ШТАММ Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1740 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ 9 АЛЬФА-ГИДРОКСИСТЕРОИДОВ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 C12P33/06 C12R1/02 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической, фармацевтической и химической промышленности. Предлагаемый новый штамм актинобактерии Rhodococcus erythropolis предназначен для получения различных 9α-гидроксистероидов, играющих роль ключевых соединений в синтезе широкого спектра лекарственных препаратов стероидной природы.

В настоящее время большинство стероидных лекарственных препаратов, используемых в медицине и ветеринарии, представляет собой структурные модификации природных соединений, обладающих более высокой биологической активностью и меньшими побочными эффектами.

Главная роль в получении модифицированных стероидов отводится микробиологической трансформации, способной при наличии селективных штаммов одностадийно провести необходимую структурную модификацию. Способность микроорганизмов трансформировать стероиды является практически единственно возможным способом введения гидроксильных групп в 9- и 11-положения стероидной молекулы, приводящим к синтезу высокоактивных кортикоидов. 9α-Гидроксистероиды являются исходными продуктами для синтеза 11β-гидрокси-9α-галоид содержащих стероидов ряда прегнана, проявляющих высокую антиаллергическую, противошоковую и противовоспалительную активности, таких как триамцинолон, дексаметазон, синафлан и др. [1] Введение 9α-гидроксигруппы в андростановую молекулу также актуально, так как приводит к высокоактивным аналогам препаратов с антиандрогенной, антиэстрогенной и противозачаточной активностью.

Введение 9α-гидроксигруппы в стероидную молекулу способны осуществлять некоторые низшие грибы {Ascochyta, Helicostilum, Circinella) и многие актинобактерии (Arthrobacter, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus) [2-5]. Недостаток гидроксилирования стероидов с помощью грибов заключается в отсутствии селективности проводимого с их помощью процесса. Наряду с образованием целевого гидроксистероида грибы образуют также побочные моногидрокси- и дигидроксипродукты, присутствие которых затрудняет выделение основного гидроксистероида и существенно уменьшает его выход. Во-вторых, положение и ориентация гидроксигруппы, вводимой грибами в стероидную молекулу, сильно зависит от стероидной структуры [4]. Например, известный своей 11β-гидроксилирующей активностью фикомицет Curvularia lunata вводит 11β-гидроксигруппу в стероиды ряда прегнана - кортексолон и его ацетаты [2], тем не менее стероид ряда андростана - андростендион гидроксилирует в основное положение 14α-[6].

В отличие от грибов, бактерии способны осуществлять 9α-гидроксилирование стероидов различной структуры и строения ряда эстрана, андростана и прегнана [5]. Однако к 9α-гидроксилированию способны те бактерии, которые могут использовать стероиды в качестве источника углерода, так как эта реакция является промежуточной стадией в процессе полного расщепления стероидной молекулы до CO₂ и Н₂O, в котором одновременно с 9α-гидроксилазой участвует фермент 3-кетостероид-1,2-дегидрогеназа. Одновременное действие указанных ферментов на стероидную молекулу приводит к разрыву связи С9-С10 и нарушению целостности стероидного ядра.

Селективное 9α-гидроксилирование бактериями без разрушения стероидной структуры осуществляют с помощью мутантных штаммов бактерий, у которых блокирован синтез 1,2-дегидрогеназы или созданы условия, препятствующие ее функционированию. Известен генетически модифицированный штамм Rhodococcus erythropolis DSM 13157, утративший способность разрушать стероидное ядро и превращающий андростендион в 9α-гидроксиандростендион [7]. 9α-Гидроксиандростендион также образуется в результате трансформации стеринов животного и растительного происхождения мутантными штаммами бактерий рода Mycobacterium - M.fortuitum, M.parafortiutum, M.roseum, M.vaccae [8-11]. Однако эти микобактерии не могут быть использованы для получения 9α-гидроксипроизводных стероидов ряда прегнана, поскольку синтезируют ферменты, ответственные за расщепление стероидной боковой цепи. Не сообщается также о способности Rhodococcus erythropolis DSM 13157 к превращению в 9α-гидроксипроизводные других стероидов, помимо андростендиона [7].

Наличие 9α-гидроксилирующей активности в отношении стероидов ряда эстрана, андростана и прегнана показано у актинобактерии Nocardia canicruria АТСС 31448 [5]. Указанный штамм образует 9α-гидрокси-производные различных стероидов, не затрагивая их боковую цепь. Для проведения гидроксилирования этой бактерией трансформируемый стероид добавляют в виде водно-метанольной суспензии (предварительно пастеризованной) к культуре в возрасте 31 ч и проводят трансформацию в течение 30-47 ч. Таким образом, общее время роста культуры и периода трансформации стероидного субстрата при нагрузке его в реакционной среде в количестве 0,6 г/л составляет 60-78 ч.

Новый штамм Rhodococcus erythropolis отличается от Nocardia canicruria АТСС 31448 тем, что при его использовании трансформируемый стероид в виде раствора в диметилформамиде (ДМФА) добавляют к трансформационной среде перед ее стерилизацией, вследствие чего исключается необходимость пастеризации стероидного субстрата. Клетки нового штамма сохраняют жизнеспособность и 9α-гидроксилазную активность при концентрации ДМФА в среде до 10 об.% и содержании стероидного субстрата до 10 г/л и более. Внесение посевного материала в среду, уже содержащую стероидный субстрат, позволяет значительно сократить время трансформации - до 24-26 ч, которого достаточно для полной конверсии андростендиона в 9α-гидроксиандростендион при высокой нагрузке стероидного субстрата (более 4 г/л).

Указанный штамм получен путем селекции актинобактерии, проявляющей 1,2-дегидрогеназную активность по отношению к стероидам Δ⁴, Δ⁵- и 5α-Н-ряда, ранее идентифицированной как Rhodococcus sp. на основании культуральных, морфологических и биохимических признаков. Полученный из Rhodococcus sp. новый штамм отличается высокой 9α-гидроксилазной активностью как на традиционных средах, так и на средах с высоким содержанием ДМФА и неспособностью к синтезу 1,2-дегидрогеназы, действие которой на стероиды одновременно с 9α-гидроксилазой провоцирует деструкцию стероидной молекулы. Новый штамм идентифицирован как Rhodococcus erythropolis при сравнении нуклеотидной последовательности генов, кодирующих синтез 16S-PHK в клетках родококков 26 видов. Характерная для нового штамма Rhodococcus erythropolis последовательность нуклеотидов представлена в табл.1. Установлен его филогенетический статус на филогенетическом древе прокариот.

Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микрорганизмов под каталожным номером ВКПМ Ас-1740. Он способен вводить 9α-гидроксигруппу в стероиды ряда андростана, прегнана, эстрана, введенных в трансформационную среду в виде мелкокристаллической суспензии, либо растворенными в смешивающемся с водой органическом растворителе, либо в виде комплексов с циклодекстринами.

Для процессов выращивания нового штамма родококка Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1740 и трансформации стероидов с его помощью служат питательные среды, содержащие в качестве источника азота аммонийные или нитратные соли, а также кукурузный или дрожжевой экстракт, в качестве источника углерода могут быть использованы сахара, предпочтительно - глюкоза. Процессы выращивания и 9α-гидроксилрования проводят в аэробных условиях на качалке, либо в ферментере. Температура инкубации может быть в интервале 24-35°С, оптимальная - в интервале 28-30°С. Трансформируемые стероиды добавляют в среду перед стерилизацией в виде мелкодисперсного порошка, либо в виде раствора в смешивающемся с водой растворителе, предпочтительно ДМФА, либо в виде комплекса с β-циклодекстрином, либо его производными, например с метил-β-циклодекстрином (МеЦД). Время трансформации Δ⁴-3-кетостероидов при нагрузках 4-10 г/л составляет 20-48 ч.

Следующие примеры иллюстрируют трансформирующую способность штамма Rh. erythropolis ВКПМ Ас-1740.

Содержание в культуральной жидкости 9α-гидроксипроизводных исследуемых стероидов оценивали с помощью ВЭЖХ. Конечный продукт извлекали экстракцией этилацетатом. Количественное определение продуктов трансформации проводили методом ВЭЖХ на хроматографе Gilson на колонке с Silasorb С-18 (4,0×250 мм), зернение 10 мµ, λ 254 нм. Скорость потока 0,8 мл/мин. Подвижная фаза МеОН-Н₂O (70:30).

(¹Н)-ЯМР-спектры соединений получены на спектрометре Unity+400(Varian), рабочая частота 400 МГц.

Пример 1. Получение 9α-гидроксиандростендиона (9α-ОН-АД).

Биомассу актинобактерии Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1740 со скошенного агара ((г/л) кукурузный экстракт - 10.0, глюкоза- 10.0, К₂НРО₄ - 1.0, pH 6.8-7.2) переносили в жидкую среду того же состава (без агара) и выращивали культуру в течение 70-72 ч на качалке при т-ре 29°С и скорости перемешивания 220 об/мин. Полученный материал использовали как инокулят для второй генерации на той же среде. Бактерию в возрасте 24 ч переносили в трансформационную среду следующего состава: (г/л) дрожжевой экстракт - 15 г/л, глюкоза - 10 г/л, К₂HPO₄ - 1.0 г/л (pH 6.9.-7.0) и 4.0 г/л андростендиона (АД). АД вносили в среду в виде раствора в ДМФА. Трансформацию осуществляли в течение 18-24 ч. После полной конверсии АД в 9α-ОН-АД биомассу отделяли и экстрагировали отдельно фильтрат и осадок. Экстракты объединяли, обрабатывали активированным углем. Экстракт упаривали досуха в вакууме при 50-60°С. Кристаллический осадок обрабатывали насыщенным раствором. NaHCO₃, перемешивали в течение 1 ч. Осадок отфильтровывали, промывали водой до нейтрального pH, сушили при 60°С. Получали с количественным выходом 9α-ОН-АД 97%-ного содержания по данным ВЭЖХ.

Пример 2. Трансформацию АД и выделение продукта 9α-ОН-АД осуществляли как описано в примере 1, но АД в количестве 4 г/л вносили в среду предварительно измельченным до частиц размером 10-20 мкм. Трансформацию проводили в течение 24-26 ч. Количество выделенного 9α-ОН-АД составило 3,6 г/л.

Пример 3. Трансформацию АД при нагрузках 6 и 10 г/л, растворенного в ДМФА, осуществляли аналогично примеру 1. Время трансформации и содержание в культуральной жидкости 9α-ОН-АД в зависимости от нагрузки АД и концентрации ДМФА показано в табл.2.

Таблица 2. Содержание 9α-ОН-АД и время его накопления в зависимости от нагрузки АД и способа его внесения в трансформационную среду. Нагрузка АД, г/л Способ внесения АД Время трансформации, ч Содержание 9α-гидрокси-АД, г/л 4,0 Микрокристаллы, 10-20 мкм 24-26 3,6 4,0 Раствор в ДМФА, 4% 18-24 4,0 6,0 Раствор в ДМФА, 5% 40-42 5,4 10,0 Раствор в ДМФА, 9% 46-48 8,5

Пример 4. Получение циангидрина 9α-ОН-АД.

Трансформацию осуществляли аналогично примеру 2, но вместо АД в качестве стероидного субстрата использовали циангидрин АД при нагрузке 0,5 г/л и измельченный субстрат вносили в среду после стерилизации. Трансформацию проводили 20 ч и получали смесь циангидрина 9α-ОН-АД и 9α-ОН-АД в соотношении 1/1. Строение циангидрина 9α-ОН-АД подтверждено снятием циангидринной защиты и получением 9α-ОН-АД, идентичного стандартному образцу.

Пример 5. Получение 9α-гидрокси-17α-метилтестостерона.

Трансформацию осуществляли аналогично примеру 1, но вместо АД использовали в качестве субстрата 17α-метилтестостерон в виде комплекса с метил-β-циклодекстрином (при нагрузке 4 г/л). Трансформацию вели в течение 20 ч. Выход 9α-гидрокси-17α-метилтестостерона составил 70%. Т.пл. 192-194°С (из этилацетата) соответствует литературным данным [5].

Пример 6. Трансформацию осуществляли аналогично примеру 5, но субстрат вносили в среду в растворе ДМФА. Трансформацию заканчивали через 26 ч. Содержание 9α-гидрокси-17α-метилтестостерона в культуральной жидкости составило 70%.

Пример 7. Получение γ-лактона 9α,17-дигидрокси-3-кетопрегна-4,6-диен-21-карбоновой кислоты.

Трансформацию проводили аналогично примеру 1, но вместо АД в качестве субстрата вносили при нагрузке 4 г/л γ-лактон-17-гидрокси-3-кетопрегна-4,6-диен-21-карбоновой кислоты в виде комплекса с МеЦД. Трансформацию заканчивали через 16 ч. Выход γ-лактона 9α,17-дигидрокси-3-кетопрегна-4,6-диен-21-карбоновой кислоты 60%. Т.пл. 230°С с разл. (из метанола). ПМР-спектр (8, м.д.) 0,99 (18-СН₃), 1,19 (19-СН₃), 2,62 (1-Н₈),581 (1-Н₄), 5,9 (1-Н₆), 6,24 (1-Н₇).

Пример 8. Получение 9α,17α-дигидроксипрегн-4-ен-3-она.

Трансформацию проводили аналогично примеру 1, но вместо АД в качестве субстрата вносили в среду при нагрузке 1 г/л 17α-гидроксипрегн-4-ен-3-он в виде комплекса с МеЦД. Трансформацию заканчивали через 19 ч. Выход 9α,17-дигидроксипрегн-4-ен-3-она составил 57%. Т.пл. 250-253°С (из ацетона) [5].

Пример 9. Получение 9α-гидроксиэстр-4-ен-3,17-диона.

Трансформацию проводили аналогично примеру 1, но вместо АД в качестве субстрата в среду вносили при нагрузке 1 г/л 19-нортестостерон в виде комплекса с МеЦД. Трансформацию заканчивали через 20 ч с образованием 60% 9α-гидроксиэстр-4-ен-3,17-диона. Т.пл. 218-223°С (из ацетона) [5].

Источники информации

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства, 2002, т.1.

2. Fernandes P., Cruz A., Angelova В., Pinheiro Н.М., Cabral J.M.S. Enzyme and Microbial Technology. V.32. Pp.688-705. 2003.

3. Войшвилло H.E., Истомина З.И., Камерницкий A.B. и др. Прикладная биохимия и микробиология. Т.30. С.617-623. 1994.

4. Турута A.M., Войшвилло Н.Е., Камерницкий А.В. Успехи химии. Т.61. Вып.10. С.1883-1931. 1992.

5. Marsheck W.J., Jiu J., Wang Р.Т. US Patent 4397947. U.S.Class: 435/58.

6. Weber A, Kennecke M. Ger.Offen DE 4129005 A1.1993. Chem. Abstr. V.118. p.190112.

7. Ван Дер Гейзе P., Хесселс Г., Дейкхейзен Л. Патент RU 2268935. Бюл. №03.

8. Патент Японии 80.138395. Chem. Abstr. V.94. Ref. 63781.

9. Bokany J., Albrecht К., Ambrus G., Lang Т., Szabo I.M. US Patent 5004695.

10. Seidel L., Hoerhold C.J. Basic Microbiol. V.32. Pp.49-55. 1992.

11. Atrat P.G., Koch В., Szecalla В., Hoerhold-Schubert C.J. Basic Microbiol. V.32. P.147.1992

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в фармацевтической промышленности. Штамм Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ас-1740, полученный методом селекции актинобактерии, способен вводить 9α-гидроксигруппу в стероиды ряда андростана, прегнана, эстрана и при этом не продуцирует 1,2-дегидрогеназу. Применение изобретения позволяет обеспечить высокую 9α-гидроксилазную активность как на традиционных средах, так и на средах с высоким содержанием ДМФА. 2 табл.

Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis ВКПМ Ac-1740, обладающий способностью вводить 9α-гидроксигруппу в стероиды ряда андростана, прегнана, эстрана, отличающийся высокой 9α-гидроксилазной активностью как на традиционных средах, так и на средах с высоким содержанием ДМФА, неспособностью к синтезу 1,2-дегидрогеназы, сохраняющий жизнеспособность и высокую 9α-гидроксилазную активность при концентрации ДМФА в среде до 10 об.%.