СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ РЕТИНОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2010 года по МПК A61K31/05 A61P9/10 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и касается средств, обладающих ретинопротекторной активностью.

Известны средства, обладающие ретинопротекторной активностью: флавоноидные антиоксиданты диквертин и танакан [1-3], синтетические и природные антиоксиданты эмоксипин [4, 5], мексидол [6] и α-токоферол [7], антиагрегант тиклопидин [8], препарат низкомолекулярного гепарина фраксипарин [9], препарат ώ₃-полиненасыщенных жирных кислот эйконол [10], пептидные биорегуляторы ретилин и ретиноламин [II], антиагреганты аспирин и дипиридамол [12].

Однако клинические испытания отдельных препаратов, обладающих ретинопротекторными свойствами, оказались недостаточно успешными [13].

Задачей изобретения является расширение номенклатуры средств, обладающих ретинопротекторной активностью.

Поставленная задача достигается использованием 4-метил-2,6-диизоборнилфенола в качестве ретинопротекторного средства.

Известно, что 4-метил-2,6-диизоборнилфенол обладает гемореологическими, антитромбоцитарными и антитромбогенными свойствами [14-18].

Использование 4-метил-2,6-диизоборнилфенола в качестве ретинопротекторного средства в литературе не описано.

Принципиально новым в предлагаемом изобретении является то, что в качестве ретинопротекторного средства используется 4-метил-2,6-диизоборнилфенол. Данная активность явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники. 4-Метил-2,6-диизоборнилфенол можно использовать для лечения ретинопатий.

Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения: "новизна", "изобретательский уровень", "промышленно применимо".

Материал и методы

Эксперименты проведены на 40 беспородных крысах-самках массой 200-230 г.

Ретинопротекторные эффекты оценивали на модели диабетической ретинопатии. Модель диабетической ретинопатии у животных воспроизводили путем однократного внутрибрюшинного введения стрептозотоцина в дозе 45 мг/кг массы тела. Критерием тяжести служили уровень гипергликемии (свыше 15 ммоль/л), потеря массы тела, выраженность полиурии и полидипсии. Через 30 суток после введения стрептозотоцина крысы были разделены на две группы: крысы опытной группы (n=20) с концентрацией глюкозы 22,4±2,0 ммоль/л ежедневно в течение 30 сут получали внутрижелудочно 4-метил-2,6-диизоборнилфенол в дозе 100 мг/кг массы тела, в виде суспензии в 1 мл крахмальной слизи; крысы контрольной группы (n=20) с концентрацией глюкозы 23,4±2,0 ммоль/л получали эквиобъемное количество крахмальной слизи по той же схеме. Интактным контролем являлись животные (n=10), которых содержали в виварии в аналогичных условиях. Материалом исследования служили центральные отделы сетчаток крыс, изъятых через 60 суток от начала опыта (инъекции стрептозотоцина) сразу после эвтаназии животных. Эвтаназию вызывали передозировкой эфирного наркоза. Центральные участки задней стенки глаза фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида на 0,2 М какодилатном буфере (рН 7,4), постфиксировали в 2% растворе четырехокиси осмия и заливали в смесь смол эпон-аралдит. Полутонкие срезы окрашивали толуидиновым синим, ультратонкие контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали и фотографировали в электронном микроскопе JEM-7A. На полутонких срезах производили подсчет нейросенсорных клеток с пикнозом ядра на 1000 клеток с каждой сетчатки, гиперхромных и пикноморфных ассоциативных нейронов и радиальных глиоцитов, ганглионарных нейронов с тотальным, очаговым хроматолизом и пикноморфных на 200 клеток с каждой сетчатки. С помощью окулярной измерительной сетки Автандилова высчитывали численную плотность ядер в наружном ядерном слое на площади 900 мкм, удельную площадь сосудов со стазом, сладжем и тромбозом, глионейрональный индекс.

Для статистической обработки данных использовали пакет программного обеспечения «Statistica 6.0». Рассчитывали среднее значение, стандартную ошибку. Для оценки достоверности различий при сравнении средних величин использовали непараметрический критерий Манна-Уитни.

Результаты исследований ретинопротекторной активности 4-метил-2,6-диизоборнилфенола представлены в примерах 1 и 2.

Пример 1. Через 2 месяца после развития стрептозотоцинового диабета в сетчатках животных отмечаются морфологические признаки дегенерации всех структурных компонентов сетчатки.

Деструктивные изменения нейросенсорых клеток выражаются в появлении перикарионов различного размера, деформации ядер, между которыми разрастаются гипертрофированные склеральные отростки радиальной глии. Наблюдается смещение одиночных ядер нейросенсорных клеток в фотосенорный и наружный сетчатый слои. Количественный анализ показал трехкратное увеличение процента нейросенсорных клеток с пикнозом ядра, характеризующихся повышением осмиофилии ядра и цитоплазмы, и снижение в 1,49 раз плотности распределения ядер нейросенсорных клеток в наружный ядерный слой по отношению к интактному контролю (табл.1).

Изменения ассоциативных нейронов носят реактивный характер. На светооптическом уровне наблюдается отек перикарионов ассоциативных нейронов, что на ультрамикроскопическом уровне выражается в уменьшении числа полисом, фрагментации и набухании цистерн гранулярной эндоплазматической сети, деструкции митохондрий. Редко встречаются нейроны с гиперхромией и пикнозом ядер. Количественный анализ показал, что при стрептозотоциновом диабете длительностью 2 месяца в контрольной группе животных наблюдается увеличение процента гиперхромных нейронов по сравнению с интактным контролем в 1,5 раза (табл.2).

Изменения мультиполярных нейронов при длительной гипергликемии на фоне стрептозотоцинового диабета характеризуются в основном различной степени выраженности хроматолизом. Ультрамикроскопически наблюдаются изменения со стороны гранулярной и агранулярной эндоплазматической сети, цистерны которой утрачивают правильную параллельную организацию, изогнуты и фрагментированы, некоторые резко расширены и служат местом образования вакуолей. Отмечается снижение содержания в цитоплазме рибосом и полисом, деструкция митохондрий с исчезновением крист. Также наблюдаются изменения ганглионарных нейронов по "темному типу" с деформацией, повышением осмиофилии ядра и редукцией органелл в цитоплазме.

По результатам количественного анализа в контрольной группе на первый план выступают хроматолитические изменения ганглионарных нейронов (табл.3): увеличение числа нейронов с очаговым и тотальным хроматолизом в 10 раз по отношению к интактному контролю. Количество пикноморфных нейронов возрастает в 3,8 раза.

Под влиянием длительной гипергликемии у контрольных животных отмечаются деструктивные процессы в радиальных глиоцитах в виде повышения электронной плотности цитоплазмы и ядра. Склеральные отростки радиальных глиоцитов гипертрофированы и отечны, в их цитоплазме содержатся лизосомы, фагосомы с частицами фоторецепторных элементов, вакуоли. Число пикноморфных радиальных глиоцитов относительно значений интактного контроля увеличивается в 2 раза, что сопровождается снижением глионейронального индекса на 43% (табл.4).

У животных контрольной группы наблюдаются выраженные расстройства микроваскуляризации, характеризующиеся достоверным увеличением по сравнению с контролем удельной площади хориоидальных сосудов со сладжем и стазом форменных элементов, а также тромбированных до 7,81±0,03% (интактный контроль 1,52±0,09%; р<0,05) (табл.5). Просвет одних сосудов резко сужен, других - аневризматически расширен, что связано с деструкцией перицитов. В просвете хориоидальных и интраретинальных сосудов встречаются моноциты, которые мигрируют в интерстициальную ткань сетчатки, где могут превращаться в макрофаги.

Пример 2. Курсовое введение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола предотвращает деструкцию нейросенсорных клеток, что выражается в снижении процента пикнотичных ядер нейронов до значений интактного контроля и повышении количества рядов ядер относительно контрольной группы в 1,35 раза (табл.1). Вместе с тем плотность распределения ядер нейросенсорных клеток в наружном ядерном слое остается сниженным в 1,5 раза, что связано, вероятно, пролиферативно-прогрессивной реакцией радиальной глии в виде пролиферации и гипертрофии склеральных отростков.

4-Метил-2,6-диизоборнилфенол способствует полной сохранности нейронов внутреннего ядерного слоя от повреждающего действия стойкой длительной гипергликемии, что выражается в отсутствии достоверных различий по всем показателям деструкции ассоциативных нейронов крыс опытной и интактной групп (табл.2).

Внутрижелудочное введение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола оказывает положительное влияние на состояние ганглионарных нейронов сетчатки, причем процент нейронов с тотальным хроматолизом снижается в 4,7 раза относительно значений контрольной группы и достоверно не отличается от аналогичного показателя у интактных животных (табл.3). Процент нейронов с очаговым и тотальным хроматолизом уменьшается на 34% и 30% соответственно, оставаясь при этом все же достоверно выше значений интактного контроля.

В опытной группе отмечается полное восстановление всех показателей деструкции радиальных глиоцитов (табл.4). Так, процент пикноморфных радиальных глиоцитов снижается по отношению к контрольным значениям в 1,5 раза, глионейрональный индекс возрастает в 1,4 раза.

В группах с введением 4-метил-2,6-диизоборнилфенола наблюдается существенное улучшение гемодинамики, что выражается в достоверном снижении удельной площади сосудов со стазом, сладжем и тромбозом в 3 раза по сравнению с аналогичным показателем крыс контрольной группы (табл.5).

Таким образом, внутрижелудочное введение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола в дозе 100 мг/кг в течение 7 суток крысам с диабетической ретинопатией, развившейся на фоне стрептозотоцинового диабета длительностью 2 месяца, оказывает выраженный ретинопротекторный эффект, приводя к снижению выраженности деструкции всех структурных компонентов сетчатки.

Таблица 1 Влияние курсового (30 суток) внутрижелудочного введения 4-метил-2,6-диизоборнилфенола (100 мг/кг) на показатели деструкции наружного ядерного слоя сетчаток крыс со стрептозотоциновым диабетом     Численная плотность Количество рядов ядер нейросенсорных клеток Серии опытов Пикноз ядер нейросенсорных клеток (%) ядер нейросенсорных клеток на 900 мкм² среза в наружном ядерном слое Интактный контроль       0,2±0,02 35989,72±454,52 13,1±0,35       Контроль 0,63±0,06* 24209,96±2478,5* 6,72±0,29* Опыт 0,24±0,03⁺ 24528,48±1982,15* 9,09±0,67*⁺ Примечание. В этой и последующих таблицах: * - р<0,05 по сравнению с интактными животными; ⁺ - р<0,05 по сравнению с группой контроля.

Таблица 2 Влияние курсового (30 суток) внутрижелудочного введения 4-метил-2,6-диизоборнилфенола (100 мг/кг) на показатели деструкции ассоциативных нейронов внутреннего ядерного слоя сетчаток крыс со стрептозотоциновым диабетом Серии опытов Ассоциативные нейроны (%) Гиперхромные Пикноморфные Интактный контроль 6,40±0,94 0,85±0,27 Контроль 9,45±0,99* 0,96±0,56 Опыт 7,33±0,87⁺ 0,80±0,33

Таблица 3 Влияние курсового (30 суток) внутрижелудочного введения 4-метил-2,6-диизоборнилфенола (100 мг/кг) на показатели деструкции ганглионарного слоя сетчаток крыс со стрептозотоциновым диабетом   Ганглионарные Ганглионарные Ганглионарные Серии нейроны нейроны с очаговым нейроны с тотальным опытов с пикнозом ядра (%) хроматолизом (%) хроматолизом(%) Интактный
контроль       1,53±0,34 3,55±0,23 0,8±0,18       Контроль 5,87±0,47* 37,02±5,79* 8,5±1,22* Опыт 1,24±0,69⁺ 24,34±2,58* 5,88±1,24*⁺

Таблица 4 Влияние курсового (30 суток) внутрижелудочного введения 4-метил-2,6-диизоборнилфенола (100 мг/кг) на показатели деструкции радиальной глии в сетчатках животных со стрептозотоциновым диабетом Серии опытов Радиальная глия (%) Глионейрональный индекс Гиперхромные глиоциты Пикноморфные глиоциты Интактный контроль 15,11±1,0 2,10±0,33 0,37±0,01 Контроль 16,99±0,67 4,22±0,42* 0,21±0,02* Опыт 15,34±1,17 2,9±0,21⁺ 0,3±0,02*⁺

Таблица 5 Влияние курсового (30 суток) внутрижелудочного введения 4-метил-2,6-диизоборнилфенола (100 мг/кг) на показатель удельной площади (%) сосудов хориоидеи со стазом, сладжем и тромбозом сетчаток у крыс со стрептозотоциновым диабетом Серии опытов Показатель удельной площади Интактный контроль 1,52±0,09 Контроль 7,81±0,03* Опыт 2,6±0,10*⁺

Источники литературы, принятые во внимание

1. Балаболкин М.И., Недосугова Л.В., Рудько И.А. Применение антиоксидантов из группы флавоноидов в лечении диабетической ретинопатии при сахарном диабете типа 2 // Проблемы эндокринологии. - 2003. - Т.49, № 3. - С.3-6.

2. Каражаева М.И., Саксонова Е.О., Клебанов Г.И. и др. Флавоноидные антиоксиданты в комплексном лечении больных с дистрофической отслойкой сетчатки // Клиническая офтальмология. - 2004. - Т.5, № 1. - С.41-44.

3. Бородай А.В., Сабурова Г.Ш., Ишунина A.M. Танакан в лечении диабетических микроангиопатий // VII съезд офтальмологов России: Тез. докл. - М., 2000. - Ч.1. - С.304.

4. Смирнова Н.Б. Прогноз и лечебная тактика на ранних стадиях диабетической ретинопатии // Автореф. дисс.... канд. мед. наук. - М., 1998. - 29 с.

5. Крутенков О.А., Евграфов В.Ю. Влияние локального введения тромболитиков и эмоксипина на остроту зрения и показатели периметрии у больных диабетической ретинопатией // Материалы II Евро-Азиатской конференции по офтальмохирургии. - Екатеринбург, 2001. - Ч.2, разд. 6-12. - С.326-327.

6. Галилеева В.В., Киселева О.М. Применение антиоксиданта мексидола у больных с диабетической ретинопатией // VII съезд офтальмологов России: Тез. докл. - М., 2000. - Ч.2. - С.425-426.

7. Евграфов В.Ю. Диабетическая ретинопатия: патогенез, диагностика, лечение // Автореф. дис...докт. мед. наук. - М., 1996. - 47 с.

8. The TIMAD Study Group. Ticlopidine treatment reduces the progression of nonproliferative diabetic retinopathy // Arch. Ophthalmol. - 1990. - Vol.108. - P.1577-1583.

9. Ильенков С.С., Вайник Д.Е. Изменения гемореологических показателей у больных диабетической ретинопатией и медикаментозные способы их коррекции // VII съезд офтальмологов России: Тез. докл. - М., 2000. - Ч.1. - С.313-314.

10. Сорокин Е.Л. Применение эйконола для профилактики диабетической ретинопатии // III национальный конгресс «Человек и Лекарство»: Тез. докл. - М., 1996. - С.211.

11. Хавинсон В.Х., Хокканен В.М., Трофимова С.В. Пептидные биорегуляторы в лечении диабетической ретинопатии. - СПб: «Фолиант». - 1999 - 117 с.

12. The DAMAD Study Group. Effect of aspirin alone and aspirin plus dipyridamole in early diabetic retinopathy. A multicentre randomized controlled clinical trial // Diabetes. - 1989. - Vol.38. - P.491-498.

13. Mayer-Davis E.J., Bell R.A., Reboussin B.A., Rushing J., Marshall J.A., Hamman R.F. Antioxydant nutritient intake and diabetic retinopathy. The San Luis Valley Diabetes Study // Ophthalmology. - 1998. - Vol.105. - P.2264-2270.

14. Плотников М.Б., Краснов Е.А., Смольякова В.И., Иванов И.С., Кучин А.В., Чукичева И.Ю. Средство, обладающее гемореологической, антитромбоцитарной и антитромбогенной активностью / Патент № 2347561, зарегистр. В ГР 27 февраля 2009 г.

15. Плотников М.Б., Смольякова В.И., Иванов И.С., Кучин А.В., Чукичева И.Ю., Краснов Е.А. Антитромбогенная и антитромбоцитарная активность производного o-изоборнилфенола // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2008. - Т.145, № 3 - С.296-298.

16. Плотников М.Б., Иванов И.С., Смольякова В.И., Кучин А.В., Чукичева И.Ю. Новые производные изоборнилфенола - основа для разработки средств профилактики и лечения тромбофилических состояний // Химия и медицина: Тез докл. VI Всерос. научного семинара с Молодежной научной школой. - Уфа, 2007. - С.80-81.

17. Плотников М.Б., Смольякова В.И., Иванов И.С., Краснов Е.А., Кучин А.В., Чукичева И.Ю. Гемореологическая активность производных о-изобарнилфенола // Микроциркуляция и гемореология: Тез. VI междунар. конф. - Ярославль, 2007. - С.160.

18. Плотников М.Б., Смольякова В.И., Иванов И.С., Краснов Е.А., Кучин А.В., Чукичева И.Ю. Влияние 4-метил-2,6-диизоборнилфенола на реологию крови при стрептозотоциновом диабете у крыс // Химия и технология растительных веществ: Тез. докл. V Всероссийского научной конференции. - Уфа, 2008 - С.235.

Предложено средство, обладающее ретинопротекторной активностью. Средство представляет собой 4-метил-2,6-диизоборнилфенол и предотвращает деструкцию нейросенсорных клеток, способствует полной сохранности нейронов внутреннего ядерного слоя сетчатки от повреждающего воздействия стойкой длительной гипергликемии. 5 табл.

Применение 4-метил-2,6-диизоборнилфенола в качестве средства, обладающего ретинопротекторной активностью.