СПОСОБ ПРОГНОЗА ТЕЧЕНИЯ РОТАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У ДЕТЕЙ Российский патент 2010 года по МПК A61B5/00 G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, в частности к диагностике, и может быть использовано для прогнозирования течения патологического процесса. Острые кишечные инфекции (ОКИ) представляют одну из актуальных проблем в педиатрической практике. В последние годы изменилась этиологическая структура ОКИ, до 80% случаев диарей связано с вирусной этиологией, причем ведущая роль принадлежит ротавирусам (4, 11, 12).

Однако, несмотря на актуальность данной проблемы, многие вопросы в изучении ОКИ, в т.ч. ротавирусной инфекции (РИ), требуют дальнейшей разработки. Существующие традиционные методы лабораторной диагностики РИ не позволяют на ранних этапах заболевания оценить ответную реакцию организма на патогенное действие инфекционно-токсических факторов, определить роль механизмов резистентности, критерии прогнозирования течения заболевания.

Не вызывает сомнений ключевая роль иммунной системы в развитии любых патологических процессов (3, 5, 9).

Реактивность иммунной системы в значительной степени определяет тяжесть и характер течения любого инфекционного процесса. Различные звенья иммунной системы тесно взаимосвязаны между собой, в связи с чем недостаточность одного из них приводит к срыву всего механизма иммунореактивности (1, 3).

Решающее значение в защите против возбудителей кишечных инфекций имеет иммунная система кишечника в совокупности с другими неспецифическими факторами резистентности (2, 8, 13). Наиболее важное ее звено - секреторный IgA (3). Секреторный IgA (sIgA) относится к гуморальным факторам иммунитета и является маркером так называемого «местного иммунитета». Сборка этого секреторного иммуноглобулина происходит на базальной мембране лимфоидных и эпителиальных клеток из предшественника секреторного компонента и димера сывороточного IgA. Стабильность работы этой защиты предупреждает развитие патологического процесса и сохраняет состояние клинического здоровья. Он обеспечивает защиту от разрушения протеолитическими ферментами слизистой желудка и кишечника и определяет устойчивость к изменениям рН. Благодаря этому активность sIgA сохраняется на протяжении всего кишечного тракта ребенка (6). В основе противовирусного действия sIgA лежит образование иммунных комплексов, способствующих деградации, инактивация вирусов, блокирование специфических рецепторов на поверхности мембран эпителиальных клеток, выстилающих слизистые оболочки, а также стимулирование образования бокаловидными клетками муцина, который может ингибировать репликацию ротавирусов (6, 10). Иммунодефицитное состояние местного звена иммунитета также может привести к количественным и качественным изменениям в микрофлоре кишечника, создавая дополнительные условия для внедрения возбудителей острых кишечных инфекций (ОКИ), в том числе ротавирусов (7, 13). Иммунологические показатели являются достаточно вариабельными, изменяются на разных стадиях патологического процесса (5). Изменение количества sIgA позволяет оценить состояние местного иммунитета при заболеваниях, а также контролировать динамику лечения.

Задачей изобретения является прогноз течения ротавирусной инфекции у детей на ранних стадиях болезни.

Поставленную задачу осуществляют за счет того, что концентрацию секреторного иммуноглобулина А определяют в динамике на 5-7 день болезни и при сниженном уровне секреторного IgA в кале до Ме=164,3 мг/л [142,0:229,1] прогнозируют негладкое течение заболевания, а при повышении уровня секреторного IgA до Ме=298,88 мг/л [242,7:360,98] прогнозируют гладкое течение ротавирусной инфекции.

Способ осуществляют следующим образом. Забор кала для исследования проводят в стерильные стеклянные флаконы. Образцы замораживают и хранят при минус 20°С. После размораживания добавляют на 1 г фекалий 10 мл физиологического раствора, тщательно перемешивают при комнатной температуре. Осадок отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость фильтруют и используют для постановки реакции.

Для определения количественного содержания секреторного иммуноглобулина A (sIgA) в копрофильтратах в лунки стрипов, предназначенных для калибровочных проб и контрольных образцов (КО), вносят 80 мкл рабочего буферного раствора (РСК), в лунки, используемые для анализа исследуемых образцов вносят 90 мкл РСК. Вносят по 20 мкл концентратов калибровочных проб и КО из пробирок, маркированных от 0 до 20 мг/л и КО (с указанным количеством sIgA). После внесения образца в лунку ее содержимое перемешивают круговыми движениями наконечника пипетки, которым вносили образец. В лунки стрипов, предназначенных для анализа и содержащих 90 мкл РСК, добавляют 10 мкл предварительно разведенных 1:200 образцов фильтратов фекалий. Стрипы закрывают пленкой (для уменьшения артефактов, связанных с испарением раствора из лунок) и инкубируют в течение 30 минут при температуре 37°С. Содержимое лунок удаляют вакуум-аспирацией с использованием водоструйного насоса, снабженного ловушкой с дезинфицирующим раствором. Лунки промывают 5 раз, заполняя их каждый раз до краев, а затем энергично вытряхивая. Во все лунки вносят 100 мкл раствора конъюгата, стрипы закрывают и инкубируют в течение 30 мин при температуре 37°С. Содержимое лунок удаляют вакуум-аспирацией, лунки промывают 5 раз. Остатки влаги удаляют, постукивая перевернутыми стрипами по фильтровальной бумаге. Во все лунки стрипов вносят 100 мкл раствора тетраметилбензидина (ТМБ), стрипы закрывают и выдерживают при температуре 22°С в темноте 20 минут. Во все лунки стрипов вносят по 100 мкл стоп-реагента. Результаты иммуноферментного анализа (ИФА) регистрируют с помощью спектрофотометра, измеряя оптическую плотность в двухволновом режиме. Вычисляют по результатам измерения среднее арифметическое значение оптической плотности (ОП) для дубликатов. Строят калибровочный график: ось абсцисс - концентрация sIgA (мг/л), ось ординат - оптическая плотность (ОП₄₅₀). Концентрацию sIgA в мг/л в исследуемых образцах определяют, нанося соответствующее значение ОП на калибровочный график. Концентрацию sIgA, определенную по графику, умножают на 20 (коэффициент разведения).

При исследовании уровней секреторного иммуноглобулина А (sIgA) в фильтрате фекалий у детей первых трех лет жизни с РИ с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа обнаружены специфические особенности, которые характерны для гладкого и негладкого течения инфекционного процесса (см. таблицу). Так, у детей с негладким течение РИ выявляется выраженное снижение уровня sIgA в фильтрате фекалий при обследовании в динамике заболевания статистически достоверное как относительно контрольного диапазона, так и параметров концентрации sIgA при гладком течении РИ (Ме=261,0 мг/л [243,75:375,3]; Ме=298,88 мг/л [242,7:360.98]; Ме=164,3 мг/л [142,0:229,1], P₁<0,001, соответственно в контроле и у больных с гладким и негладким характером течения РИ), что позволяет использовать эти критерии для прогнозирования характера течения заболевания.

Концентрация sIgA в фильтрате фекалий у детей в динамике заболевания в зависимости от характера течения ротавирусной инфекции (Me, C₂₅-C₇₅) Показатели Здоровые дети N=40 Характер течения Гладкое N=40 Негладкое N=22 Me - + Me - + Me - + sIgA (мг/л) 261 243,75 375,3 298,88 242,7 360,98 164,3 142,0 229,1   P₁<0,001 P₂<0,001 Сравнение показателей концентраций sIgA осуществлялось при помощи вычисления медианы (Me) с указанием доверительного интервала [-,+] и оценивалось по критерию Манн-Уитни.
Примечание. P₁ - статистически достоверные различия с параметрами здоровых детей; P₂ - статистически достоверные различия с параметрами детей с гладким течением РИ.

Пример 1.

Больной Глеб А., 5 мес, поступил в стационар с диагнозом: Острая кишечная инфекция, гастроэнтерит средней тяжести, токсикоз с эскизом I степени. Из анамнеза заболевания известно, что мальчик заболел остро с появления повторной рвоты, частого жидкого стула, повышения температуры до субфебрильных цифр. Состояние при поступлении средней тяжести. Методом ИФА обнаружен антиген ротавируса в кале. Обследование кала выявило исходно низкую концентрацию sIgA до 100 мг/л. Больному проводилось комплексное лечение. При повторном обследовании на 5 день болезни показатель sIgA оставался сниженным и регистрировался на уровне 142,7 мг/л, что клинически сопровождалось отсутствием улучшения состояния на фоне проводимой терапии. Симптомы интоксикации сохранялись до 7 дней, дисфункция кишечника сохранялась до 14 дня болезни, неоднократно выявлялся ротавирус при контрольных исследования кала. Микробиологическое исследование кала выявило наличие дисбиотических нарушений в виде снижения общего количества кишечной палочки, основная масса которой (более 50%) была со слабо выраженными ферментативными свойствами, снижения количества лактобактерий.

На основании клинических данных и результатов проведенного комплексного обследования был выставлен диагноз: Ротавирусная инфекция, гастроэнтерит средней тяжести, токсикоз с эксикозом I степени, острое негладкое течение, дисбактериоз кишечника субкомпенсированная форма.

Особенностью функционирования местного звена иммунитета у детей с гладким течением РИ является нарастание уровня sIgA в течение болезни (Р<0,001, соответственно, в контроле и у больных с гладким и негладким течением РИ) (см. таблицу).

Пример 2.

Ангелина С., 9 мес, поступила в стационар с диагнозом: Острая кишечная инфекция, гастроэнтерит средней тяжести. Из анамнеза заболевания известно, что девочка заболела остро с появления жидкого стула до 8 раз, повторной рвоты, повышения температуры до 38,5°C. Состояние при поступлении средней тяжести. Методом ИФА обнаружен антиген ротавируса в кале. Обследование кала показало наличие исходно низкой концентрация sIgA 61,8 мг/л. При повторном обследовании на 5 день болезни показатели sIgA наросли до уровня 388,1 мг/л, что характеризует гладкое течение заболевания. На фоне проводимого лечения имела место быстрая положительная динамика - симптомы интоксикации купированы к 5 дню, стул нормализовался к концу недели, санация от возбудителя наступила в эти же сроки.

На основании клинических данных и результатов обследования был выставлен диагноз: Ротавирусная инфекция, гастроэнтерит средней тяжести, острое гладкое течение.

Таким образом, применение исследования уровней секреторного иммуноглобулина А (sIgA) в фильтрате фекалий методом ИФА у больных от РИ в зависимости от течения РИ показывает, что у детей с негладким течением РИ выявляют нарушение со стороны местного звена иммунитет как в начальном периоде заболевания, так и при обследовании в динамике, характеризующиеся низкими показателями sIgA в течение болезни. Несмотря на исходно низкие показатели sIgA, у больных с гладким течением РИ происходит активизация процессов иммунной защиты, сопровождающихся повышением уровня sIgA в динамике заболевания, что в свою очередь обеспечивает гладкое течение заболевания, благоприятный исход и полную санацию от возбудителя.

Использование предлагаемого способа позволяет с достаточной точностью выявить больных с более глубокими изменениями в системе местного иммунитета, что может быть использовано для определения прогноза течения ротавирусной инфекции. В свою очередь своевременная оценка течения РИ позволяет проводить адекватную терапию с включением в комплекс лечебных мероприятий средств иммунокоррекции.

Список использованных источников

1. Железнякова Г.Ф., Тихомирова О.В. // Медицинская иммунология. - 2004. - №№3-5. - С.307.

2. Васильев Б.Я., Васильева Р.И., Лобзин Ю.В. Острые кишечные заболевания. Ротавирусы и ротавирусная инфекция. - СПб.: Лань, 2000. - 268 с.

3. Блюгер А.Ф. Клиническая иммунология кишечных инфекций / А.Ф.Блюгер, Х.М.Векслер, И.Н.Новицкий // Рига: Звайгзне, 1980. - 212 с.

4. Харченко Г.А., Буркин А.В. Кишечные инфекции у детей раннего возраста. // М. - Феникс. - 2007, 286 с.

5. Железнякова Г.Ф., Иванова В.В. Значение иммунологических исследований при инфекционных болезнях у детей. // Детские инфекции - 2007. - Том 6. - №3. - С.7-16.

6. Александрова В.А. Основы иммунной системы желудочно-кишечного тракта. // СПб, МАПО. - 2006. - 44 с.

7. Корниенко Е.А. Актуальные вопросы коррекции кишечной микрофлоры у детей. // Методическое пособие. - М., 2006. - 48 с.

8. Карнаухова Е.Ю. Динамика факторов неспецифической резистентности. // Medline-Российский биомедицинский журнал. - 2007. - Том 8. - С.8-17.

9. Жуковская И.Г. Использование титансодержащих препаратов в комплексной терапии хронических цервицитов. // Автореферат. - Ижевск - 2007. - 24 с.

10. Molyneaux P.J. Human immunity to rotavirus // Med. Microbiol. 1995. Vol.43. P.397-404.

11. Ramig R.F. Pathogenesis of Intestinal and Systemic Rotavirus Infection / Journal of Virology, 2004, Vol.78, No. 19, p.10213-10220.

12. O'Neal C.M., Harriman G.R., Conner M.E. Protection of the Villus Epithelial Cells of the Small Intestine from Rotavirus Infection Does Not Require Immunoglobulin A. // Journal of Virology. - 2000. - Vol.74, No. 9. - P.4102-4109.

13. Мазанкова Л.А., Новокшонов А.А., Майкова И.Д. Микробиоценоз кишечника и иммунитет. // Детские инфекции. - 2007. - Том 6. - №1. - С.9-12.

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике в педиатрии, и может быть использовано для прогноза течения ротавирусной инфекции у детей. Для этого в кале определяют на 5-7 день болезни концентрацию секреторного иммуноглобулина A (sIgA). При снижении sIgA в кале от 142,0 до 229,1 мг/л прогнозируют негладкое течение заболевания. При повышении уровня sIgA от 242,7 до 360,98 мг/л прогнозируют гладкое течение ротавирусной инфекции. Способ позволяет выявить больных с глубокими изменениями в системе местного иммунитета на ранних стадиях болезни и проводить адекватную терапию с включением средств иммунокоррекции. 1 табл.

Способ прогноза течения ротавирусной инфекции у детей, включающий исследование кала, определение концентрации секреторного иммуноглобулина А, отличающийся тем, что концентрацию секреторного иммуноглобулина А определяют в динамике на 5-7 день болезни, и при сниженном уровне секреторного IgA в кале до Ме=164,3 мг/л [142,0:229,1] прогнозируют негладкое течение заболевания, а при повышении уровня секреторного IgA до Ме=298,88 мг/л [242,7:360,98] прогнозируют гладкое течение РИ.