СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИРОТАВИРУСНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА Российский патент 1999 года по МПК A61K39/42 A61K39/395 

Изобретение относится к области медицины, в частности, к иммунологии и может быть использовано для иммунопрофилактики и иммунотерапии ротавирусной инфекции.

Исследования последних лет показали (1), что важную роль в этилогии кишечных инфекций, наряду с бактериальной флорой, играют и вирусы, в основном, ротавирусы. Среди детей первых лет жизни ротавирус как единственный этиологический агент или в ассоциации с другими возбудителями кишечных инфекций обуславливает высокий процент заболеваемости ротавирусной диареей, иногда с летательным исходом.

В литературе описаны вспышки ротавирусных гастроэнтеритов с тяжелым течением не только у детей, но и взрослых. Тяжелое течение таких заболеваний, нередко с летальным исходом, особенно часто встречается в старших возрастных группах, с сопутствующей патологией (диабет, сосудистые заболевания и др.). Особенно опасна ротавирусная диарея для иммунокомпрометированных лиц (Х-связанная агаммаглобулинемия, IgA-дефицит, ятрогенный вторичный иммунодефицит, возникающий после облучения, иммуносупрессивной терапии и т.д.), у которых она может переходить в хроническую форму со всеми вытекающими отсюда последствиями. Если Х-связанная агаммаглобулинемия встречается очень редко, то IgA-дефицит может быть практически у каждого 10 000 жителя России. Поэтому разработка средств этиотропной терапии представляется актуальной как у детей, так и у взрослых.

Проводятся интенсивные исследования по разработке живой аттенуированной пероральной вакцины против ротавирусной диареи с использованием штаммов ротавируса человека и животных, однако до проведения массовой вакцинопрофилактики среди детей еще далеко, существующие химиотерапевтические препараты в основном мало эффективны.

Одним из перспективных аспектов иммунотерапии является применение иммуноглобулинов как молочных, так и сывороточных для лечения ротавирусной инфекции.

Серия работ посвящена применению концентрированных иммуноглобулинов молока от иммунизированных животных для профилактики и лечения заболеваний, вызываемых ротавирусами (J. Infection and Immunity, 1977, 268-270; Med. Microbiol. Immynol, 1985 174, 177-185). Молочные иммуноглобулиновые концентраты со специфической антительной активностью против ротавируса были получены путем иммунизации коров человеческим ротавирусом. Однако гетерологичные иммуноглобулины обладают рядом недостатков (возможность возникновения аллергических реакций, плохая усвояемость и т.д.).

Известен способ получения препарата, который выбран нами в качестве прототипа, содержащего в основном IgG-иммуноглобулин, для лечения ротавирусной инфекции. Препарат получен по методу Кона из сывороток крови людей с высоким титром естественно встречающихся антител к ротавирусу (2). По данным Losonsky G.A. et al. ротавирусная инфекция излечивается после орального применения иммуноглобулина, причем в фекалиях обнаруживаются иммунные комплексы ротавирус + иммуноглобулин, составляющие до 50% вводимого препарата. Количество ротавируса, не связанного в комплексах, уменьшалось, т.е. имела место элиминация вируса из кишечника. В моче больных обнаруживались фрагменты иммуноглобулинов, что может свидетельствовать о поступлении их в циркуляцию крови.

Однако недостатком способа является то, что препарат получают из сыворотки крови доноров с высокими титрами антител к ротавирусу в реакции торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА)-1:640, что встречается крайне редко, и возможности отбора сырья (донорских сывороток) для последующего получения специфического иммуноглобулинового препарата ввиду равномерного распределения низких титров противовирусных антител ограничены. Сбор закладки для получения препарата требует длительного времени, а объем ее обычно незначителен, соответственно и выход препарата небольшой, что при наличии такой широко распространенной инфекции как ротавирусная, создает определенный дефицит в препарате и увеличивает его себестоимость.

Задачей настоящего исследования являлась разработка способа получения антиротавирусного иммуноглобулина, позволяющего получать препарат масштабированно в больших количествах, удовлетворяющих спрос на него, с относительно низкой себестоимостью при сохранении высокой специфической активности. Нашими исследованиями показано, что несмотря на то, что исходные сыворотки доноров имеют низкий титр антител к ротавирусу 1:4, при получении из них иммуноглобулина, титры антител к ротавирусу возрастают и достигают величин, которые можно считать защитными при данной инфекции. Нами установлено, что имммуноглобулин человека нормальный может быть использован в качестве исходного сырья для выделения антиротавирусного иммуноглобулина. Титрование препаратов иммуноглобулинов на наличие антител к ротавирусу дает основание утверждать, что около 50% серий нормального иммуноглобулина человека могут использоваться как антиротавирусный иммуноглобулин. При исследовании 80 серий препаратов иммуноглобулина человека, нормального на наличие антител к ротавирусам, было обнаружено, что низкие титры (1:80) встречались в 22 образцах, средние титры (1:160 и 1:320) в 52 образцах и высокие (1:640) в 6 образцах. В 60 донорских сыворотках титры были низкие (1:4) (см. таблицу).

Важно, что иммуноглобулин человека нормальный получают из обычного сырья (донорской сыворотки), которое можно получать в больших количествах.

Сущность способа
Способ осуществляется следующим образом
Исходное сырье для получения антиротавирусного иммуноглобулина - иммуноглобулин человека нормальный - получают по традиционному методу Кона, т.е. фракционированием обычной донорской сыворотки этанолом при минусовых температурах (см. схему 1) (3).

Далее образцы полученных препаратов титруют на наличие антител к ротавирусам в реакции торможения непрямой гемагглютинации (РТНГА). Определение проводят с эритроцитарными ротавирусными диагностикумами иимуноглобулиновыми жидкими для РНГА и РТНГА (например, диагностикум фирмы "Ротатест", или другими аналогичными) по прилагаемым к ним инструкциям. Препараты с титрами антител к ротавирусу не ниже чем 1:160 объединяют.

Пример получения
Полученные по методу Кона препараты иммуноглобулина человека нормального (10 серий) титровали в РТНГА на наличие антител к ротавирусу.

Постановка РТНГА
Для постановки РТНГА требуются следующие ингредиенты:
1. Дистиллированная вода.

2. Полистироловые планшеты.

3. Асцитная жидкость иммунизированных ротавирусом крыс (ИАЖ).

4. Диагностикум эритроцитарный ротавирусный иммуноглобулиновый (ЭД) - формалинизированные эритроциты барана, покрытые иммуноглобулином крыс, и иммунизированных ротавирусом обезьян.

5. Антиген ротавируса сухой (АГ).

Антиген растворяют 0,9%-ным раствором хлорида натрия в объеме, указанном на этикетке, получая разведение 1:32. Для проведения РТНГА используют АГ в рабочем разведении, содержащем 4 агглютинирующих единицы (АЕ) в 25 мкл. Для определения рабочего разведения антиген титруют в РНГА.

Титрование антигена. Готовят в планшетах 2 ряда двукратных разведений антигена ротавируса от 1:32 до 1:8192. Для этого во вторые-шестые лунки двух рядов вносят по 25 мкл 0,9%-ного раствора хлорида натрия, в каждую лунку второго ряда 25 мкл ИАЖ (контроль специфичности реакции). Планшет встряхивают для перемешивания реагентов и оставляют при температуре 15-25^oC на 20 мин. Затем во все лунки вносят по 25 мкл ЭД. Планшет встряхивают и оставляют при температуре 15-25^oC для оседания эритроцитов.

Контроль РТНГА
1. Положительный контроль с ИАЖ. Выполняют по методике РТНГА.

2. Контроль рабочей дозы антигена. Рабочую дозу антигена разводят 2, 4, 8, 16 раз и выполняют по методике РНГА.

3. Контроль ЭД на неспецифическую агглютинацию. В 2-3 лунки вносят по 50 мкл 0,9%-го раствора хлорида натрия и 2 мкл ЭД.

4. Контроль исследуемого иммуноглобулина. Смешивают по 25 мкл иммуноглобулина в разведении 1:4 0,9%-ного раствора хлорида натрия и ЭД.

Учет результатов РТНГА
Проводят после полного оседания эритроцитов следующим образом:
0 - 1 + - положительная реакция;
2 + - сомнительная реакция;
3 - 4 + - отрицательная реакция.

В контроле 1 должна быть положительная реакция в первых лунках. Результат контроля 2 должен соответствовать титру АГ при определении рабочей дозы. В контроле 3 и 4 агглютинация должна отсутствовать.

Определение антител к ротавирусам. Наибольшее разведение АГ, которое вызывает агглютинацию 3+, соответствует 1 АЕ. Готовят рабочее разведение, содержащее 4 АЕ. Например, при титре АГ 1:1024 его рабочее разведение будет равно 1:256.

Исследуемые серии иммуноглобулина разводят 9,0%-ным раствором хлорида натрия 1:4 и прогревают 30 мин в водяной бане при температуре (56±1)^oC.

РТНГА проводят в объеме 75 мкл. Готовят двукратные разведения иммуноглобулина от 1:4 до 1:1024 в объеме 25 мкл на 0,9%-ном растворе хлорида натрия. Во все лунки с разведением иммуноглобулина добавляют по 25 мкл антигена (4 АЕ). Планшет встряхивают и оставляют на 20 мин при 15-25^oC, затем вносят во все лунки по 25 мкл ЭД. Планшет встряхивают и оставляют на 1,5 - 2 ч при температуре 15 - 25^oC.

Титром иммуноглобулина считают его наибольшее разведение, которое дает положительную реакцию (0 - 1+) с 4 АЕ антигена.

Из 10 серий пять содержали титр 1:160 - 1:320 т.е. считались антиротавирусным препаратом.

Иммуноглобулиновый препарат с титрами 1:160 - 1:320 в РТНГА был применен в клиниках на детях, больных острыми кишечными инфекциями (ОКИ) ротавирусной этиологии (253 ребенка в возрасте от 3-х месяцев до 5 лет), без назначения каких-либо антибактириальных средств. 102 ребенка составили контрольную группу, получавшую общепринятую терапию (антибактериальные препараты, препараты для оральной регидратации, ферменты и т.д.). Группы больных были рандомизированы по возрасту и тяжести заболевания (тяжелые и среднетяжелые формы). Достоверность результатов проведенных исследований констатировалась оценкой клинической эффективности на основании использования двойного слепого метода.

Препараты назначили перорально за 20-30 мин до еды по 1 ампуле три раза в день в течение 4-5 дней. Контрольная группа получала обычный курс антивирусной терапии. Результаты испытаний позволили сделать следующие выводы:
1. При введении детям, больным ротавирусной инфекцией (лабораторное подтверждение), антиротавирусного иммуноглобулина побочные реакции отсутствовали (т. е. препарат не вызывает аллергических реакций, нетоксичен, нереактогенен).

2. Клиническая эффективность у больных, получавших антиротавирусный иммуноглобулин, составила 93,1%.

3. Стул нормализовался быстрее при лечении антиротавирусным иммуноглобулином - 2,9 дня (в контроле 6,5 дня).

4. Антиротавирусный иммуноглобулин способствовал элиминации (удалению) ротавируса. Санация отмечена у 63% больных, получавших иммуноглобулин (в контроле - 42%).

5. При приеме антиротавирусного иммуноглобулина установлено нарастание числа лакто- и бифидобактерий, а также кишечной палочки с нормальной ферментацией, в динамике заболевания, что не наблюдалось в контроле.

6. Получены положительные результаты лечения ротавирусной диареи антиротавирусным иммуноглобулином у взрослых (60 больных).

Предложенный нами препарат антиротавирусного иммуноглобулина человека для энтерального применения способствовал улучшению исхода лечения больных тяжелой и среднетяжелой формой ротавирусной инфекции и рекомендован для внедрения в практику здравоохраннения.

Литература
1. А.Г. Букринская, Н.М. Грачева, В.И. Васильева. Ротавирусная инфекция. - М.: "Медицина", 1989.

2. G.A. Losonsky, J.P. Johnson, J.A. Winkelstein, R.J. Jolken. J. Clin. Invest., 1995, 76, 6, 2362-2367.

3. Н. В. Холчев, Я.И. Колесникова. О методах получения и стандартизации гамма-глобулина. - Материалы 13-го съезда гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов, инфекционистов. М., 1959 г. 2, с. 729-731.

Изобретение относится к медицине и касается способа получения антиротавирусного иммуноглобулина, который может использоваться для иммунопрофилактики и иммунотерапии ротавирусной инфекции. Сущность изобретения заключается в разработке способа получения антиротавирусного иммуноглобулина, включающего выделение иммуноглобулина нормального фракционированием обычной донорской сыворотки этанолом при минусовых температурах по методу Кона, исследованием его на наличие антител к ротавирусу в реакции торможения непрямой гемагглютинации и объединением препаратов с титрами антител к ротавирусу не менее 1: 160. Технический результат заключается в разработке способа, позволяющего получать препарат масштабированно в больших количествах при сохранении высокой специфической активности. 1 ил., 1 табл.

Способ получения антиротавирусного иммуноглобулина для энтерального введения, отличающийся тем, что иммуноглобулин человека нормальный выделяют по методу Кона фракционированием обычной донорской сыворотки этанолом при минусовых температурах, исследуют его на наличие антител к ротавирусу в реакции торможения непрямой гемагглютинации и препараты с титрами антител к ротавирусу не менее 1 : 160 объединяют.