НАБОР РЕАГЕНТОВ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕКРЕТОРНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА A В СЫВОРОТКЕ И СЕКРЕТАХ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ ОДНОСТАДИЙНОГО ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА Российский патент 2007 года по МПК G01N33/577 C12N5/12 C07K16/18 

Изобретение относится к иммунобиотехнологии, а именно к созданию диагностического набора, который предназначается для иммуноаналитических методов количественного определения секреторного иммуноглобулина А в сыворотке и секретах организма человека при установлении статуса местного иммунитета, выявлении вторичных иммунодефицитных состояний, при выявлении дисбиотических нарушений кишечника, мониторинге бактериотерапии и антибиотикотерапии.

Известно, что слизистые оболочки открытых биотопов (респираторного, кишечного, урогенитального трактов, ротовой полости, конъюнктивы глаза и др.) являются входными воротами для возбудителей инфекции. Поэтому развитие инфекционных заболеваний в значительной степени зависит от уровня неспецифической резистентности и уровня местного иммунитета слизистых оболочек. Показано, что дефицит IgA лежит в основе многих хронических воспалительных заболеваний слизистых оболочек и различных видов аллергии (1).

Определение уровня секреторного иммуноглобулина А в сыворотке и секретах (слюне) осуществляется с помощью метода Манчини. Метод основан на способности антител и антигена образовывать в зоне эквивалентных количественных соотношений нерастворимый иммунный комплекс. Этот метод лежит в основе полуколичественного определения IgA радиальной иммунодиффузией (РИД) в геле (1). Время проведения реакции РИД составляет 18-48 ч. Стандартизованных и официально зарегистрированных диагностических наборов реагентов для РИД нет ни в России, ни за рубежом, поэтому показатели уровней IgA в сыворотке и слюне у разных авторов неоднозначны (1-5). В литературе отсутствуют данные о показателях местного иммунитета слизистых секретов человека в норме. Однако наличие существенных изменений в системе местного иммунитета при патологических процессах отмечается многими исследователями.

Лабораторная оценка дисбиотических нарушений кишечника базируется на микробиологическом анализе фекалий (6, 7). Забор материала в количестве от 0,1 до 1 г для исследований осуществляется в стерильные одноразовые бакпечатки и доставляются в лабораторию для исследований в течение 1-2 час. Хранение проб недопустимо. Микробиологический посев материала фекалий производится из серии стандартных десятикратных разведении в физиологическом растворе капельным путем и методом распределения по поверхности питательной среды.

Учет микробиологических посевов осуществляется без выделения чистых культур по результатам количественной оценки и описанию морфологии выросших колоний через 24, 48, 72 и 120 час термостатирования соответственно ростовым особенностям каждого конкретного вида микроорганизмов. Для оценки результатов микроскопирования лактобацилл и бифидобактерий проводится окраска методом простого окрашивания с использованием карболового фуксина, метиленового синего, а также методом дифференциального окрашивания по Граму (8).

Микробиологическими критериями служат состояние бифидо- и лактофлоры, снижение количества эшерихий, появление штаммов кишечной палочки с измененными свойствами, повышение количества кокков, обнаружение условно-патогенных грамотрицательных палочек, а также грибов. В оценке степени дисбактериоза нет единой точки зрения, так как часто используются разные клинико-лабораторные критерии (9-12). При оценке результатов микробиологического анализа фекалий исходят из показателей условной нормы (11).

Бактериологический метод диагностики дисбактериоза имеет целый ряд существенных недостатков, к которым можно отнести не только его трудоемкость и длительность проведения необходимых бактериологических тестов, относительную субъективность получаемых результатов, но и недооценку роли некультивируемых представителей кишечного микробиоценоза, а также возможности получения несовпадающих результатов при повторном исследовании, как следствие различного роста бактерий в условиях организма хозяина и на искусственных питательных средах. Исследования по выявлению анаэробных микроорганизмов трудоемки требуют специальных питательных сред, которые отечественной промышленностью не выпускаются.

Описанные выше методики могут служить аналогами заявляемому изобретению.

Прототипом заявляемому изобретению могут служить наборы реагентов для количественного иммуноферментного определения sIgA в секретах организма, описанные в 13 и 14.

В состав наборов входят планшеты с иммобилизованными моноклональными антителами к sIgA. После инкубации с сывороткой или другими биологическими жидкостями присутствие sIgA обнаруживается связыванием конъюгата козьих поликлональных антител к α-цепи sIgA с пероксидазой хрена. Концентрация sIgA (мкг/мл) в разных биологических жидкостях при использовании этого набора реагентов (13):

Сыворотка (в норме) (n=40) - 0,94-2,73

Женское молоко (n=6) - 1374-15100

Желчь (n=7) - 25,4-89,1

Слюна (n=8) - 81,5-130

Смыв (100 мл физраствора) тощей кишки (n=4) - 38,5-95,5

Моча (n=5) - 0-58,4

Слезы (n=4) - 0,51-1,18

Бронхоальвеолярный смыв (150 мл физраствора) (n=6) - 0,19-48,3

Вагинальный смыв (10 мл физраствора) (n=7) - 0,186-22,3

Набор реагентов, предназначенный для количественного определения sIgA в различных биологических жидкостях, содержит планшеты с иммобилизованными моноклональными антителами к секреторному компоненту, с которыми связывается sIgA анализируемого образца, а меченные пероксидазой моноклональные антитела против α-цепи sIgA выявляют связавшийся с твердой фазой sIgA. Концентрация sIgA в мкг/мл биологических жидкостей здоровых лиц при использовании этого набора реагентов (14):

Сыворотка - 2,86±1,25

Слюна - 207,5±92,2

Моча - 14,6±9,5

Слезная жидкость - 76,04±17,58

Бронхоальвеолярный лаваж - 7,3±6,0

Вагинальный секрет - 85,03±27,16

Цель изобретения заключается в разработке метода количественного определения sIgA в сыворотке, секретах человека, пригодного для оценки статуса местного иммунитета слизистых оболочек открытых биотопов, в фекалиях, пригодного для оценки функциональных нарушений экосистемы толстого кишечника, выбору адекватной комплексной терапии, оценке ее эффективности, а также для динамического наблюдения за адаптацией организма к различного рода воздействиям.

Поставленная цель достигается:

1) проведенным нами комплексным исследованием, включающим изучение микробиоценоза и уровня sIgA в фекалиях. Мы показали, что процесс адаптации организма космонавтов к предполетной подготовке, космическому полету и приземлению реализуется через ряд изменений: снижение защитных групп микроорганизмов, появление условно-патогенной микрофлоры, формирование дисбактериоза на фоне увеличения уровня sIgA в фекалиях. Аналогичная картина получена в модельных экспериментах на приматах. Это значит, что уровень sIgA практически может служить удобным маркером стрессовых изменений микрофлоры и показателем физиологического состояния организма при нагрузках, определяя степень отклонения естественной резистентности организма от индивидуальной физиологической нормы (15);

2) использованием пары высокоспецифических мышиных моноклональных антител к sIgA, продуцируемых штаммами гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus L №РККК (П) 676Д и 677Д.

Разработанный нами набор предназначается для количественного определения sIgA в сыворотке, секретах открытых биотопов организма. Результаты определения содержания sIgA могут использоваться для установления статуса местного иммунитета, выявления иммунодефицитных состояний, оценке функциональных нарушений экосистемы толстого кишечника, контроля антибиотикотерапии и бактериотерапии. Изобретение относится к биологии и медицине и может быть использовано для оценки функционирования системы местного иммунитета сыворотки и открытых биотопов (кишечник, урогенитальный тракт, верхние дыхательные пути и др.).

Набор содержит планшет с иммобилизованными моноклональными антителами, пять калибровочных проб (содержащих 0; 1,0; 5,0; 10,0; 20,0 мкг/мл sIgA), конъюгат мышиных моноклональных антител с пероксидазой хрена, реагенты для энзиматической реакции. На носитель иммобилизованы мышиные моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus L №РККК (П) 676Д. Конъюгат содержит мышиные моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus L №РККК (П) 677Д. В качестве калибровочных проб используется sIgA молозива человека с 1% сывороточным альбумином.

Проведение анализа

Освободить планшет от упаковки. В лунки планшета внести в дубликатах по 20 мкл каждой калибровочной пробы и по 25 мкл контрольного образца. В остальные лунки внести в дубликатах по 20 мкл исследуемых образцов. Во все лунки добавить по 100 мкл раствора конъюгата антител к sIgA с пероксидазой и инкубировать при температуре 37°С в течение 1 ч. По окончании инкубации удалить содержимое лунок и промыть 4 раза рабочим раствором для промывания планшетов по 200 мкл в лунку. Добавить во все лунки по 100 мкл проявляющего раствора, инкубировать при температуре 37°С 15 мин. Остановить реакцию добавлением во все лунки по 100 мкл 4,8% серной кислоты. Измерить оптическую плотность в лунках на фотометре вертикального сканирования при длине волны 450 нм. Основные характеристики набора приведены в таблице 1.

Следует отметить, что диагностического набора для количественного иммуноферментного определения уровня sIgA в секретах (включая фекалии) ранее известно не было, найденное нами техническое решение в литературе не описано и отработано в результате проведения большой серии экспериментов, т.е. предлагаемое изобретение соответствует критериям оригинальности, новизны и изобретательского уровня.

Примеры практического применения изобретения (таблицы 2 и 3).

Приготовление образцов для анализа.

Образцы для анализа собирали из первой порции свежевыделенных фекалий. Для микробиологического исследования материал доставляли не позднее, чем через 2 часа после забора. Состояние микробиоценоза кишечника оценивали по 6.

Для определения уровня sIgA готовили копрофильтраты на физрастворе с концентрацией 30-50 мг фекалий/мл физраствора, размешивали на вихревом смесителе в течение 1 ч, центрифугировали при 3000 об/мин. В супернатантах определяли уровень sIgA с помощью данного набора.

Слюну собирали в пробирки, замораживали при -20°С и хранили при этой температуре до анализа. Перед анализом размораживали и центрифугировали при 3000 об/мин. В супернатанте определяли sIgA.

Бронхоальвеолярный смыв получали введением 100 мл физиологического раствора с последующей активной аспирацией смыва и последующим центрифугированием при 3000 об/мин. В супернатанте определяли sIgA.

Пример 1. В фекалиях 15 детей в возрасте от 1,5 мес. до 5 лет без отклонений в микробиоценозе кишечника (эубиоз) уровень sIgA составлял 82,63±56,37 мкг/г фекалий.

Пример 2. В фекалиях 67 часто болеющих детей в возрасте от 1 мес до 8 лет (частые острые респираторные заболевания, признаки атопического дерматита, различные отклонениями в микрофлоре толстого кишечника: дисбактериоз от 1 до 3 степени выраженности) уровень sIgA составлял 184,23±84,02 мкг/г фекалий.

Пример 3. В фекалиях 33 часто болеющих детей с отклонениями в кишечной микрофлоре после трехнедельного курса бактериотерапии пробиотиками уровень sIgA составлял 99,2±54,62 мкг/г фекалий.

Пример 4. В фекалиях 51 пациента медсанчасти аэропорта с различными заболеваниями (частые острые респираторные заболевания, гастриты, язвенная болезнь, колиты, нейродермиты, панкреатиты, холецеститы), осложненные дисбактериозом 1-4 степени выраженности, уровень sIgA составлял 875±119 мкг/г фекалий.

Пример 5. В фекалиях 26 пациентов медсанчасти аэропорта с различными заболеваниями (частые острые респираторные заболевания, гастриты, язвенная болезнь, колиты, нейродермиты, панкреатиты, холецеститы), осложненные дисбактериозом 1-4 степени выраженности, после двухнедельного курса бактериотерапии бифидумбактерином и лактобактерином уровень sIgA составлял 288±101 мкг/г фекалий.

Таблица 1.Основные характеристики диагностического набора для количественного определения sIgA.Измеряемый параметрХарактеристикаПринцип анализаТвердофазный иммуноферментный одностадийныйТвердая фазаМикропланшеты полистироловыеДиапазон измерения1-20 мкг/млВремя анализа1 ч + 15 минОбъем пробы анализа25 мклЧувствительность0,2 мкг/млKB4,5

Таблица 2.Уровни sIgA в фекалиях разных групп пациентов№Группы обследуемыхnsIgA (M±m) мкг/г1.Дети в возрасте от 1,5 мес до 5 лет без отклонений в микрофлоре (эубиоз)1582,63±56,372.Часто болеющие дети в возрасте от 1 мес до 8 лет с различными отклонениями в микрофлоре толстого кишечника (дисбактериоз от 1 до 3 степени выраженности)67184,23±84,023.Пациенты (работники наземных служб аэропорта) медсанчасти аэропорта с различными заболеваниями, осложненными дисбактериозами51875±1194.Пациенты (работники наземных служб аэропорта) медсанчасти аэропорта с различными заболеваниями, осложненными дисбактериозами после двухнедельного курса бактериотерапии26288±1015.Часто болеющие дети с отклонениями в кишечной микрофлоре после трехнедельного курса бактериотерапии3399,20±54,62

Таблица 3.Уровни sIgA в секретах практически здоровых людейСекретsIgA (M±m) мкг/ гСлюна (n=24)130,1±45,5 мкг/млСыворотка (n=28)0,602±0,17 мкг/ млБронхоальвеолярный смыв (n=7)46,3±2,2 мкг/млФекалии (детей от 1,5 мес. до 5 лет) (n=15)82,63±56,37 мкг/ г

Литература

1. Хаитов P.M., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология.(1995), "ВНИРО", М., 218 с.

2. Кирюхин А.В., Парфенова Н.А., Максимова Т.А., Шеногина Н.А., Львов А.В., Чумакова М.М., Андронова Т.М. Оптимизация лечения часто и длительно болеющих детей: иммунокоррекция ликопидом. Иммунология (2003), №1, с.47-50.

3. Мастернак Ю.А., Лусс Л.В. Влияние полиоксидония на показатели иммунного статуса лиц пожилого возраста. Иммунология (2002) №6, с.343-346.

4. Clinical Guide to Laboratory tests. (Ed. Tietz N.W.) 3^d issue. W.B.Saunders Company (USA), 1995, p.354.

5. Першин Б.Б., Кузьмин С.Н., Кочкуркин В.Н. и др. Реакции местного иммунитета у пловцов сборной страны. Ж. микр., эпид. и иммунобиол. 1996, №1, с.53-57.

6. Методические рекомендации Медицинского центра Управления делами президента РФ, "Комплексная диагностика, лечение и профилактика дисбактериоза кишечника в клинике внутренних болезней", М., 1997.

7. Учебное пособие для врачей и студентов ММА им.Сеченова "Дисбактериозы у детей". Под редакцией А.А.Воробьева и С.Г.Пака, М., 1998.

8. Методы общей бактериологии под ред. Герхарда, М., 1986, 1 т., стр.31-33, 67-68.

9. Куваева И.Б., Ладодо К.С "Микробиологическая классификация дисбактериоза толстой кишки";

10. Гончарова Г.И., Грачева Н.В. "Классификация дисбактериозов по степени тяжести", М., 1986.

11. Бондаренко В.М. "Состав микрофлоры кишечника в норме", М., 1998.

12. Копанев Ю.А., Соколов А.Л. Дисбактериоз кишечника: микробиологические, иммунологические и клинические аспекты микроэкологических нарушений у детей. М., 2002, 146 с.

13. Vincent С., Revillard J.P. Sandwich-type ELISA for free and bound secretory component in human biological fluids. J.Immun.Meth. 1988, v.106, p.153-160.

14. Галкина О.В., Грязева И.В., Климович В.Б. и др. Количественное определение секреторного иммуноглобулина А в биологических жидкостях с помощью моноклональных антител. Медицинская иммунология. 2000, т.2, №2, стр.155.

15. Виха Г.В. Клинико-экспериментальное обоснование разработки тест-систем выявления стрессзависимых маркеров для изучения механизмов адаптации организма в экспериментальных ситуациях. Автореф. дис... доктора биол. наук, М., 2002.

Изобретение относится к набору реагентов для количественного определения секреторного иммуноглобулина A (sIgA), который позволяет устанавливать статус местного иммунитета и иммунодефицитные состояния при анализе сыворотки и секретов организма человека. Набор содержит планшет с иммобилизованными моноклональными антителами, пять калибровочных проб (содержащих 0; 1,0; 5,0; 10,0; 20,0 мкг/мл sIgA, конъюгат мышиных моноклональных антител с пероксидазой хрена, реагенты для энзиматической реакции. На носитель иммобилизованы мышиные моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus L №РККК (П) 676Д. Конъюгат содержит мышиные моноклональные антитела, продуцируемые другим штаммом - Mus.musculus L №РККК (П) 677Д. Преимущество изобретения заключается в повышении чувствительности при определении sIgA. 3 табл.

Набор реагентов для количественного одностадийного иммуноферментного определения секреторного иммуноглобулина A (sIgA) в сыворотке крови и секретах, содержащий носитель с иммобилизованными первыми мышиными моноклональными антителами к sIgA человека, конъюгат с пероксидазой вторых мышиных моноклональных антител к sIgA, калибровочные пробы, содержащие sIgA молозива человека, отличающийся тем, что в качестве первых антител он содержит мышиные моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus L N РККК (П) 676Д, а в качестве вторых антител используют мышиные моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus L N РККК (П) 677Д.