СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ПАСТЕРЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ Российский патент 2007 года по МПК A61K39/102 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии, может быть использовано при разработке средств специфической профилактики, в частности для получения вакцины против пастереллеза животных.

Известен способ получения вакцины против пастереллеза животных путем культивирования пастерелл в жидкой питательной среде, исследование физико-химических и биологических показателей в процессе роста бактериальной массы с последующим прекращением культивирования пастерелл, концентрированном их и инактивацией формалином (Патент РФ №2246316, Бюл. №5, опубл. 20.02.2005, МКИ⁷ А61К 39/02). Известный способ получения вакцины против пастереллеза животных основан на технологии выращивания пастерелл (Р. multocida сероварианты A, B, D, штаммы №№1231, 681, Т-80) при производстве противопастереллезных вакцин, включающий определение и установление рН, типичности и чистоты роста производственных штаммов, концентрации микробных клеток в культуре, обеспечивающий получение стандартизованных по количеству микробных клеток в препарате. В соответствии с разработанной технологией выращивания, производственное глубинное культивирование пастерелл проводят обычно до 12-14 часов, достигая при этом максимального числа клеток, находящихся в культуре во время стационарной фазы роста. Культивирование прекращают тогда, когда концентрация микробов перестает увеличиваться. Обычно производственную противопастереллезную вакцину готовят с высокой концентрацией бактериальных клеток с оптической плотностью до 25 млрд м.т./см³ пастерелл каждого штамма и которая, в большинстве случаев, реактогенна.

Недостатками известного способа является длительность получения вакцины против пастереллеза животных, а также низкое качество целевого продукта, выявляемое в низкой иммуногенности при высоком содержании балластных веществ, реактогенностью, обуславливающей сенсибилизацию организма животных.

Задачей заявленного технического решения является повышение качества целевого продукта за счет обогащения его протективными поверхностными растворимыми антигенами (что повышает антигенную и иммуногенную активности, уменьшает неспецифическую нагрузку на иммунную систему животных и снижает реактогенность), а также ускорение способа.

Поставленная задача решается в способе получения вакцины против пастереллезов животных путем культивирования пастерелл в жидкой питательной среде, исследование физико-химических и биологических показателей в процессе роста бактериальной массы с последующим прекращением культивирования пастерелл, концентрированном их и инактивацией формалином, тем что дополнительно определяют в культуральной жидкости, освобожденной от клеточной бактериальной массы, активность растворимых поверхностных антигенов в реакции пассивной гемагглютинации, а прекращение культивирования пастерелл осуществляют при ее значении для Р. multocida серологических вариантов A, B, D как 1:512-1024, 1:1024-2048, 1:1024-2048 соответственно, при этом целевой продукт получают концентрированием в 3-5 раз культуральной жидкости, освобожденной от клеточной бактериальной массы.

В патентной и научно-технической литературе не известны технические решения, содержащие режимы получения вакцины против пастереллезов животных, аналогичные заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию «новизна».

Все режимы способа осуществимы в лабораторных и промышленных условиях, направлены на решение реальной технической задачи, т.е. предложение «промышленно применимо».

Существующие вакцины против пастереллезов животных изготавливают из бактериальной массы пастерелл, выращенной без учета протективной характеристики компонентов клетки возбудителей, функционально относящихся к факторам патогенности. Реакторное культивирование пастерелл до стационарной фазы роста бактерий производится без учета выявления, определения уровня специфической активности, сохранения этой активности и распределения в среде роста протективных поверхностных растворимых антигенных комплексов. Процесс культивирования проводится в неконтролируемом по факторам патогенности режиме. Нами впервые установлено, что при получении максимального выхода биомассы, как это в настоящее время принято при промышленном культивировании, снижается качество антигенного материала, так как по достижении определенной фазы развития культуры под действием собственных ферментов в процессе старения культуры происходят деструктивные изменения части компонентов поверхностных антигенов, что обуславливает потери иммунологически активного материала и недопустимо при производстве эффективных противобактерийных препаратов. Впервые предложен способ получения вакцины против пастереллезов животных, в котором вместо определения критерия количества клеток пастерелл по физико-химическим и биологическим показателям максимальный уровень производства антигенов определяют по уровню активности растворимых поверхностных антигенов пастерелл в реакции пассивной гемагглютинации в культуральной жидкости, освобожденной от клеточной бакмассы, что позволяет получить неочевидный положительный эффект - повышение качества целевого продукта и ускорение способа, т.е. предложение соответствует критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Способ иллюстрируется на следующих примерах.

Пример 1.

Получают гидроокисьалюминиевую вакцину против пастеррелеза крупного рогатого скота и овец.

Для этого отобраны три производственных штамма Р. multocida серологических вариантов A, B, D №№1231, 681, Т-80, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 10% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 37°С в течение 10 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.

Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость, освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в РПГА, в частности данный показатель уровня активности для Р. multocida серовариантов A, B, D через 10 часов культивирования был равен 1:512; 1:1024; 1:1024 соответственно.

Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при 37°С ± 1°С, периодически перемешивая каждые 4 часа.

По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма центрифугируют при 15 тыс. об/мин. Полученный супернатант (культуральная бесклеточная жидкость) концентрируют на ультрафильтрационной установке в 5 раз, после чего концентраты исследуют в РПГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех 3-х серологических вариантов Р. multocida A, B, D в диапазоне 1:4096; 1:5120; 1:5120 соответственно, и готовят вакцину согласно известному способу.

Пример 2.

Получают гидроокисьалюминиевую вакцину против пастеррелеза крупного рогатого скота и овец.

Для этого отобраны три производственных штамма Р. multocida серологических вариантов A, B, D №№1231, 681, Т-80, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 10% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 37°С в течение 8 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.

Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в РПГА, в частности данный показатель уровня активности для Р. multocida серовариантов A, B, D через 8 часов культивирования был равен 1:512; 1:1024 и 1:512 соответственно.

Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при 37°С ± 1°С, периодически перемешивая каждые 4 часа.

По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма центрифугируют при 15 тыс. об/мин. Полученный супернатант (культуральная бесклеточная жидкость) концентрируют на ультрафильтрационной установке в 3 раза, после чего концентраты исследуют в РПГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех 3-х серологических вариантов Р. multocida A, B, D в диапазоне 1:2048; 1:4096 и 1:2048 соответственно и готовят вакцину согласно известному способу.

Пример 3.

Получают гидроокисьалюминиевую вакцину против пастеррелеза крупного рогатого скот и овец.

Для этого отобраны три производственных штамма Р. multocida серологических вариантов A, B, D №№1231, 681, Т-80, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 11% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 36°С в течение 9 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.

Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в РПГА в частности, данный показатель уровня активности для Р. multocida серовариантов А, В, D через 9 часов культивирования был равен 1:1024; 1:1024 и 1:2048, соответственно.

Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течении 24 часов при 37°С ± 1°С, периодически перемешивая каждые 4 часа.

По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма, центрифугируют при 15 тыс об/мин. Полученный супернатант (культуральная бесклеточная жидкость) концентрируют на ультрафильтрационной установке в 4 раза, после чего концентраты исследуют в РПГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех 3-х серологических вариантов Р. multocida A, B, D в диапазоне 1:4096; 1:4096 и 1:8192 соответственно, и готовят вакцину согласно известному способу.

Пример 4.

Получают эмульгированную вакцину против пастеррелеза свиней.

Для этого отобраны три производственных штамма Р. multocida серологических вариантов A, B, D №№1231, 681, Т-80, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 12% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 38°С в течение 10 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.

Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость, освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в РПГА, в частности данный показатель уровня активности для Р. multocida серовариантов A, B, D через 10 часов культивирования был равен 1:512; 1:1024; 1:1024 соответственно.

Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при 38°С периодически перемешивая каждые 4 часа.

По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма центрифугируют при 15 тыс. об/мин. Полученный супернатант (культуральная бесклеточная жидкость) концентрируют на ультрафильтрационной установке в 5 раз, после чего концентраты исследуют в РПГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех 3-х серологических вариантов Р. multocida A, B, D в диапазоне 1:4096; 1:5120; 1:5120 соответственно и готовят вакцину согласно известному способу.

Пример 5.

Получают эмульгированную вакцину против пастеррелеза свиней.

Для этого отобраны три производственных штамма Р. multocida серологических вариантов A, B, D №№1231, 681, Т-80, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 10% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 37°С в течение 8 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.

Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость, освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемый по уровню титров в РПГА, в частности данный показатель уровня активности для Р. multocida серовариантов A, B, D через 8 часов культивирования был равен 1:512; 1:1024 и 1:512 соответственно.

Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при 37°С ± 1°С, периодически перемешивая каждые 4 часа.

По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма центрифугируют при 15 тыс. об/мин. Полученную культуральную жидкость концентрируют на ультрафильтрационной установке в 5 раз, после чего концентраты исследуют в РПГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех 3-х серологических вариантов Р. multocida A, B, D в диапазоне 1:2048; 1:4096 и 1:2048 соответственно и готовят вакцину согласно известному способу.

Пример 6.

Получают эмульгированную вакцину против пастеррелеза свиней.

Для этого отобраны три производственных штамма Р. multocida серологических вариантов A, B, D №№1231, 681, Т-80, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 8% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,0 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 36°С в течение 9 часов. Каждый штамм выращивают отдельно.

Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют активность поверхностных растворимых антигенов в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с антителами, полученными на поверхностные растворимые антигены пастерелл. Объектом исследования служит супернатант - культуральная жидкость, освобожденная от клеток двукратным центрифугированием при 14000 об/мин и фильтрованием через стерилизующие пластины. Культивирование проводят до максимального накопления поверхностных растворимых антигенов в среде роста, определяемого по уровню титров в РПГА, в частности данный показатель уровня активности для Р. multocida серовариантов A, B, D через 9 часов культивирования был равен 1:1024; 1:1024 и 1:2048 соответственно.

Полученную баксуспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при 36°С, периодически перемешивая каждые 4 часа.

По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма центрифугируют при 15 тыс. об/мин. Полученный супернатант (культуральная бесклеточная жидкость) концентрируют на ультрафильтрационной установке в 4 раза, после чего концентраты исследуют в РПГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех 3-х серологических вариантов Р. multocida A, B, D в диапазоне 1:4096; 1:4096 и 1:8192 соответственно и готовят вакцину согласно известному способу.

Пример 7.

Получают эмульгированную вакцину против пастеррелеза свиней, согласно известному способу /прототипу/.

Для этого отобраны три производственных штамма Р. multocida серологических вариантов A, B, D №№1231, 681, Т-80, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 10±2% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,01 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 37°С ± 1°С в течение 14 часов. Каждый штамм выращивают отдельно. Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют концентрацию микробных клеток. Культивирование проводят до максимального накопления микробных клеток в среде роста, в частности данный показатель был равен 23,2; 25,5; 22,4 млрд м. к./см³ через 14 часов культивирования для Р. multocida серовариантов A, B, D, соответственно.

Полученную суспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при температуре 37°С ± 1°С, периодически перемешивая каждые 4 часа.

По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма центрифугируют при 15 тыс. об/мин.

Полученную культуральную жидкость концентрируют на ультрафильтрационной установке в 5 раз, после чего концентраты исследуют в РПГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех трех серовариантов Р. multocida A, B, D в диапазоне 1:256; 1:512 и 1:512 соответственно и готовят вакцину согласно известному способу.

Пример 8.

Получают гидроокисьалюминиевую вакцину против пастеррелеза крупного рогатого скот и овец согласно известному способу /прототипу/.

Для этого отобраны три производственных штамма Р. multocida серологических вариантов A, B, D №№1231, 681, Т-80, которые засевают в промышленный биореактор с производственной средой из расчета 10±2% к объему питательной среды и тщательно перемешивают в биореакторе объемом 300 литров с регулировкой температуры, рН, оборотов мешалки и аэрации. Для выращивания пастерелл используют питательные среды на основе перевара Хоттингера с рН 7,9-8,01 и содержанием амминного азота не менее 178-180 мг%. Культивирование проводят при температуре 37°С ± 1°С в течение 14 часов. Каждый штамм выращивают отдельно. Оптическую концентрацию бактериальных клеток определяют фотометрическим методом КФК-2 по калибровочной кривой. На всех этапах технологического производства вакцины через каждые 1,5-2 часа определяют концентрацию микробных клеток. Культивирование проводят до максимального накопления микробных клеток в среде роста, в частности данный показатель был равен 23,2; 27,5; 25,4 млрд м. к/см³ через 14 часов культивирования для Р. multocida серовариантов A, B, D соответственно.

Полученную суспензию инактивируют формалином до конечной 0,3%-ной концентрации к общему объему в течение 24 часов при температуре 37°С ± 1°С, периодически перемешивая каждые 4 часа.

По окончании инактивации берут по 3 литра бактериальной суспензии каждого штамма, центрифугируют при 15 тыс. об/мин.

Полученную культуральную жидкость концентрируют на ультрафильтрационной установке в 5 раз, после чего концентраты исследуют в РПГА и определяют активность поверхностных растворимых антигенов всех трех серовариантов Р. multocida A, B, D в диапазоне 1:128; 1:256 и 1:128 соответственно и готовят вакцину согласно известному способу.

Как показали результаты экспериментальных исследований, предлагаемый способ позволяет повысить качество целевого продукта путем повышения его активности в 2-4 раза, а также ускорить в 1,2-1,4 раза процесс получения вакцин против пастереллеза животных.

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ включает культивирование пастерелл P. multocida серологических вариантов А, В, D в жидкой питательной среде и исследование физико-химических и биологических показателей в процессе роста бактериальной массы с последующим прекращением культивирования пастерелл, концентрированием их и инактивацией формалином. Дополнительно определяют в культуральной жидкости, освобожденной от клеточной бактериальной массы, активность растворимых поверхностных антигенов в реакции пассивной гемагглютинации. При этом прекращение культивирования пастерелл осуществляют при ее значении для P. multocida серологических вариантов А, В, D как 1:512-1024, 1:1024-2048, 1:1024-2048 соответственно. А целевой продукт получают концентрированием в 3-5 раз культуральной жидкости, освобожденной от клеточной бактериальной массы. Способ позволяет ускорить процесс получения вакцины и повысить ее активность.

Способ получения вакцины против пастереллеза животных путем культивирования P. multocida серологических вариантов А, В, D в жидкой питательной среде, исследования физико-химических и биологических показателей в процессе роста бактериальной массы с последующим прекращением культивирования пастерелл, концентрированием их и инактивацией формалином, отличающийся тем, что дополнительно определяют в культуральной жидкости, освобожденной от клеточной бактериальной массы, активность растворимых поверхностных антигенов в реакции пассивной гемагглютинации, а прекращение культивирования пастерелл осуществляют при ее значении для P. multocida серологических вариантов А, В, D как 1:512-1024, 1:1024-2048, 1:1024-2048 соответственно, при этом целевой продукт получают концентрированием в 3-5 раз культуральной жидкости, освобожденной от клеточной бактериальной массы.