МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 7α-ГИДРОКСИАНДРОСТЕНОВ Российский патент 2009 года по МПК C12P33/00 C12P33/06 C12N1/14 A61K35/66 

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение касается методов получения лекарственных препаратов стероидной природы с помощью микроорганизмов, конкретнее способа получения 7α-гидроксипроизводных стероидов ряда андростана, в частности андростенолона (дегидроэпиандростерона - ДЭА) и его 17β-гидроксианалога.

Из литературных источников известно, что 7-гидроксипроизводные стероидных 5-олефинов обладают уникальными биологическими свойствами. У них установлено наличие противоопухолевой, иммуностимулирующей, антихолестеринемической, ноотропной, и радиопротекторной активностей [1-9].

Разносторонняя и высокая биологическая активность Δ⁵-7-гидроксистероидов делает проблему их синтеза чрезвычайно актуальной и объясняет огромный интерес исследователей к реакции С7-гидроксилирования. Тем не менее, в настоящее время отсутствует перспективный способ получения 7-гидроксипроизводных стероидных 5-олефинов, необходимый для создания целого ряда новых лекарственных препаратов.

Описаны лишь химические способы синтеза такого рода соединений, поскольку аллильное окисление относится к фундаментальным реакциям органической химии [10-14]. Однако наличие таких недостатков, как невысокие выходы, связанные со сложностью проведения процесса окисления и выделения продуктов реакции, а также применение дорогостоящих или вредных для здоровья и экологии веществ, обуславливают неэффективность данных методов получения 7-гидроксистероидов.

Наиболее широко для осуществления реакции 7-гидроксилирования используются соединения шестивалентного хрома в виде комплекса хромового ангидрида с пиридином, хлорхромата и бихромата пиридиния, бихроматов калия или натрия в уксусной кислоте [10, 12]. В числе других реагентов применяются соединения марганца (двуокись и перманганат калия), окислы рутения и селена [13].

Альтернативой химическому синтезу стероидных Δ⁵-7-гидрокси-олефинов является микробиологическое гидроксилирование, отличающееся стерео- и региоспецифичностью, недоступной химическим методам.

Способность к С7-гидроксилированию стероидной молекулы обнаружена у некоторых представителей высших и низших грибов. Известны примеры применения для С7-гидроксилирования стероидов аскомицетов (Diapothe и Gibberella), дейтеромицетов (представителей родов Cephalosporium, Diplodia, Fusarium) и зигомицетов (Absidia, Cunningamella, Mucor, Rhizopus) [1-5, 15-21]. Однако с участием указанных микроорганизмов описаны трансформации лишь Δ⁴-3-кетостероидов. Причем продуктами этих реакций, как правило, являются дигидроксипроизводные, а целевые 7-моногидроксисоединения образуются в незначительных количествах.

Наиболее близким к заявляемому способу аналогом является трансформация ДЭА и прегненолона культурой гриба Fusarium moniliforme [5] с образованием соответствующих 7-моногидроксипроизводных - 86% 7α-гидрокси-ДЭА (ГДЭА) и 65% 7α-гидроксипрегненолона. Для получения указанных 7-гидроксисоединений мицелий Fusarium moniliforme [5] в течение 18 ч предварительно подвергают контакту с ДЭА с целью активации 7α-гидроксилазы. Затем биомассу гриба в количестве 10 г/л переносят в свежую питательную среду и проводят трансформацию ДЭА или прегненолона при нагрузке 0,4 г/л в течение 24 ч в аэробных условиях при температуре 27°С. Низкое содержание в среде трансформируемых с помощью Fusarium moniliforme субстратов, необходимость активации 7α-гидроксилазы и невысокая скорость гидроксилирования являются основными недостатками указанного способа получения ГДЭА.

Низкая концентрация стероидных соединений в реакционной среде, связанная с их очень низкой растворимостью в водных средах, является особенностью процессов, выполняемых с помощью живых микроорганизмов. Этот фактор наряду с недостаточной доступностью стероидов для микробной клетки, служат, как правило, причиной низкой степени превращения стероидных субстратов и представляют серьезное препятствие для получения стероидных лекарственных препаратов, особенно в промышленном масштабе. Для увеличения нагрузки стероидных субстратов, повышения их биодоступности и степени превращения применяют предварительное механическое измельчение стероида до микрокристаллического состояния, либо вносят в виде мелкодисперсной эмульсии в органических растворителях, иногда проводят реакцию в присутствии растворителя, смешивающегося с водой [20]. Однако органические растворители оказывают токсическое действие на микроорганизмы. Известны также способы внесения стероидных субстратов в виде комплексов с β-циклодекстрином (ЦД) [22] или химически модифицированным ЦД (ХМЦД), значительно повышающими растворимость стероидных субстратов и скорость реакций. Однако эффективность ХМЦД продемонстрирована лишь в процессах, осуществляемых с помощью бактерий [23]. Для трансформаций стероидов с помощью грибов ХМЦД ранее не применялись.

Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в разработке способа селективного 7α-гидроксилирования стероидных Δ-5-олефинов андростанового ряда.

Технический результат, который может быть достигнут при осуществлении изобретения, заключается в повышении селективности процесса, увеличении нагрузки стероидного субстрата и повышении его биодоступности.

Сущность способа заключается в использовании для микробиологического процесса гидроксилирования Δ⁵-андростенов плесневого гриба Curvularia lunata ВКПМ F-981, а самого субстрата в мелкокристаллическом виде или в виде комплекса включения с ХМЦД.

Примеры использования плесневого гриба Curvularia lunata ВКПМ F-981 для гидроксилирования стероидов показывают, что ХМЦД существенно увеличивают биодоступность субстрата, о чем свидетельствует высокая скорость модификации стероидной молекулы.

В отличие от растущей культуры гриба Fusarium moniliforme, мицелий Curvularia lunata ВКПМ F-981 проводит селективное 7α-гидроксилирование стероидов в отсутствие компонентов питательной среды. Накопление 7α-гидроксипродуктов осуществляется мицелием в буферном растворе, содержащим до 10 г/л стероидного субстрата. Для трансформации применяют стероиды или в мелкокристаллическом виде или в виде комплексов с ХМЦД. При этом гидроксилирование 5-андростенов протекает с высокой скоростью - не более 2 суток, и для осуществления 7α-гидроксилирования не требуется стадия предварительной активации фермента. Конверсия стероидов грибом Curvularia lunata не сопровождается деструкцией субстрата и продукта, что иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. Получение 3β,7α,17β-тригидроксиандрост-5-ена из 3β,17β-дигидроксиандрост-5-ена.

Споры Curvularia lunata ВКПМ F-981 переносили со скошенной агаризованной среды следующего состава, г/л: дрожжевой экстракт - 4,0, солодовый экстракт - 10,0, глюкоза - 4,0, агар - 25; рН 6,2-6,9, в жидкую среду, содержащую в г/л: сахарозу - 30, дрожжевой автолизат - 2,5, NaNO₃ - 2,0, К₂НРО₄ - 1,0, (NH₄)H₂PO₄ - 3,0, КСl - 0,5, MgSO₄×7H₂O - 0.5, рН 6,0-6,2. Культуру гриба выращивали 72 ч в 100 мл указанной среды в конических качалочных колбах объемом 750 мл при 28°С и скорости перемешивания 220 об/мин. Инокулят переносили в такую же среду и инкубировали в тех же условиях 24 часа. Затем мицелий отделяли от среды и суспендировали в фосфатном буфере, рН 6,0-6,3, содержащем микронизированный 3β,17β-дигидроксиандрост-5-ен в количестве 2 г/л. Инкубировали на качалке при указанных выше условиях в течение 20-24 ч до исчезновения исходного субстрата.

Мицелий отделяли от буфера, после чего водную фазу трижды экстрагировали хлороформом. Экстракт упаривали, сушили при 60°С и получали кристаллический 3β,7α,17β-тригидроксиандрост-5-ен с выходом 58-62%. Технический продукт промывали ацетоном, сушили при 60°С, кристаллизовали из метанола и получали триол с т.пл. 252-256°С. Спектр ПМР (δ, м.д.), (D-ДМСО): 0,63 с (18 Me); 0,87 с (19 Me); 3,27 м (3Н_α); 3,42 м (17Н_α); 3,57 т (7β); 4,03 д (7-ОН_α) ³J_7-OH,7Hв=6,66 Гц; 4,38 д (17-ОН) ³J_17-OH,17-Hα=4,78 Гц; 5,40 дд (6Н) J_6,7=5,37 Гц.

Пример 2. Получение 3β,7α,17β-тригидроксиандрост-5-ена из 3β,17β-дигидроксиандрост-5-ена в присутствии метил-β-циклодекстрина.

Трансформацию 3β,17β-диола проводили аналогично примеру 1, но конвертируемый субстрат вносили при нагрузке 5 г/л в фосфатный буфер, содержащий метил-β-циклодекстрин в соотношении к стероиду 1:1 (моль/моль). Инкубацию осуществляли в течение 48 ч. Получали указанный триол с выходом 70-75%.

Пример 3. Получение 7α-гидрокси-ДЭА из ацетата ДЭА. Трансформацию ацетата ДЭА проводили аналогично примеру 2, но для гидроксилирования использовали ацетат ДЭА при нагрузке 10 г/л, который инкубировали в течение 44-48 ч. Полученную после отделения мицелия водную фазу экстрагировали этилацетатом, экстракт упаривали и получали с количественным выходом 7а-гидрокси-ДЭА в виде очень густого (вязкого) масла. После обработки масла водным ацетоном получали кристаллический продукт с т.пл. 181-184°С. Лит.данные 181,5-183,5°С [15]. Масс-спектр (m/z): 304 (М⁺), 286, 271, 253. Спектр ¹ПMP (СDСl₃) (δ, м.д.): 0,86 с (18 Me)); 0,99 с (19 Me); 3,55 м (³J_3,2=11,1, 3Н_α); 3.94 м (³J_6,7=5,3 гц, 7Н_β); 5,61 кв (6H).

Пример 4. Получение 7α-гидрокси-ДЭА из ДЭА.

Гидроксилирование ДЭА при нагрузке 4 г/л проводили алогично примеру 2. Трансформация ДЭА заканчивалась через 19 ч с выходом 7а-гидрокси-ДЭА 85%.

Пример 5. Получение 7α-гидрокси-ДЭА из ацетата ДЭА в присутствии ЦД и гидроксипропил-ЦД.

Гидроксилирование ацетата ДЭА осуществляли аналогично примеру 3, но вместо метил-в-циклодекстрина в качестве солюбилизатора использовали в-циклодекстрин, либо гидроксипропил-ЦД. Трансформацию ацетата ДЭА проводили 48 ч. После обработки аналогично примеру 3 получали 60-76% 7α-гидрокси-ДЭА, идентичного полученному в примере 3.

Литература

1. Femandes P., Cruz A., Angelova В., Pinheiro H.M., Cabral J.M.S. // Enzyme and Microbial Technol. V.32. P.688-705. 2003.

2. Lathe R., Rose K.A., Seckl J.R., Best R., Yau J.L., Leckie CM. // WO 9737664, 1997.

3. Morfin R., Courchay G. // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. V. 50, p.91-100, 1994.

4. Cotillon A.C., Morfin R. // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. V.68. P.229-237, 1999.

5. Dray F.J., Cotillon A.C. // FR Pat. 2771105, 1999.

6. Sebastien W-E., David J-P., Sasdovitch V., Liere P., Schumacher M.

7. Delacourte A. Baulieu E.E., Akwa Y. // Brain Res. V.969, p.117-125, 2003.

8. Shi J., Schulze S., Lardy H.A. // Steroids. V.65. P.124-129. 2000.

9. Loria R.M. // Steroids. V.67, p.953-966, 2002.

10. Ausi D.L., Ahlem С., Li M. et al. // Mod. Asp. Immunol. V.3, p.64-70, 2003.

11. Lathe R. // Steroids. V.67, p.967-977, 2002.

12. Kumar V., Amann A., Ourisson G., Luu B.//Synthetic commun. V.17, p.1279-1286, 1997.

13. Graham A.W. // WO 97/48367.

14. Marwah P., Marwah A., Kneer N., Lardy H. // Steroids. V.66. P.581-595, 2001.

15. Loria R.M. // US Patent 5277907.

16. Ахрем А.А., Титов Ю.А. // Стероиды и микроорганизмы. «Наука». 1970.

17. Mahato S.B., Banerjee S., Podder S. // Phytochemistry. V.28. P.7-40. 1989.

18. Kolek Т.J. // Steroid Biochem. Mol. Biol. V.71, p.83-90, 1999.

19. Wilson M.R, Gallimore W.A., Reese P.B. // Steroids. V.64. No.12. P.834-843. 1999.

20. Sedlaczek L. //Crit. Rev. Biotechnol. V.7. No.3. P.187-236. 1988.

21. Choudhary M.I., Ali Shah S.A., Musharrah S.G., Shaheen F., Ur-Rahman A. // Nat. Prod. Res. V.17. No.3. P.215-220. 2003.

22. Nagy E.U., Bartho I., Hantos G., et all. // GB Patent 2108965. 1983.

23. Донова М.В., Довбня Д.В., Калиниченко А.Н. и др. // Патент РФ №940017640. 1996.

Изобретение относится к биотехнологии. Способ селективного получения 7α-гидроксиандростенов с помощью грибного мицелия, включает трансформацию Δ⁵ -андростенов с помощью отделенного и отмытого от среды мицелия Curvularia lunata ВКПМ F-981. Причем субстрат используют в виде микрокристаллов, либо в виде комплекса с циклодекстринами. Изобретение позволяет получить выход целевых 7-гидроксипродуктов - 60-90%. 1 з.п. ф-лы.

1. Микробиологический способ получения 7α-гидроксиандростенов с помощью грибного мицелия, отличающийся тем, что трансформацию Δ⁵-андростенов проводят с помощью отделенного и отмытого от среды мицелия Curvularia lunata ВКПМ F-981, а субстрат используют в виде микрокристаллов либо в виде комплекса с циклодекстринами.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве циклодекстринов используют β-циклодекстрин или его химически модифицированные производные, такие, как метилциклодекстрин и гидроксипропил-циклодекстрин.