КЛЕЩЕВОЙ АЛЛЕРГЕН ДОМАШНЕЙ ПЫЛИ Российский патент 2015 года по МПК C07K14/435 C12N15/12 C12N5/10 C12N15/63 A61K39/35 A61P37/00 

Изобретение относится к полипептиду, имеющему аллергенные свойства.

Более 25% населения в индустриальных странах страдают от IgE-опосредованных аллергий. Пациенты аллергики отличаются увеличенным продуцированием IgE-антител против per se безвредных антигенов (т.е. аллергенов). Непосредственные симптомы аллергии Типа I (аллергический риноконъюнктивит, астма, дерматит, анафилактический шок) обусловлены аллерген-индуцированным сшиванием связанных с мастоцитами IgE-антител и высвобождением биологически активных медиаторов (например, гистамина, лейкотриенов).

Клещи домашней пыли (HDM) представляют один из наиболее важных источников аллергенов по всему свету. Почти 10% населения и более чем 50% пациентов аллергиков сенсибилизированы к клещевым аллергенам. HDM Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) преобладает в Центральной Европе. Аллергены Der p содержат более 30 белков или гликопротеинов, из которых до сих пор был охарактеризован двадцать один аллерген. Аллергены Группы 1 и 2 (Der p 1 и Der p 2) представляют наиболее важные аллергены из HDM, которые узнаются более чем 80% аллергических к Der p пациентов, но также было показано, что другие аллергены HDM (например, Der p 5 и Der p 7) представляют важные аллергены Der p несмотря на значительно более низкую частоту IgE-связывания.

В Weghofer M. et al. (Clin Exp Allergy 35 (2005): 1384-1391) было показано, что рекомбинантные клещевые аллергены пыли способны ингибировать реактивность IgE и, следовательно, могут быть использованы для диагностических тестов и терапии Der р-аллергии.

В Pinner G. et al. (Clin Exp Allergy 34 (2004): 597-603) были описаны диагностические тест-системы на основе основных клещевых аллергенов пыли Der p 1 и Der p 2, имеющих высокую перекрестную реактивность клещевых аллергенов пыли (например, Der p 10) для отбора пациентов для иммунотерапии с использованием экстрактов Der р.

В Vrtala S. et al. (Methods 32 (2004): 313-320) описаны стратегии получения и оценки производных аллергенов, проявляющих уменьшенную аллергенную активность (например, гипоаллергенных молекул) и подходящих для вакцинации.

ЕР 1612219 A1 описывает аллергены, полученные из клещей домашней пыли (Der p).

Неочищенные экстракты HDM, которые используются в настоящее время для диагностики и терапии пациентов аллергиков с HDM, стандартизованы только для Der p 1 и Der р 2, тогда как другие важные аллергены присутствуют только в малых количествах в экстрактах HDM.

Целью изобретения является обеспечение новых полипептидов с аллергенными и гипоаллергенными свойствами, которые могут быть использованы в диагностике, терапии и предупреждении аллергий, в частности аллергии к клещам домашней пыли.

Таким образом, изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 60% идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID No. 1, или содержащему, по меньшей мере, один аминокислотный фрагмент, по меньшей мере, из 6 последовательных аминокислотных остатков аминокислотной последовательности SEQ ID No. 1, или имеющему иммунологическую перекрестную реактивность с аминокислотной последовательностью SEQ ID No. 1 или ее фрагментами, где аминокислотная последовательность SEQ ID No. 1 кодирует (кодифицирует) аллерген и этот полипептид содержит, по меньшей мере, один Т-клеточный эпитоп, узнаваемый Т-клеточным рецептором, специфическим в отношении молекулы, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

Полипептид с аминокислотной последовательностью SEQ ID No. 1 (MKFNIIIVFI SLAILVHSSY AANDNDDDPT TTVHPTTTEQ PDDKFECPSR FGYFADPKDP HKFYICSNWE AVHKDCPGNT RWNEDEETCT) является новым основным аллергеном Der p, который может быть применим, например, для диагностики и терапии аллергических к Der р пациентов. Этот новый аллерген Der p имеет молекулярную массу 8 кДа и связывает IgE из более чем 50% аллергических к клещам пациентов.

Высокая частота IgE-связывания аллергена с аминокислотной последовательностью SEQ ID No. 1 и наблюдение, что этот аллерген является биологически активным, делает его важной молекулой для диагностики аллергии к клещам домашней пыли в индивидууме.

Кроме того, этот новый клещевой аллерген применим также для терапии или предупреждения аллергии к клещам домашней пыли. Полипептид согласно изобретению индуцирует высокие титры специфических IgG-антител в млекопитающих. Если эти специфические IgG-антитела вводят индивидууму, клещевой аллерген домашней пыли добавляют к пробе, предпочтительно сыворотке, полученной из аллергического к клещевому аллергену домашней пыли индивидуума, содержащей IgE-молекулы указанного индивидуума, IgE-связывание с этим новым аллергеном ингибируется. Это показывает, что аллерген-специфическая иммунотерапия с этим новым клещевым антигеном будет индуцировать блокирование молекул IgG в людях. Важность индукции блокирования антител IgG для успешной иммунотерапии была показана недавно в испытаниях иммунотерапии с определенными аллергенами и производными аллергенов (Gafvelin G. et al. (2005) Int Arch Allergy Immunol 138:59; Jutel M. et al. (2005) J Allergy din Immunol 116:608). Индуцировали высокие уровни аллерген-специфических антител, которые ингибировали аллерген-индуцированную дегрануляцию базофилов (Niederberger V. et al. (2004) PNAS USA 101 Suppi 2:14677). Модификации полипептида согласно изобретению, проявляющие аллергенные свойства, приводящие к гипоаллергенным производным с уменьшенной аллергенной активностью и сохраненной иммуногенностью, могут дополнительно улучшать иммунотерапию посредством уменьшения анафилактических побочных действий (Valenta R. et al. (2004) Adv Immunol 82:105). Гипоаллергенные производные могут быть получены молекулярно-биологическими способами или синтезом пептидов, происходящих из Т-клеточных или В-клеточных эпитопов этого аллергена (Kyte J. and R.F.Doolittle. (1982) J Mol Biol 157:105).

В данном контексте "полипептид" обозначает молекулу, содержащую, по меньшей мере, 6 аминокислотных остатков, предпочтительно, по меньшей мере, 8 аминокислотных остатков.

Термин "идентичность" в данном контексте указывает, имеют ли любые две (или более) последовательности пептида, полипептида или белка аминокислотные последовательности, которые являются "идентичными" до определенной степени ("% идентичность") друг другу. Эта степень может быть определена с использованием известных компьютерных алгоритмов, таких как программа "FAST А", с использованием, например, параметров по умолчанию, описанная в Pearson et al. (1988) PNAS USA 85: 2444 (другие программы все пакты программ GCG (Devereux J. et al. Nucleic Acids Research (1984) Nucleic Acids Res., 12, 387-395), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul S. F. et al. J Molec Biol 215: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed. Academic Press, San Diego, 1994, и Carilloet al, (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Например, инструмент BLAST базы данных NCBI может быть использован для определения идентичности. Другие коммерчески или публично доступные программы включают программу DNAStar "MegAlign" (Madison, WI) и программу "GAP" University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWG) (Madison, WI)). Дополнительно может быть определена процентная идентичность белковых молекул, например, сравнением информации последовательности с использованием компьютерной программы GAP (например, Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443, с модификацией Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482). Вкратце, эта программа GAP определяет идентичность как количество сопоставленных символов (т.е. нуклеотидов или аминокислот), которые являются идентичными, деленное на общее количество символов в более короткой из этих двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать: (1) унарную матрицу сравнения (содержащую величину 1 для идентичностей и для неидентичностей) и взвешенную матрицу сравнения Gribskov et al. 14:6745, описанную Schwartz and DayhofF, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp.353-358 (1979); (2) штраф 3,0 для каждого гэпа и дополнительный штраф 0,10 для каждого символа в каждом гэпе; и (3) отсутствие штрафа за концевые гэпы.

Согласно предпочтительному варианту изобретения аминокислотная последовательность является, по меньшей мере, на 70%, предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 90%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 95%, в частности 100%, идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID No. 1.

В данном контексте "перекрестная реактивность" обозначает способность антитела связываться, кроме того, с антигеном (например, пептидом, белком, полипептидом), который действительно стимулирует его продуцирование в системе in vivo, других антигенов. Это означает, что антитело, полученное для связывания специфически полипептида с аминокислотной последовательностью SEQ ID No. 1 или его фрагментов, может также обнаруживать связывающую аффинность в отношении полипептида, который не является гомологичным SEQ ID No. 1. Эта специфичность связывания антитела с полипептидом может быть определена способами, известными в данной области, например, ELISA, RIA, иммуноблоттингом и т.д., описанными Valenta et al. J Exp Med. (1992) 175:377-385.

Полипептид согласно изобретению получают предпочтительно рекомбинантно любым способом, известным в данной области. Хозяин, в котором может быть получен указанный полипептид, может быть хозяином любого типа, использующим соответствующие векторы и плазмиды (например, может быть эукариотическими клетками, предпочтительно дрожжами, клетками млекопитающих, клетками растений и клетками насекомых, и прокариотическими клетками, предпочтительно Escherichia coli и Bacillus subtilis). Конечно, можно также получать полипептиды изобретения химически способами, известными в данной области.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения указанный полипептид является гипоаллергенным.

В данном контексте термин "гипоаллергенный" относится к способности пептида, полипептида или белка, полученного из аллергена с аллергенными свойствами, индуцировать антитела, специфически связывающиеся с указанными аллергенами и проявляющие уменьшенные аллергические реакции или не проявляющие аллергических реакций при введении индивидууму. Эту уменьшенную или отсутствующую способность «гипоаллергенных» производных аллергена, такого как SEQ ID No. 1, индуцировать аллергическую реакцию в индивидууме получают удалением или разрушением IgE-связывающих эпитопов из указанных аллергенов, однако, с сохранением Т-клеточных эпитопов, присутствующих на указанных аллергенах. Это может быть достигнуто, например, расщеплением этого аллергена на фрагменты с уменьшенной или отсутствующей IgE-связывающей способностью и слиянием некоторых или всех из указанных фрагментов вместе в таком порядке, который не соответствует порядку этих фрагментов в аллергене дикого типа (см., например, ЕР 1440979). Другой способ получения "гипоаллергенных" молекул из аллергенов включает С- и/или N-концевые делеции аллергена дикого типа (см., например, ЕР 1224215).

Согласно другому предпочтительному варианту изобретения указанные аминокислотные фрагменты сливают вместе в порядке, отличающемся от порядка указанных фрагментов в SEQ ID No. 1.

Полипептид согласно изобретению может содержать аминокислотные фрагменты, произведенные из SEQ ID No. 1, которые могут быть предпочтительно слиты вместе в порядке, отличающемся от порядка в SEQ ID No. 1. Эта «перетасовка» приводит к полипептиду, имеющему измененные признаки относительно аллергена дикого типа, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID No. 1. Например, эта перетасовка будет приводить к полипептиду, содержащему интактные Т-клеточные эпитопы и разрушенные В-клеточные эпитопы. Такая молекула может иметь гипоаллергенные свойства.

Указанный, по меньшей мере, один аминокислотный фрагмент, который, по существу, состоит из Т-клеточного эпитопа, предпочтительно выбран из группы, состоящей из аминокислотных молекул, содержащих аминокислоты 5-13, 9-17, 10-18, 11-19,12-20, 16-24, 17-25, 43-51, 44-52, 45-53, 47-55, 51-59 и 60-68 SEQ ID No. 1.

Для вызывания Т-клеточной иммунной реакции в индивидууме при введении полипептида по изобретению указанный полипептид должен содержать Т-клеточные эпитопы. Т-клеточные эпитопы содержат, по меньшей мере, 6, предпочтительно, по меньшей мере, 7, более предпочтительно, по меньшей мере, 8, последовательных аминокислотных остатков SEQ ID No. 1. Указанные Т-клеточные эпитопы могут быть также связаны с носителем через линкер или без линкера. Указанным носителем может быть твердая подложка, используемая в технологии микроматриц. Присутствие Т-клеточных эпитопов в полипептиде может быть определено способами, известными в данной области (см., например, "Epitope Mapping: A practical approach" Ed.0. Westwood and F. Hay, 2001, Oxford University Press). Особенно предпочтительным способом является ELISpot (Tobey TW and Caulfield MJ (2004), Methods Mol. Med. 94:121-132).

Идентифицированные Т-клеточные эпитопы могут быть слиты на N-конце или С-конце с другими молекулами, такими как белки, или быть частью большего фрагмента, полученного из SEQ ID No. 1 фрагментацией.

Другой аспект изобретения относится к молекуле ДНК, кодирующей полипептид по изобретению.

Еще один аспект изобретения относится к вектору, содержащему молекулу ДНК по изобретению.

Предпочтительные векторы (например, плазмиды) для применения в соответствии с изобретением являются клонирующими, а также экспрессирующими векторами, содержащими промоторы, сайт инициации репликации, регуляторные элементы, маркеры отбора и/или другие элементы векторов. Если вектор является интегрирующимся вектором, способным интегрироваться в геном клетки-хозяина, соответствующие средства могут быть обеспечены на указанном векторе (например, элементы инсертирования последовательности). Тип используемого вектора и регуляторных элементов, присутствующих на указанном векторе, зависят также от того, в какую клетку-хозяин будет интегрирован указанный вектор. Если используются экспрессирующие векторы, молекула ДНК по изобретению, кодирующая полипептид, описанный выше, функционально связана с районом промотора.

Другой аспект изобретения относится к клетке, трансформированной вектором в соответствии с изобретением.

Клетка может быть эукариотической клеткой, а также прокариотической клеткой. Предпочтительными эукариотическими клетками являются клетки дрожжей, в частности, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris и Hansenula polymorpha, клетки растений, в частности, клетки растений табака, клетки насекомых и клетки млекопитающих, например, клетки человека и животных в частности, клетки яичника Китайского хомячка. Предпочтительными прокариотическими клетками являются, например, Bacillus subtilis и Escherichia coli. Клетка, содержащая вектор или молекулу ДНК изобретения, может быть использована для получения полипептида в соответствии с изобретением.

Другой аспект изобретения относится к связыванию антитела с полипептидом в соответствии с изобретением.

Антитела согласно изобретению включают, но не ограничиваются ими, поликлональные, моноклональные, мультиспецифические, гуманизированные или химерные антитела, одноцепочечные антитела, Fab-фрагменты, F(аb')₂-фрагменты и эпитопсвязывающие фрагменты любых из вышеописанных антител. Кроме того, антитела рассматриваются как являющиеся молекулами иммуноглобулина и иммунологически активными частями молекул иммуноглобулина, т.е. молекулами, которые содержат антигенсвязывающий сайт, который иммуноспецифически связывает антиген. Эти молекулы иммуноглобулина этого изобретения являются предпочтительно молекулами типов IgG, IgM, IgD, IgA и IgY, класса (например, IgGI, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подкласса молекулы иммуноглобулина.

Поликлональные антитела могут быть получены введением полипептида этого изобретения, предпочтительно с использованием адъюванта, млекопитающему не человеку и сбором полученной антисыворотки. Улучшенные титры могут быть получены повторяемыми инъекциями на протяжении некоторого периода времени. Нет конкретного ограничения в отношении видов млекопитающих, которые могут быть использованы для индукции антител; обычно предпочтительно используют кроликов или морских свинок, но можно также использовать лошадей, кошек, собак, коз, свиней, крыс, коров, овец, верблюдов и т.д. В получении антител определенное количество иммуногена этого изобретения, например, разбавляют физиологическим солевым раствором до подходящей концентрации, и полученный разбавленный раствор смешивают, например, с полным адъювантом Фрейнда для приготовления суспензии или с минеральными гелями, такими как гидроксид алюминия, поверхностно-активными веществами, такими как лизолецитин, полиолами плуроников, полианионами, пептидами, масляными эмульсиями, гемоцианинами морского блюдечка, динитрофенолом и потенциально применимыми адъювантами человека, такими как BCG (бацилла Кальметта-Герена) и Corynebacterium parvum. Эти суспензии и смеси вводят млекопитающим, например, внутрибрюшинно, например кролику, с использованием приблизительно 50 мкг - приблизительно 2500 мкг полипептида этого изобретения на одно введение. Эту суспензию предпочтительно вводят приблизительно каждые две недели на протяжении периода до приблизительно 2-3 месяцев, предпочтительно приблизительно 1 месяца, для выполнения иммунизации. Антитело извлекают сбором крови из иммунизированного животного после прохождения 1-2 недель после последнего введения центрифугированием этой крови и выделением сыворотки из этой крови.

Моноклональные антитела могут, например, происходить из человека или мыши. Мышиные моноклональные антитела могут быть получены способом Kohler and Milstein (Kohler G. and Milstein C. Nature 256 (1975) 495), например, слиянием клеток селезенки гипериммунизированных мышей с подходящей клеточной линией миеломы мыши.

Химерное антитело является молекулой, в которой разные части антитела произведены из разных видов животных, такой как антитела, имеющие вариабельную область, происходящую из мышиного моноклонального антитела, и константную область иммуноглобулина человека. Способы получения химерных антител известны в данной области (см., например, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; US 5807715; US 4816567 и US 4816397).

Гуманизированные антитела являются молекулами антител из антитела вида не человека, которые связывает желаемый антиген, имеющими один или несколько определяющих комплементарность районов (CDR) из вида не человека и каркасные области из молекулы иммуноглобулина человека. Часто каркасные остатки в каркасных областях человека будут заменены соответствующими остатками из антитела-донора CDR для изменения, предпочтительно улучшения, связывания антигена. Эти замены в каркасной области идентифицируют способами, хорошо известными в данной области, например моделированием взаимодействий остатков CDR и каркаса для идентификации каркасных остатков, важных для связывания антигена и сравнения последовательности для идентификации необычных каркасных остатков в конкретных положениях (см., например, Queen et al. US 5585089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)). Антитела могут быть гуманизированы с использованием различных способов, известных в данной области, в том числе, например, CDR-трансплантации (ЕР 239400; WO 91/09967; US 5225539; US 5530101 и US 5585089), облицовки или переделки поверхности (ЕР 592106; ЕР 519596; Padlan, Molecular Immunology 28 (4/5):489-498 (1991); Studnicka et al. Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska et al. PNAS 91:969-913 (1994)) и перетасовки цепи (US 5565332).

Антитела в соответствии с изобретением могут предпочтительно быть использованы для пассивной иммунизации индивидуума, страдающего от аллергии, в частности от аллергии к клещу домашней пыли. Для пассивной иммунизации антитело является предпочтительно IgG или его производным (например, химерным или гуманизированным антителом). Кроме того, это антитело может быть использовано для десенсибилизации индивидуума.

Другой аспект изобретения относится к вакцинной композиции, содержащей полипептид или антитело в соответствии с изобретением.

Наряду с полипептидом или антителом, эта композиция в соответствии с данным изобретением может также содержать другие вещества, такие как стабилизаторы, адъюванты, фармацевтически приемлемые носители и т.д. Подходящие протоколы для получения вакцинных композиций известны квалифицированному в данной области специалисту и могут быть найдены, например, в "Vaccine Protocols" (A.Robinson, М.Р.Cranage, М.Hudson; Humana Press Inc., U.S.; 2^nd edition 2003).

Еще один аспект изобретения относится к применению полипептида в соответствии с изобретением для диагностики аллергии, в частности аллергии к клещам домашней пыли, в индивидууме.

Указанный полипептид может быть использован для диагностики аллергии, в частности аллергии к клещам домашней пыли, например, подверганием пробы индивидуума, содержащей высвобождающие гистамин клетки, действию указанного полипептида (см., например, Purohit et al. Clin. Exp. Allergy 35 (2005): 186-192). Кроме того, полипептид (полипептиды) в соответствии с изобретением может быть иммобилизован на поверхности для образования полипептидного массива/чипа. Такие массивы могут быть использованы, например, в высокопроизводительном скрининге для диагностики аллергии в ряде проб, взятых из ряда индивидуумов.

Другой аспект изобретения относится к применению полипептида или антитела в соответствии с изобретением для приготовления лекарственного средства для иммунотерапии аллергии, в частности аллергии к клещам домашней пыли.

Полипептиды и антитела изобретения могут быть использованы для активной вакцинации и пассивной вакцинации соответственно. Оба эти компонента могут быть использованы, так как образование защитных IgG индуцируется при введении полипептида изобретения индивидууму, а введение иммуноглобулинов, направленных на указанный полипептид, будет приводить к конкуренции между IgE и введенными защитными антителами, которая, в свою очередь, уменьшает симптомы этой аллергии.

Другой аспект изобретения относится к применению полипептида по любому из пп. 1-4 или антитела по п. 7 для приготовления лекарственного средства для предотвращения сенсибилизации аллергеном, в частности сенсибилизации клещевым аллергеном домашней пыли.

Полипептид, используемый для вакцинации индивидуума, является предпочтительно гипоаллергенным. Применение такого полипептида предотвращает связывание IgE с указанным полипептидом и, следовательно, предотвращает аллергическую реакцию.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения указанное лекарственное средство дополнительно содержит адъюванты, носитель, разбавители, консерванты или их смеси.

Это лекарственное средство содержит предпочтительно 10 нг - 1 г, более предпочтительно 100 нг - 10 мг, в частности 0,5 мкг - 200 мкг указанного полипептида.

Изобретение дополнительно иллюстрируется следующими фигурами и примерами, однако без ограничения ими.

Фиг. 1 показывает кДНК-последовательность и аминокислотную последовательность полученного из клона 30 аллергена. Стартовый кодон и стоп-кодон подчеркнуты. Сигнальная последовательность содержит аминокислотные остатки 1-21 с предсказанным сайтом расщепления между аминокислотными остатками 21 (А) и 22 (А), показанных жирным шрифтом. Цифры с левой стороны этой последовательности указывают положения нуклеотидов, а цифры на правой стороне этой последовательности показывают положения аминокислот.

Фиг. 2 показывает окрашивание Кумасси синим и масс-спектрометрию (MS) полученного из клона 30 аллергена. А, окрашенный Кумасси синим гель показывает маркер молекулярной массы (М) и 3 мкг очищенного полученного из клона 30 аллергена (30). В, MS-анализ очищенного полученного из клона 30 аллергена показывает отношение масса/заряд на х-оси и интенсивность сигнала на y-оси в виде процента от наиболее интенсивного сигнала, полученного в исследованном диапазоне массы. Максимум (пик) при 7979,20 соответствует рассчитанной массе расшифрованной аминокислотной последовательности полученного из клона 30 аллергена.

Фиг. 3 показывает иммуноблот полученного из клона 30 аллергена. Пробы очищенного полученного из клона 30 аллергена разделяли электрофорезом в ДСН-ПААГ, блоттировали на нитроцеллюлозу и инкубировали с сыворотками из двух аллергических к клещу пациентов (1, 2) и одной сывороткой из неаллергического индивидуума (3). Связанные IgE-антитела, специфические для полученного из клона 30 аллергена, детектировали ¹²⁵I-мечеными антителами против IgE человека.

Фиг. 4 показывает IgG-реактивность кроличьей антисыворотки против полученного из клона 30 аллергена. Полученный из клона 30 аллерген и основной клещевой аллерген, Der p 2, наносили в виде точек на полоски нитроцеллюлозы и инкубировали с разведенной 1:1000-1:1000000 кроличьей неиммунной сывороткой (А) или кроличьей антисывороткой против полученного из клона 30 аллергена (В). Связанные IgG-антитела детектировали ослиными ¹²⁵I-мечеными целыми антителами против кроличьего иммуноглобулина.

Фиг. 5 показывает биологическую активность полученного из клона 30 аллергена. Пробы крови из пациента с аллергией к клещевому аллергену подвергали действию 10 мкг/мл, 1 мкг/мл и 0,1 мкг/мл полученного из клона 30 аллергена или ЗФР в качестве буферного контроля (Со) (х-ось). Экспрессию CD203c определяли FACS-анализом, и она изображена в виде индекса средней флуоресценции (MFI) (у-ось).

Фиг. 6 показывает анализ гидрофобности (Kyte & Doolittle) зрелого полученного из клона 30 аллергена с использованием ProtScale. Положения аминокислот этого зрелого белка изображены на х-оси. В, Предсказание возможных Т-клеточных эпитопов полученного из клона 30 аллергена MULTIPRED, вычислительной системы на основе web. Цифры на каждой стороне этой последовательности указывают положения аминокислот зрелого полученного из клона 30 аллергена.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Эти примеры описывают идентификацию нового основного аллергена Der p, который может быть применим, например, для диагностики и терапии Der р-пациентов аллергиков.

кДНК, кодирующую этот новый клещевой антиген, выделяли из библиотеки экспрессирующих кДНК Der р и экспрессировали в Escherichia coli (E.coli) в виде рекомбинантого аллергена. Этот новый аллерген имеет молекулярную массу приблизительно 8 кДа и связывает IgE из более чем 50% пациентов с клещевой аллергией, являясь, следовательно, основным аллергеном.

Пример 1: Экспрессия и очистка аллергена, полученного из клона 30

Последовательность кДНК клона 30 (фиг. 1), кодирующую этот предсказанный зрелый аллерген, полученный из клона 30 (нуклеотиды 89-295 с дополнительным ATG на N-конце) субклонировали в экспрессирующий вектор pET-17b (Novagene, WI) и экспрессировали в клетках Escherichia coli BL21 (DE3) (Stratagene, CA). Эти бактериальные клетки выращивали в течение ночи в LB-среде, содержащей 100 мг/мл ампициллина, при 27°С и экспрессию рекомбинантного белка индуцировали добавлением изопропил-β-тиогалактопиранозида (IPTG) до конечной концентрации 0,5 мМ. После культивирования в течение дополнительных 6 ч при 27°С, клетки из 1 л культуры E.coli собирали центрифугированием (15 мин, 3000 об/мин, 4°С, Sorvall RC5C) и осадки ресуспендировали в 30 мл 25 мМ имидазола рН 7,4/0,1% (об./об.) Тритон Х 100. После этого бактериальные клетки обрабатывали 300 мкг лизоцима в течение 20 мин при комнатной температуре. Лизат бактериальных клеток три раза замораживали в жидком азоте и оттаивали на водяной бане при 50°С. Геномную ДНК расщепляли добавлением 3 мкг ДНКазы и выдерживанием в течение 10 мин при комнатной температуре с последующим добавлением 600 мкл 5 М NaCl. Эти лизированные бактериальные клетки центрифугировали при 18000 об/мин, 4°С и белки растворимой фракции, содержащей аллерген, полученный из клона 30, обрабатывали 60% сульфатом аммония в течение 1,5 ч при 4°С. Осажденные белки отделяли центрифугированием (18000 об/мин, 20 мин, 4°С) и растворимую фракцию, содержащую аллерген, полученный из клона 30 диализовали против смеси 2 М сульфат аммония/50 мМ фосфат натрия рН 70/10 мг/л фенилметилсульфонилфторид (PMSF) и наносили на колонку HiTrap Phenyl FF (high sub) (Amersham Biosciences AB, Sweden). Аллерген, полученный из клона 30, элюировали градиентом 500 - 0 мМ сульфата аммония и фракции, содержащие аллерген, полученный из клона 30, объединяли. После диализа против 20 мМ Трис-Сl рН 8,0/10 мг/л PMSF, пробу наносили на колонку HiTrap DEAE Sepharose FF (Amersham Biosciences). Аллерген, полученный из клона 30, элюировали градиентом 0 - 500 мМ Nad и фракции, содержащие аллерген, полученный из клона 30, с чистотой, большей чем 90%, объединяли. Аллерген, полученный из клона 30, диализовали против 20 мМ Трис-Сl рН 8,0 и хранили при -20°С. Пробу белка анализировали на чистоту электрофорезом на 14% додецилсульфат-полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ) и окрашиванием белка Кумасси бриллиантовым синим, (фиг. 2 А). Анализ молекулярной массы этого зрелого белка давал массу 7,98 кДа (фиг. 2 В), которая соответствует рассчитанной массе расшифрованной аминокислотной последовательности аллергена, полученного из клона 30 (фиг. 2А).

Пример 2: IgE-реактивность аллергена, полученного из клона 30 IgE-связывающую способность аллергена, полученного из клона 30, демонстрировали анализом иммуноблота с использованием двух сывороток сенсибилизированных Dermatophagoides pteronyssinus индивидуумов (фиг. 3). Пробы аллергена, полученного из клона 30, разделяли электрофорезом на ДСН-ПААГ и блоттировали на нитроцеллюлозу. Нитроцеллюлозные полоски инкубировали с разведенной 1:10 сывороткой человека (1-3) и связанные IgG-антитела детектировали разведенными 1:10 ¹²⁵I-мечеными антителами против IgE человека. Сыворотки пациентов с клещевой аллергией (1, 2) реагировали специфически с аллергеном, полученным из клона 30. Контрольная сыворотка из непациентов аллергиков не реагировала с аллергеном, полученным из клона 30.

Частоту IgE-связывания определяли в анализе ELISA с сыворотками из 53 индивидуумов с клещевой аллергией с сохраняющимися круглый год симптомами, являющимися признаками клещевой аллергии, положительным SPT и D pteronyssinus-специфическим IgE-RAST (радиоаллергосорбентным тестом). Планшет ELISA (Nunc, Denmark) покрывали 5 мкг/мл аллергена, полученного из клона 30, и инкубировали с разведенными 1:10 сыворотками из пациентов с аллергией к клещевому аллергену. Связывание IgE человека детектировали разведенными 1:1000 АКР-конъюгированными антителами против IgE человека (BD Biosciences-Pharmingen, NJ).

Двадцать девять из 53 сывороток из имеющих аллергию к клещевому аллергену пациентов (55%) обнаруживали IgE-реактивность в отношении аллергена, полученного из клона 30 (табл. I).

Таблица I
Частота IgE-связывания полученного из клона 30 аллергена Рекомбинантный белок Количество пациентов с IgE-реактивностью Процент IgE-реактивности Аллерген, полученный из клона 30 29 (n=53) 55

Пример 3: Иммунизация аллергеном, полученным из клона 30, индуцирует IgG-антитела в кроликах

Для испытания, является ли аллерген, полученный из клона 30, иммуногенным, кролика иммунизировали новым аллергеном с использованием адъюванта Фрейнда. Кролика иммунизировали 3 раза 200 мкг белка на одну инъекцию с использованием один раз полного адъюванта Фрейнда и два раза неполных адъювантов Фрейнда (Charles River, Germany).

Индукцию IgG-антител исследовали дот-блот-экспериментами. Рекомбинантный Der p 2 и аллерген, полученный из клона 30, наносили в виде точек (пятен) на нитроцеллюлозные полоски (0,5 мкг/пятно) и эти полоски инкубировали с разведенной 1:1000, 1:10000, 1:100000 и 1:1000000 кроличьей неиммунной сывороткой и антисывороткой против аллергена, полученного из клона 30. Связанные IgG-антитела детектировали ¹²⁵I-мечеными ослиными целыми антителами против кроличьего иммуноглобулина (Amersham).

Высокие титры специфических IgG-антител индуцировались аллергеном, полученным из клона 30 (фиг. 4). Антисыворотка против аллергена, полученного из клона 30, реагировала специфически с аллергеном, полученным из клона 30, до разведения 1:100000, и не наблюдали реакции с Der p 2 (фиг. 4В). Неиммунная сыворотка не реагировала с аллергеном, полученным из клона 30, и Der p 2 (фиг. 4А).

Пример 4: IgG-антитела, индуцированные аллергеном, полученным из клона 30, в кроликах, блокируют IgE-связывание с аллергеном, полученным из клона 30, у пациентов с аллергией к клещевому аллергену

Способность кроличьих антител, специфических в отношении аллергена, полученного из клона 30, блокировать связывание IgE-пациентов с этим аллергеном испытывали анализами ингибирования ELISA. Связанный с планшетом ELISA аллерген, полученный из клона 30 (5 мкг/мл), предынкубировали с разведенными 1:100 в PBST/0,5% (масса/объем) БСА кроличьими антителами против аллергена, полученного из клона 30, или кроличьей неиммунной сывороткой и инкубировали при 4°С в течение ночи. Затем этот планшет подвергали действию разведенных 1:5 в PBST/0,5% (м/о) БСА сывороток из 14 пациентов с клещевой аллергией в течение ночи при 4°С. Связанные IgE-антитела детектировали HRP-связанными козьими антителами против IgE человека (Kirkegaard & Perry Gaithersbury, MD), разведенными 1:2500 в PBST/0,5% БСА. Степень ингибирования рассчитывали следующим образом: % ингибирования связывания IgE=100-OD_{антисыворотка, полученная против клона 30}×100/OD_{неимунная сыворотка}.

Для большинства пациентов можно было наблюдать сильное ингибирование связывания IgE, находящееся в диапазоне 25 - 97% (среднее: 82%) (табл. II). В половине сывороток связывание IgE с полученным из клона 30 аллергеном ингибировалось на 90% или более.

Таблица II
Кроличьи антитела против полученного из клона 30 IgG, ингибируют связывание IgE из сывороток пациентов с клещевой аллергией с аллергеном, полученным из клона 30   Номер пациента Предынкубация с: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 среднее неимунной сывороткой (OD-величины) 0,569 1,140 0,451 0,982 2,520 0,628 0,790 0,347 0,484 0,269 0,553 1,333 1,638 1,038 0,910 сывороткой, полученной против клона 30 (OD-вели-чины) 0,060 0,083 0,070 0,155 0,220 0,039 0,071 0,101 0,029 0,078 0,415 0,047 0,362 0,137 0,133 % ингибирования связывания IgE 90 93 85 84 91 94 91 71 94 71 25 97 78 87 82

Пример 5: Аллерген, полученный из клона 30, является биологически активным Повышающая регуляция CD203c на базофилах может быть использована в качестве маркера для индуцированной активации и последующей дегрануляции базофилов и следовательно для определения аллергенной активности аллергена. Гепаринизированные пробы крови (100 мкл) из пациента с клещевой аллергией инкубировали с разными концентрациями аллергена, полученного из клона 30, моноклонального анти-IgЕ-антитела (Immunotech, France) или ЗФР в течение 15 мин при 37°С. Экспрессию CD203c определяли двухцветной проточной колориметрией на FACScan (Becton Dickinson, CA).

Аллерген, полученный из клона 30, индуцировал повышающую регуляцию экспрессии CD203c на базофилах пациента с аллергией к клещевому аллергену при концентрации 10 мкг/мл (фиг. 5). Антитела против IgE человека (положительный контроль) индуцировали повышающую регуляцию экспрессии CD203c при 1 мкг/мл, тогда как с отрицательным контролем (только ЗФР) не получали положительной регуляции.

Пример 6: Экспонированные на поверхности районы и возможные Т-клеточные эпитопы аллергена, полученного из клона 30

Гидрофильные районы белка, по-видимому, экспонированы на поверхности молекулы и могут быть потенциально антигенными. Таким образом, эти гидрофильные районы на поверхности аллергена, полученного из клона 30, могут представлять В-клеточные эпитопы. ProtScale (http://www.expasy.org/tools/protscale.html) позволяет вычислять и представлять профиль гидрофобности (Kyte & Doolittle), продуцируемый любой аминокислотной шкалой аллергена, полученного из белка 30. Размер окна 7 был выбран для исследования структуры. Результат ProtScale зрелого аллергена, полученного из клона 30, показывает белок с множеством отрицательных пиков, представляющих гидрофильные сегменты (фиг. 6А). В-клеточные эпитопы аллергена, полученного из клона 30, расположены между аминокислотами 3-12, 15-28, 34-43 и 49-68 этого зрелого белка.

Т-клетки иммунной системы человека узнают аллергены в виде коротких пептидных фрагментов (Т-клеточных эпитопов), произведенных деградацией этих аллергенов. MULTIPRED (http://antigen.i2ra-star.edu.sg/multipred/) является вычислительной системой на основе web для предсказания пептидов, которые связываются со множественными молекулами, принадлежащими к аллелям антигена лейкоцитов человека (HLA; МНС человека, главный комплекс гистосовместимости). Эти предсказанные результаты для отдельных 9-мерных пептидов с «Суммой» (суммой отдельных оценок связывания этого пептида с молекулами МНС) более 40 показаны на фиг. 6В. Т-клеточные эпитопы расположены вблизи N- и С-конца зрелого аллергена, полученного из клона 30.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложены: клещевой аллерген домашней пыли, представляющий собой полипептид, содержащий определенную аминокислотную последовательность, приведенную в описании в перечне списка последовательностей; кодирующая полипептид молекула ДНК; экспрессирующий вектор на её основе и трансформированная им рекомбинантная клетка для экспрессии полипептида. Описаны: вакцинная композиция для иммунотерапии аллергии к клещам домашней пыли на основе полипептида; применение указанного полипептида для диагностики аллергии к клещам домашней пыли; варианты применения полипептида при изготовлении лекарственного средства: для иммунотерапии аллергии к клещам домашней пыли или для предотвращения сенсибилизации клещевым аллергеном домашней пыли. Изобретение обеспечивает полипептид, который может найти применение как в диагностике, так и в терапии аллергии на клещевой аллерген домашней пыли. 8 н. и 5 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 6 пр.

1. Клещевой аллерген домашней пыли, представляющий собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3.

2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что указанный полипептид является гипоаллергенным.

3. Молекула ДНК, кодирующая полипептид по п.1.

4. Экспрессирующий вектор, содержащий молекулу ДНК по п.3.

5. Рекомбинантная клетка, экспрессирующая полипептид по п. 1, трансформированная вектором по п.4.

6. Вакцинная композиция для иммунотерапии аллергии к клещам домашней пыли, содержащая терапевтически эффективное количество полипептида по п.1.

7. Применение полипептида по п.1 для диагностики аллергии к клещам домашней пыли у пациента.

8. Применение полипептида по п.1 при изготовлении лекарственного средства для иммунотерапии аллергии к клещам домашней пыли.

9. Применение по п.8, отличающееся тем, что указанное лекарственное средство дополнительно содержит адъюванты, разбавители, консерванты или их смеси.

10. Применение по п.8 или 9, отличающееся тем, что это лекарственное средство содержит 10 нг - 1 г, предпочтительно 100 нг - 10 мг, особенно предпочтительно 0,5 мкг - 220 мкг указанного полипептида.

11. Применение полипептида по п.1 при изготовлении лекарственного средства для предотвращения сенсибилизации клещевым аллергеном домашней пыли.

12. Применение по п.11, отличающееся тем, что указанное лекарственное средство дополнительно содержит адъюванты, разбавители, консерванты или их смеси.

13. Применение по п.11 или 12, отличающееся тем, что это лекарственное средство содержит 10 нг - 1 г, предпочтительно 100 нг - 10 мг, особенно предпочтительно 0,5 мкг - 220 мкг указанного полипептида.