СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 14α-ГИДРОКСИПРОИЗВОДНЫХ Δ-3,17-ДИКЕТО-АНДРОСТЕНОВ Российский патент 2010 года по МПК C12P33/00 C12P33/06 C12N1/14 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к микробиологическим способам получения гидроксипроизводных стероидов, и может быть использовано в микробиологической и фармацевтической промышленности.

Практически все известные гидроксистероиды (моно-, ди-, тригидроксистероиды) обладают высокой физиологической активностью. Что касается некоторых 14α-гидроксилсодержащих Δ⁴-3-кетостероидов, то у них установлено наличие противовоспалительной, контрацептивной и канцеролитической активностей. 14α-Гидроксистероиды перспективны в качестве исходных структур в синтезе новых физиологически активных соединений [1-3]. Например, 14α-гидроксипроизводные андростендиона (АД) и кортексолона служат в качестве базовых соединений для двух альтернативных путей синтеза высокоактивного антигонадотропного препарата пролигестона, широко используемого в гинекологической и ветеринарной практике [1].

Несмотря на уникальную биологическую активность и огромный интерес исследователей к 14-гидроксилсодержащим стероидам, в мировой практике используется только несколько препаратов этого ряда, что объясняется сложностью введения гидроксильной группы в 14-положение.

Введение 14α-гидрокси-группы химическим путем нецелесообразно вследствие токсичности используемых реагентов, жестких условий реакции и соответственно низких выходов. Поэтому стереоселективный, экологически безопасный и не требующий предварительной защиты функциональных групп и двойных связей микробиологический способ является в данном случае единственно возможным.

Известны работы, в которых с целью применения в качестве биокатализатора для введения в стероидную молекулу 14α-гидроксигруппы изучены плесневые грибы Absidia coerulea [2], Acremonium strictum [3], Colletotrichum antirrhini [4], Cunninghamella blakesleeana [5], Curvularia clavata [6], C.lunata [7], Gongronella butleri [8], Mucor racemosus [9], M.piriformis [10], Neurospora crassa [11], Phycomyces blakesleeanus [12], Thamnostylum piriforme [13].

Однако с помощью указанных грибов получено ограниченное количество стероидов, содержащих 14α-гидроксигруппу. По-видимому, это связано с очень высокой специфичностью стероидных гидроксилаз по отношению к структуре стероидной молекулы. Сообщается о 14α-гидроксилировании стероидов ряда андростана и прегнана, причем в случае прегнанов, например кортексолона, 14α-гидроксипроизводные образуются, как правило, в качестве побочных продуктов. Нагрузка трансформируемых субстратов в цитируемых работах (за исключением одного примера с АД [7]) составляла не более 2 г/л, а продолжительность процесса гидроксилирования достигала 120 ч.

Недостатками рассматриваемых процессов являются неполная конверсия субстрата при сокращении времени трансформации, низкий выход целевых 14α-гидроксилированных производных, образование смеси побочных продуктов. Например, после гидроксилирования 1.0 г/л АД мицелием G. butleri из реакционной среды через 72 ч выделено 21.8% 14α-гидрокси-АД и четыре побочных продукта. При гидроксилировании андростадиендиона (АДД) через 96 ч реакционная смесь состояла из 39% АДД, 16.6% 14α-гидрокси-АДД и двух побочных стероидов в суммарном количестве 28%. Даже в лучшем примере - трансформации 1.0 г/л 9α-гидрокси-АД реакционная смесь после 96 ч инкубирования состояла из 8.1% исходного, 52% целевого 9α,14α-дигидрокси-АД и 29% побочного 6β,9α-дигидрокси-АД [8].

Известен способ гидроксилирования АД растущей культурой С.lunata NRRL 2380 [7], согласно которому трансформацию осуществляют в ферментере при нагрузке субстрата 5.0 г/л в среде, содержащей кукурузный экстракт и соевую муку. Стероиды экстрагируют из культуральной жидкости, не отделяя мицелий, метилизобутилкетоном, экстракт упаривают и выделяют 14α-гидрокси-АД с выходом 60% методом препаративной хроматографии на колонке.

Необходимость использования колоночной хроматографии, нежелательной при масштабировании процесса, вызвана, по-видимому, наличием в реакционной смеси побочных гидроксистероидов, а также содержанием в экстракте продуктов метаболизма гриба и липидных компонентов среды, что может быть следствием использования в этом способе культуры гриба, растущей в богатой органическими компонентами питательной среде.

Поскольку указанный способ иллюстрирован одним примером, не известно об эффективности 14α-гидроксилазной системы используемого штамма гриба в отношении других стероидов.

Сущность заявляемого способа заключается в использовании в качестве биокатализатора для введения 14α-гидроксигруппы в 3,17-дикетоандростаны отмытого от питательной среды мицелия нового штамма гриба С.lunata ВКПМ F-981, не образующего других гидроксистероидов, кроме как содержащих 14α-гидроксигруппу.

Трансформацию с помощью указанного штамма проводят в водной среде, в которой отсутствуют компоненты, необходимые для роста гриба. Стероиды для трансформации вносят в количестве не менее 2.0 г/л либо в виде водной суспензии микрокристаллов, либо в виде водорастворимого комплекса с химически модифицированным β-циклодекстрином (ЦД), например метил-ЦД, оксипропил-ЦД.

Максимальное время трансформации не превышает 45 ч. Конверсия стероидов в конце процесса 14α-гидроксилирования составляет 85-95%. В зависимости от структуры, количества и формы внесения субстратов (в виде микрокристаллов или в виде водорастворимого комплекса с ЦД) 14α-гидроксипродукты преимущественно находятся либо на мицелии, либо в водной фазе, что существенно облегчает их выделение.

При трансформации андростенов в виде комплекса с ЦД водную фазу после извлечения стероидных метаболитов используют повторно для трансформации без регенерации ЦД.

Выход 14α-гидроксипродуктов в зависимости от структуры исходного субстрата, количества и формы его внесения в реакционную среду составляет 40-70%.

Способ иллюстрируется следующими примерами, выход выделенного продукта в которых выражен в % от теоретически возможного.

Пример 1. Трансформация АД при нагрузке 2.0 г/л в виде микрокристаллов.

Споры гриба Curvularia lunata ВКПМ F-981 переносили со скошенного агара в жидкую среду, содержащую: (г/л) глюкозу - 20.0, пептон - 5.0, дрожжевой экстракт - 5.0, соевую муку - 10.0, КН₂РO₄ - 4.0, рН 6.2-6.5. Выращивали культуру в течение 3 сут. на качалке при 28°С, после чего полученный вегетативный посевной материал переносили в такую же среду и инкубировали в тех же условиях 30-35 ч. Мицелий отделяли от среды, промывали фосфатным буфером, полученную биомассу распределяли в качалочные колбы с фосфатным буфером, в которые добавляли водную суспензию АД с размером частиц до 20 мкм в присутствии твина-80. Трансформацию 2.4 г АД осуществляли в течение 26 ч. Анализировали содержание стероидных метаболитов на мицелии и в водной фазе. Продукт 14α-гидрокси-АД извлекали из мицелия экстракцией этилацетатом. Отдельно экстрагировали водную фазу. Определяли отсутствие в ней побочных продуктов, после чего экстракты объединяли, упаривали и получали 1.9 г технического продукта. Кристаллизацией из этилацетата получали 1.3 г 14α-гидрокси-АД, т.пл. 257-261°С. Лит. 259- 262°С [9], выход 54%.

Пример 2. Трансформация АД при нагрузке 6.0 г/л в виде комплекса с метил-β-ЦД.

Мицелий для трансформации 3.0 г АД получали аналогично примеру 1, но АД подвергали гидроксилированию в течение 42 ч в виде комплекса с метил-β-ЦД в фосфатном буфере, используя мольное отношение АД/ЦД 1:1.

Мицелий отделяли от водной фазы и экстрагировали этилацетатом. Отдельно экстрагировали водную фазу. Экстракты объединяли и упаривали. Получали 2.53 г технического продукта, перекристаллизацией которого в этилацетате получали 2.1 г 14α-гидрокси-АД, идентичного ранее выделенному, т.пл. 258-263°С, выход 62%.

Пример 3. Трансформация АД при нагрузке 4.0 г/л в виде комплекса с повторно используемым метил-β-ЦД.

Трансформацию АД и выделение 14α-гидрокси-АД проводили согласно примеру 2, но в качестве реакционной среды использовали водную фазу после выделения продуктов трансформации примера 2, в которую добавляли АД и свежую порцию мицелия, приготовленного для первого цикла трансформации по примеру 2 и хранившегося сутки при 4-5°С, либо выращенного повторно согласно примеру 1. Трансформацию проводили в течение 24 ч. Продукт, идентичный ранее выделенному, получали с выходом 52%.

Пример 4. Трансформация АД при нагрузке 6.0 г/л в виде комплекса с оксипропил-β-ЦД.

Трансформацию 1.6 г АД осуществляли согласно примеру 2, но в качестве солюбилизатора использовали оксипропил-β-ЦД в мольном отношении АД/ЦД 1:1. Через 45 ч инкубации, когда конверсия достигла 98%, мицелий отделяли от водной фазы. Экстракцией мицелия этилацетатом выделено 0.68 г 14α-гидрокси-АД, т.пл. 258-262°С, выход 40%. Из водной фазы выделено также 0.17 г 14α-гидрокси-АДД (выход 10%), т пл. 282-285°С. Лит. 284-287°С [14].

Пример 5. Трансформация АДД при нагрузке 3.0 г/л в виде комплекса с оксипропил-β-ЦД.

Трансформацию 2.1 г АДД и выделение продуктов гидроксилирования осуществляли согласно примеру 4. Полную конверсию АДД наблюдали через 24 ч. Из мицелия выделено 1.55 г 14α-гидрокси-АДД, из водной фазы - 0.85 г смеси 14α-гидрокси-АДД и дегидротестостерона в отношении 1:1. После кристаллизации 14α-гидрокси-АДД из экстрактов мицелия и водной фазы его выход составил 69.8%. Т.пл. 283-285°С.

Пример 6. Трансформация 9α-гидрокси-АД в виде микрокристаллов при нагрузке 2.0 г/л.

Трансформацию и выделение продукта гидроксилирования проводили согласно примеру 1. Через 40 ч трансформации конверсия составила 95%, выход кристаллического 9α,14α-дигидрокси-АД 52%, т.пл. 240-243°С. Лит. данные 241-244°С [15].

Пример 7. Трансформация 9α-гидрокси-АД при нагрузке 2 г/л в виде комплекса с оксипропил-β-ЦД.

Трансформацию 2.8 г 9α-гидрокси-АД и выделение продукта реакции осуществляли согласно примеру 4. Получено 55% кристаллического 9α,14α-дигидрокси-АД, т.пл. 241-244°С.

Литература

1. Smid P.M., van Zoest W.J., Weber P.O., Marx A.F. // 14α,17α-Dihydroxy-17β-substituted steroids. US Patent 5 093 502. 1992.

2. Brzezowska E., Dmochowska-Gladysz J., Kolek T. J.Steroid Biochem. Mol. Biol. V.57, no.5-6, pp.357-362. 1996.

3. Yoshihama M., Tamura К., Miyata N., Nakayama S., Nakakoshi M. Novel androst-4-ene-3,17-dione derivatives and process for their preparation. EP 0 300 062.1988.

4. Niar V.C., Shapiro S., Arunachalam Т., Caspi E. //Biotransformation of progesterone to 14α-hydroxypregna-l,4-diene-3,20-dione, a novel fungal metabolite, by Colletotrichum antirrihini. J.Steroid Biochem. V. 22, no.3, pp.399-400. 1985.

5. Chincholkar S.B., Laxman R.S., Wakharkar R.D. // Hydroxylation of progesterone by Cunninghamella blakesleeana NCIM 687. World J. Microbiol. Biotechnol. V.11, pp.357-358. 1995.

6. Vujic M., Jankov R.M. // Microbiologic transformation of progesterone by Curvularia clavata. Steroids, V.55, no. 1, pp.17-21. 1990.

7. Weber A., Kennecke M. //Verfahren zu herstellung von 14α-hydroxy-4-androsten-3,17-dion. WO 93/05170. 1993.

8. Kollerov V.V., Shutov A.A., Fokina V.V., Sukhodolskaya G.V., Donova M.V. // Biotransformation of 3-ketoandrostanes by Gongronella butleri VKMF-1033. J.Mol.CatalysisB: Enz. V.55, pp.61-68. 2008.

9. Faramazzi M.A., Badiee M., Yazdi M.T., Amini M., Torshabi M. // Formation of hydroxysteroid derivatives from androst-4-en-3,17-dione by filamentous fungus Mucor racemosus. J. Molec.Catalysis B: Enz. V.50, no.5. 2008.

10. Madyashta K.M., Joseph TV/Study on the 14a-hydroxylation of progesterone in Mucor piriformis. J. Steroid Biochem. Mol. Biol., V.45, no.6, pp.563-569. 1993.

11. Smith К., Kirk D., Latif S. // Transformation of progesterone, testosterone and androstenedione by Phycomyces blakesleeanus. J. Steroid Biochem. V.32, no.3, pp.445-451. 1989.

12. Hu S.-H., Genain G., Azerad R. // Microbial transformation of steroids: Contribution to 14a-hydroxylations. Steroids, V.60, no.4, pp.337-352. 1995.

13. Steroids, V.73, pp.13-18. 2008.

14. Iizuka H., Naito A., Sato Y. J.Gen.Appl. Microbiol. V.7, p.118, 1961.

15. Kondo E., Tori К. // J.Am.Chem.Soc. V.86, p.736, 1964.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ 14α-гидроксилирования Δ⁴-3,17-дикетоандростенов с помощью нового штамма гриба Curvularia lunata ВКПМ F-981. Мицелий гриба Curvularia lunata ВКПМ F-981 суспендируют в водной среде, не содержащей компонентов, необходимых для роста гриба. Трансформируемый Δ⁴-3,17-дикетоандростен вносят в водную среду либо в виде микрокристаллической суспензии, либо в виде водорастворимого комплекса с химически модифицированным β-циклодекстрином. Выход 14α-гидроксипроизводых андростендиона (АД) составляет 40-70%. Изобретение позволяет ускорить накопления 14α-гидроксистероидов и упростить метод их выделения. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ 14α-гидроксилирования Δ⁴-3,17-дикетоандростенов с помощью плесневого гриба Curvularia lunata, отличающийся тем, что для эффективного гидроксилирования указанных стероидов в качестве биокатализатора используют мицелий нового штамма гриба Curvularia lunata ВКПМ F-981, суспендированный в водной среде, трансформируемый Δ⁴-3,17-дикетоандростен вносят в водную фазу либо в виде микрокристаллической суспензии, либо в виде водорастворимого комплекса с химически модифицированным β-циклодекстрином.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что водную фазу, содержащую солюбилизатор после выделения продуктов реакции, используют без регенерации полимера для повторного процесса трансформации.