ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS PUMILUS "ПАШКОВ" - ПРОДУЦЕНТ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ, ОБЛАДАЮЩИХ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ, ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ, ДРОЖЖЕВЫХ ГРИБОВ И ВИРУСОВ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 C12R1/70 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности для получения пробиотического препарата, оказывающего антагонистическое влияние на условно-патогенные и патогенные бактерии и дрожжевые грибы, а также выраженную противовирусную активность в отношении энтеровирусов.

Широко известны штаммы, проявляющие высокие антагонистические свойства в отношении ряда бактерий и грибов.

Известен штамм Bacillus subtilis 534 - продуцент пробиотика «Споро-бактерин», который предназначен для профилактики и лечения желудочно-кишечного тракта, дисбактериозов (SU 1708350, кл. A61K 35/66).

Недостатками этого штамма являются небольшие сроки хранения, т.к. он содержит живые бактерии, которые не могут длительное время сохранять свои свойства. Из-за низкой чистоты препарат имеет узкую область применения в качестве кормовой добавки для животных. Штамм также чувствителен к антибиотикам, что ограничивает сферу применения препарата.

Известен штамм Bacillus subtilis 3H (ГИСК 248), несущий свойство антибиотикорезистентности, используемый для получения пробиотического препарата «Бактиспорин», который применяют совместно с антибиотиками для лечения и профилактики дисбактериоза, ферментной недостаточности органов пищеварения, гнойных инфекций, пищевой аллергии (RU 2067616 С1, кл. A61K 35/74, 1996).

Известен штамм бактерий Bacillus subtilis 1719 - продуцент антагонистически активной биомассы в отношении болезнетворных микроорганизмов, а также протеолитических, амилолитических и липолитических ферментов (RU 2298032 С2, кл. C12N 1/20, C12N 9/14, A61K 35/74, 2007).

Недостатком указанных штаммов является отсутствие их противовирусной активности.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является получение нового штамма - продуцента антагонистически активной биомассы в отношении патогенных микробов, в том числе вирусов.

Для решения указанной задачи предлагается штамм бактерий Bacillus pumilus «Пашков», депонированный Коллекцией Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасовича под номером 286.

Штамм бактерий Bacillus pumilus «Пашков» выделен из окружающей среды на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ММА им. И.М.Сеченова. Штамм проявляет широкий спектр антагонистической активности, низкую адгезивную активность.

Характеристики штамма.

Культурально-морфологические и другие свойства штамма. Клетки штамма - крупные грамположительные аэробные палочки с центрально или парацентрально расположенными спорами эллипсовидной или цилиндрической формы, могут возникать скопления клеток в виде цепочек. При изучении колоний штамма в косопроходящем свете обнаружено, что колонии зернистые с выступающим плотным центром, края неровные. При микроскопии обнаружено, что клетки представляют собой крупные, бочкообразные палочки, местами соединенные в цепочки. В зависимости от условий культивирования и питательной среды колонии могут образовывать пигмент от бежевого до розового. Штамм обладает низкой адгезивностью. Штамм безвреден, не токсичен, авирулентен.

Рост на твердых питательных средах. Штамм бактерий Bacillus pumilus «Пашков» растет на простых питательных средах. Наблюдается пленочный рост на поверхности агара.

Рост на жидких питательных средах. Штамм бактерий Bacillus pumilus «Пашков» растет на поверхности жидких питательных сред.

Биохимическая активность штамма. Штамм бактерий Bacillus pumilus «Пашков» способен утилизировать глюкозу, ксилозу, манит, сахарозу и мальтозу. Не утилизирует лактозу и салицин. Не образует газа при расщеплении глюкозы. Гидролизирует казеин и не гидролизирует крахмал. Не образует газа при расщеплении глюкозы. Не восстанавливает нитраты до нитритов, не продуцирует индол, сероводород. Выделяет уреазу. Вызывает разжижение 10% желатина. Не обладает гемолитическими свойствами и лецитиназной активностью.

Гомологичные фаги к штамму не выявлены.

Отношение штамма к видовым диагностическим сывороткам. Диагностических сывороток не имеется.

Генетические особенности штамма (ауксотрофность, устойчивость к антибиотикам и т.п.). Штамм бактерий Bacillus pumilus «Пашков» не имеет плазмид, устойчив к оксациллину, ампициллину, цефуроксиму, цефотаксиму, цефтриаксону, эритромицину, тетрациклину, клиндамицину, левомицитину, рифампицину, бацитрацину, фузидину, новобиоцину.

Активность (продуктивность) штамма, а также другие производственные показатели штамма. Продукт, синтезируемый штаммом, - биологически активные вещества, оказывающие антагонистическое влияние на условно-патогенные и патогенные бактерии и дрожжевые грибы, а также обладающие противовирусной активностью.

Активность штамма оценивается путем определения отсроченного антагонизма или при совместном культивировании с тест-штаммами. Ингибирующие свойства культуральной жидкости штамма бактерий Bacillus pumilus «Пашков» оценивается по влиянию на кинетику роста тест-культур в исходной концентрации 10⁶ КОЕ/мл с помощью микробиологического анализатора с планшетным фотометром "BIOSCREEN/iEMS - reader MF", фирмы "LabMetod, Финляндия. Штамм бактерий Bacillus pumilus «Пашков» - продуцент биологически активных веществ, обладающих антагонистическими свойствами в отношении патогенных микробов. Перспективен для создания пробиотических препаратов и лекарственного средства против энтеровирусных инфекций.

Условия и состав сред для хранения. Штамм бактерий Bacillus pumilus «Пашков» хранят на полужидком агаре замороженным при Т=-70°С в течение 1 года.

Условия и состав сред для размножения штамма. Штамм бактерий Bacillus pumilus «Пашков» размножают путем посева на жидкие и агаризованные питательные среды (мясопептонный бульон, мясопептонный агар).

Условия и состав сред для продукции токсина, антигенных фракций, пигмента и других продуктов жизнедеятельности клеток. Штамм бактерий Bacillus pumilus «Пашков» токсинов не продуцирует. На агаризованных средах колонии штамма образуют пигмент от бежевого до розового.

Пример. Штамм бактерий Bacillus pumilus «Пашков» выделен из окружающей среды на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ММА им. И.М.Сеченова. Штамм антагонистически активен в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий: Staphylococcus, Proteus, Shigella, Escherichia, Pseudomonas и грибов рода Candida, Rhodotorula, Debaryomyces. Изучение адгезивных свойств на эритроцитах человека (0 группы Rh+) показало низкую адгезивную активность представляемого на депонирование штамма (индекс адгезии 1,76±2,5). В экспериментах на животных штамм оказался безвреден, не токсичен, авирулентен. Плазмиды в изученном штамме не обнаружены.

Широкий спектр антагонистической активности, низкий уровень адгезивной активности, продукция высокоактивных биологических веществ характеризуют штамм бактерий Bacillus pumilus «Пашков» как перспективный для создания на его основе препаратов-пробиотиков и использование его в качестве продуцента биологически активных веществ, обладающих антибактериальной, противогрибковой и антивирусной активностью.

Определение антибиотикоустойчивости и плазмидного профиля штаммов В. pumilus «Пашков», является одним из важных свойств, определяющих возможность его применения совместно с антибактериальными препаратами. В связи с этим проведено изучение антибиотикорезистентности штаммов В. pumilus «Пашков» по отношению к 23 антибиотикам. Штамм В. pumilus «Пашков» оказался устойчив к оксациллину, ампициллину, цефуроксиму. цефотаксиму, цефтриаксону, эритромицину, тетрациклину, клиндамицину, левомицитину, рифампицину, бацитрацину, фузидину, новобиоцину. Чувствителен к цефалексину, триметоприму с сульфаметоксазолом, амикацину. Полученные данные представлены в табл.1.

При изучении плазмидного профиля бактерий В. pumilus «Пашков» плазмид не выявлено.

Влияние штамма В. pumilus «Пашков» на макроорганизм оценивалось по наличию токсичности, токсигенности, вирулентности и безопасности штамма В. pumilus «Пашков» в опытах in vivo. Из табл.2. видно, что штамм В. pumilus «Пашков» не обладал вирулентностью в испытанных концентрациях. Все животные оставались живыми в течение периода наблюдения (5 суток), ни у одного из них не выявлены признаки заболевания.

В табл.3 представлены результаты по изучению токсичности В. pumilus «Пашков». Полученные результаты свидетельствовали об отсутствии токсичности у изучаемого штамма.

В табл.4 представлены результаты по определению токсигенности штамма В. pumilus «Пашков». Результаты опыта свидетельствуют об отсутствии токсигенности у изучаемого штамма.

С целью более полного изучения безопасности штамма испытаны возрастающие дозы штамма при пероральном введении мышам (табл.5). Установлено, что однократное введение per os больших доз (20×10⁹ м.к./мл) В. pumilus «Пашков» приводило к несущественному снижению веса (или вес не изменялся) животных на первые сутки после введения, в последующие дни вес животных нарастал. В группах, получавших 0,9% NaCl, при всех способах введения гибели животных не отмечено.

Таким образом, проведенные исследования показали, что штамм B. pumilus «Пашков» является нетоксичным, нетоксигенным и авирулентным, т.е. безопасным.

Основные положения руководства по безопасности для компаний, занимающихся производством спорообразующих бактерий в качестве пробиотиков, включают в себя требование идентификации до вида с применением современной и валидированной методологии, в частности изучение последовательности генов 16 рРНК. Данные риботипирования 16S субъединицы штамма B. pumilus «Пашков» представлены:

TGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTC

GAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTG

AGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAA

CCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGA

AAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCT

AGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTG

AGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTAC

GGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGA

GCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGT

TAGGGAAGAACAAGTGCGAGAGTAACTGCTCGCACCTTGACGGTACCT

AACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGT

AGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGC

GGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTC

ATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCAC

GTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAA

GGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGA

GCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTG

CTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAA

GCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATT

GACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAA

CGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGAT

AGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTC

AGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCC

TTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGG

TGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTT

ATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCG

AGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCATAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCG

CAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGA

TCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGT

CACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTAT

GGAGCCAG

С целью изучения антагонистических свойств биологически активных веществ, вырабатываемых штаммом, проведено периодическое культивирование на жидкой питательной среде, разработанной в лаборатории. Установлено что бактерии синтезируют антимикробные вещества широкого спектра действия в отношении бактерий, грибов и вирусов (табл.6, 7, 8).

Из данных таблицы видно, что культуральная жидкость, полученная при культивировании штамма B. pumilus «Пашков» в оптимально подобранных условиях содержит биологически активные вещества, обладающие высоким бактериостатическим эффектом.

Анализ полученных данных свидетельствует о высоком фунгистатическом эффекте культуральной жидкости штамма бактерий B. pumilus «Пашков».

При исследовании противовирусного действия культуральной жидкости штамма B. pumilus «Пашков» установлена высокая активность продуктов секреции штамма в отношении изучаемых энтеровирусов (табл.8).

Таблица 1 Показатели чувствительности штамма B. pumilus «Пашков» к антибиотикам Группа АБ Представитель группы Нагрузочная доза на диск (мкг) Диаметр зоны задержки роста (мм) (X±m) Результат Пенициллины 1 поколения Бензилпенициллин 10 ЕД 12±3,3 Умеренно-чувствителен Пенициллины 2 поколения Оксациллин 10 8±3,7 Устойчив Пенициллины 3 поколения Ампициллин 10 12±1,6 Устойчив Пенициллины 4 поколения Карбенициллин 25 15±0,8 Умеренно-чувствителен   Цефалексин 30 18±3,4 Чувствителен Цефалоспорины 1 поколение Цефазолин 30 15±0,5 Умеренно-чувствителен Цефалоспорины 2 поколение Цефуроксим 30 9±0,8 Устойчив Цефалоспорины 3 Цефотаксим 30 8±2,2 Устойчив поколение Цефтриаксон 30 11±2,6 Устойчив Макролиды Эритромицин 15 14+2,2 Устойчив   Кларитромицин 15 15±1,4 Умеренно-чувствителен Триметоприм + Сульфаметокса-зол   1,25/23,75 13±1,4 Чувствителен Хинолоны Офлоксацин 5 15+0,9 Умеренно-чувствителен   Ципрофлоксацин 5 16±0,8 Умеренно-чувствителен Аминогликозиды
1 поколения Канамицин 30 15+1,7 Умеренно-чувствителен Аминогликозиды 3 поколения Амикацин 30 16±1,7 Чувствителен Тетрациклины Тетрациклин 30 14±1,9 Устойчив Линкозамиды Клиндамицин 2 9±0 Устойчив Левомицетины Левомицетин 30 8±0,5 Устойчив Рифампицин Рифампицин 5 10±2,4 Устойчив Другие Бацитрацин 10 ЕД 3,7±0,9 Устойчив   Фузидин 10 10±2,9 Устойчив   Новобиоцин 5 9±2,4 Устойчив

Таблица 2 Изучение вирулентности штамма B. pumilus «Пашков» Количество животных Вводимая доза, (м.к./мл) Кратность введения Количество животных заболевших павших выживших Опыт Внутрибрюшинно 10 0,5 млд. 1 0 0 10 10 1 млд. 1 0 0 10 10 2 млд. 1 0 0 10 Ко 10 0,9% NaCl 1 0 0 10

Таблица 3 Исследование токсичности штамма B. pumilus «Пашков» Количество животных Вводимая доза, (м.к./мл) Кратность введения Количество животных заболевших павших выживших О Внутрибрюшинно 10 1 млд. 1 0 0 10   10 2 млд. 1 0 0 10   10 3 млд. 1 0 0 10 Конт 10 0,9% NaCl 1 0 0 10

Таблица 4 Исследование токсигенности штамма B. pumilus «Пашков» Количество животных Вводимая доза, (мл) Кратность введения Количество животных заболевших павших выживших   Внутрибрюшинно О 10 0,5 1 0 0 10 10 1,0 1 0 0 10   10 0,5 среды Гаузе 1 0 0 10

Таблица 5 Изучение безопасности штамма B. pumilus «Пашков» Группы Вводимая доза Количество животных Средняя масса животных, (г) (X±m) выживших павших До введения Через 1 сутки Через 5   Перорально 1 5 млд. 10 0 15,4±0,3 15,6±0,2 16 2 10 млд. 10 0 15,6±0,3 15,3±0,3 16 3 20 млд. 10 0 14,8±0,3 14,1±0,3 15

Таблица 6 Бактериостатический эффект культуральной жидкости штамма B. pumilus «Пашков» в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий Исследуемый
материал Подавление
роста
микроорганизмов (%)   S.aureus S.aurerus S.xylosus 25 S.flexneri 337 S.sonnei 170 E.coli O 111:H P.aeruginosa P.mirabilis 24a P.vulgaris 177 Культуральная жидкость В. pumilus «Пашков» 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Таблица 7 Бактериостатический эффект культуральной жидкости штамма В. pumilus «Пашков» в отношении клинических штаммов дрожжевых грибов Исследуемый материал Подавление роста микроорганизмов (%) C.albicans №1 C.albicans №2 C.haemuloni C.tropicalis Rhodotor ula spp Debaryo myces hansenii Культуральная жидкость В.pumilus «Пашков» 94 92 91 89 88 92

Таблица 8 Эффективность лечебного и профилактического действия in vitro культуральной жидкости штамма В. pumilus «Пашков» в отношении 4-х энтеровирусов в зависимости от разведения препарата и дозы вирусов Вирусы Время наблюдения Разведение препарата, обеспечивающее 100% защитный эффект Разведение препарата, обеспечивающее 100% профилактический эффект     Доза вируса в lg ТЦД_{50/0,5 мл}   (ч) 100 50 25 12,5 100 50 25 12,5 Polio-1 48 1:80 1:160 1:640 1:640 1:40 1:160 1:160 1:640 72 1:80 1:80 1:640 1:640 1:40 1:160 1:160 1:640 Е СНО-3 48 1:40 1:40 1:640 1:640 0 1:160 1:640 1:640 72 1:40 1:40 1:160 1:320 0 1:160 1:640 1:640 Е СНО-6 48 1:40 1:640 1:640 1:640 0 1:20 1:640 1:640 72 1:40 1:160 1:160 1:640 0 1:20 1:640 1:640 Сох В (1-6) 48 1:80^* 1:80^* 1:40 1:40 0 1:20 1:640 1:640 72 1:80^* 1:80^* 1:40 1:40 0 1:20 1:320 1:640 Примечание: * - частичная защита клеток

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения пробиотического препарата, оказывающего антагонистическое влияние на условно-патогенные и патогенные бактерии и дрожжевые грибы, а также выраженную противовирусную активность в отношении энтеровирусов. Штамм бактерий Bacillus pumilus «Пашков» выделен из окружающей среды на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова, депонирован в ГИСК им. Л.А.Тарасовича под №286. Штамм проявляет широкий спектр антагонистической активности, низкую адгезивную активность, высокую активность продуктов секреции штамма в отношении ряда энтеровирусов. 8 табл.

Штамм бактерий Bacillus pumilus «Пашков» ГИСК им. Л.А.Тарасевича №286 - продуцент биологически активных веществ, обладающих антагонистической активностью в отношении условно-патогенных, патогенных бактерий, дрожжевых грибов и вирусов.