Штамм бактерий ВоRDетеLLа реRтUSSIS - продуцент коклюшного токсина Советский патент 1992 года по МПК C12N1/20 A61K39/10 

Изобретение относится к медицине, а именно к разделу получения медицинских и биологических препаратов для иммунологических целей, в том числе для иммуннофер- ментного анализа и иммуннохимических исследований.

Известные лабораторные и свежевыделенные штаммы В.pertussis характеризуются слабойтоксинообразующей активностью. Более выраженной токсинообразующей активностью (в 1,5-2 раза) при культивировании в жидких средах обладает штамм № 475. Однако, выход концентрированных и очищенных токсинов при использовании этого штамма недостаточно высок.

Цель данного изобретения - получение высокопродуктивного токсиногенного серо- варианта штамма Bordetella pertussis.

Штамм 475а получен селекционным путем из штамма N; 475.

Штамм Ms 475a хранится в коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича МЗ СССР под номером 203

Штамм имеет следующие характеристики.

Морфологические и культуральные свойства: неподвижные, овоидной формы мелкие палочки (коккобактерии), располагающиеся отдельно или парами, без признаков полиморфизма. Грамотрицательные.

На среде Борде-Жангу колонии мелкие, диаметром 0,5-1 мм. Выпуклые, круглые, окруженные нередко ограниченной зоной гемолиза только в тонком слое среды (1,5-2

а XI

О

3

мм), содержащей 25% крови. Культуры не должны расти на мясо-пептонном агаре.

Оптимальная температура выращивания 35 ± 1,0° С.

Пример. Для культивирования Bordetella pertussis используют жидкую полусинтетическую среду (модификация среды Коэн-Виллера), включающую казеиновый гидролизат, дрожжевой диализат, крахмал, соли (K2HP04,KH2P04,KCI,MgS04, CaCl2, NaCI) и аминокислоты (цистеин, глу- таминовая кислота).

Лиофилизированный штамм №475а высевают на чашки Петри со средой Борде- Жангу. Период выращивания 2-3 сут. Затем с чашки делают пересев 10-15 типичных колоний на пробирки со средой Борде-Жан- гу. Смыв с пробирок 2го-3го пассажей используют для посева в пробирки с жидкой полусинтетической средой, либо в пробирки с жидкой полусинтетической средой переносят из ампул сухую посевную культуру, разведенную жидкой полусинтетической средой. Пробирки помещают в аппарат для вращающихся пробирок и инкубируют 24 ч при 35 ± 1 ° С. Чистую культуру из пробирок переносят в колбы Эрленмейера (200 мл среды). Колбы помещают в шуттель-аппарат и культивируют при 35 ± 1° С до конца экспоненциальной фазы роста. После морфологического контроля культуру пересевают в колбы Эрленмейера и выращивают до конца экспоненциальной фазы роста.

Полученную маточную культуру используют для засева матрацев с жидкой полусинтетической средой. В среду культивирования добавляют анионообмен- ную смолу. Выращивание ведут в статических условиях в течение 72-120 часов при температуре 36 ± 1°С.

В конце культивирования концентрация бактерий составляет 56 ± 3,6 МОЕ/мл, лей- коцитозстимулирующая активность суперна- тантов - 8-9 ЛС-единиц/0,1 мл. Выход высокоочищенного белка токсина, в среднем, 2,1 ± 0,26 мг с 1 литра супернатанта.

Определение лейкоцитозстимулируга- щей активности штамма.

Определение лейкоцитозстимулируга- щей активности штамма проводится на мышах массой 14-16 г (6-10 мышей в каждой группе). Внутрибрюшинно вводят 0,5 мл испытуемого материала (суспензии культуры или супернатанта). Контрольным животным вводят 0,5 мл физиологического раствора.

Через 72 ч из хвостовой вены берут кровь. Количество лейкоцитов подсчитывают в камере Горяева. Одна единица лейко- цитозстимулирующей активности

соответствует повышению уровня лейкоцитов в 1 мм крови на 10 тысяч, по сравнению с контролем.

Сравнительные данные продуктивности исходного и селекционированного

штаммов Bordetella pertussis.

В табл. 1 приведены данные опытов выращивания исходного и селекционированного штаммов В.pertussis в стационарных условиях в жидкой полусинтетической среде в присутствии анионообменной смолы. Культивирование ведут в течение 72 ч.

Сравнительные результаты культивирования исходного и селекционированного штаммов Bordetella pertussis (табл. 1V

Результаты экспериментов показывают, что при использовании селекционированного штамма увеличивается концентрация бактерий и повышается лейкоцитозстимулирую- щая активность супернатантов (0,,02).

Полученные данные нашли подтверждение при многократных опытах изучения этих параметров для исходного и селекционированного штаммов.

Из супернатантов выделяют методов кислотного осаждения с последующим растворением осадка в буфере частично очищенные антигенные комплексы, содержащие коклюшный токсин, либо получают высокоочищенные гомогенные препараты коклюшного

токсина, используя с незначительными модификациями методику Sekura R. D et ai. Результаты приведены в табл. 2. Бактериальный рост, лейкоцитозстиму- лирующая активность супернатантов и выход целевого продукта при использовании исходного и селекционированного штаммов Bordetella pertussis.

Приведенные в табл. 2 данные показывают, что при использовании селекционированного штамма достоверно повышается концентрация бактерий (0,,002), накопление токсина в среде культивирования (,001), выход активного белка при получении очищенных антигенных комплексов

(0,,002) и выход высокоочищеннОТо гомогенного препарата коклюшного токсина (,001),

Формула изобретения Штамм бактерий Bordetella pertussis

ГИСК Ns 203 - продуцент коклюшного токсина.

Т а б л и ц а 1

Использование: медицинская микробиология, диагностика коклюша, получение коклюшного токсина. Сущность изобретения: для получения коклюшного токсина используют новый штамм Bordetella pertussis ГИСК № 203. Штамм культивируют на жидкой полусинтетической среде с добавлением анионообменной смолы. Выращивание ведут в статических условиях в течение 72- 120 ч при 35-37°С. В конце культивирования концентрация бактерий составляет 56 ±2.6 МОЕ/мл, лейкоцитозстимулирующая активность супернатантов - 8-9 ЛС -единиц/0,1 мл, Выход высокоочищенного белка токсина 2,1 ± 0,26 мг с 1 л супернатанта. 2 табл. |СЛ с

++ штамм после восстановления из высушенного состояния.

Таблица2