0,00 9 0,50 0,00

4. Способ по п.1 или 2, где используют по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 полипептидных маркеров.

5. Способ по п.1 или 2, где используют комбинацию по меньшей мере двух полипептидных маркеров, в особенности, полипептидных маркеров:
№ 1 и № 2, № 1 и № 3, № 1 и № 4, № 1 и № 5, № 1 и № 6, № 1 и № 7, № 1 и № 8, № 1 и № 9;
№ 2 и № 3, № 2 и № 4, № 2 и № 5, № 2 и № 6, № 2 и № 7, № 2 и № 8, № 2 и № 9;
№ 3 и № 4, № 3 и № 5, № 3 и № 6, № 3 и № 7, № 3 и № 8, № 3 и № 9;
№ 4 и № 5, № 4 и № 6, № 4 и № 7, № 4 и № 8, № 4 и № 9;
№ 5 и № 6, № 5 и № 7, № 5 и № 8, № 5 и № 9;
№ 6 и № 7, № 6 и № 8, № 6 и № 9;
№ 7 и № 8, № 7 и № 9; или
№ 8 и № 9;
и причем полипептидные маркеры определены в п.1 или 2.

6. Способ по п.1, где используют по меньшей мере один другой полипептид в качестве маркера.

7. Способ по п.1, где время миграции определяют путем капиллярного электрофореза при 30 кВ при использовании подвижной фазы из 30 об.% метанола, 0,5 об.% муравьиной кислоты в воде в капилляре длиной 90 см.

8. Способ по п.1, где проба индивидуума представляет собой пробу мочи или пробу крови, в особенности, пробу сыворотки или пробу плазмы.

9. Способ по п.1, где присутствие полипептидных маркеров № 1, № 7, № 8 и/или № 9 указывает на наличие артериосклероза.

10. Способ по п.1, где отсутствие полипептидных маркеров № 2, № 3, № 4, № 5 и/или № 6 указывает на наличие артериосклероза.

11. Способ по п.1, где для обнаружения присутствия или отсутствия полипептидного маркера или полипептидных маркеров используют капиллярный электрофорез, газофазную ионную спектрометрию и/или масс-спектрометрию.

12. Способ по п.1, где до определения молекулярной массы полипептидных маркеров осуществляют капиллярный электрофорез.

13. Способ по п.1, где для обнаружения присутствия или отсутствия полипептидного маркера или полипептидных маркеров используют масс-спектрометрию.