СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНДРОСТА-1,4-ДИЕН-3,17-ДИОНА ИЗ СТЕРИНОВ РАСТИТЕЛЬНОГО И ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Российский патент 2007 года по МПК C12P33/00 C12N1/20 C12R1/32 

Использование: биотехнология, медицинская промышленность.

Сущность изобретения: андроста-1,4-диен-3,17-дион (АДД) получают микробиологическим отщеплением боковой цепи стеринов растительного или животного происхождения, используя в качестве трансформатора стеринов бактерию Mycobacterium neoaurum ВКПМ Ac-1656. Способ осуществляют в присутствии сорбентов продуктов реакции, главным образом АДД - соединения, токсичного для бактерий-трансформаторов, причем сорбент добавляется не в начале процесса трансформации, а в поздней лаг-фазе роста культуры. Способ позволяет проводить процесс превращения стеринов в АДД с высокой скоростью и высокой степенью конверсии. Применение полистирольных сорбентов, не нуждающихся в регенерации и отличающихся высокой механической прочностью и высокой сорбционной емкостью, обеспечивает возможность масштабирования процесса и повышения его экономичности.

Изобретение может быть использовано в микробиологической, химической и фармацевтической промышленности при получении стероида андростанового ряда - андроста-1,4-диен-3,17-диона (АДД), необходимого для синтеза стероидных лекарственных препаратов из стеринов растительного (фитостерины), либо животного происхождения (холестерин) с помощью микроорганизмов.

17-Кетостероиды (андрост-4-ен-3,17-дион (АД), АДД, 9α-гидрокси-АД) служат интермедиатами в синтезе стероидных препаратов, широко используемых в медицинской практике. АДД, в частности, является ключевым соединением в синтезе биологически активных стероидов, необходимых в животноводстве, ветеринарии и медицине, а именно - эстрогенов, а также гестагенов и анаболиков 19-норстероидного ряда [1].

Указанные 17-кетостероиды получают отщеплением боковой цепи стеринов растительного или животного происхождения с помощью мутантных штаммов бактерий, преимущественно рода Mycobacterium. АДД получают с помощью мутантных штаммов микобактерий, таких как M.fortuitum, M.parafortuitum, M.phlei, M.vaccae [2-4], у которых ингибирован синтез 9α-гидроксилазы, отвечающей в сочетании с 1,2-дегидрогеназой за расщепление кольца В стероидного скелета.

Известны способы получения АДД с помощью бактерий Arthrobacter globiformis, A.oxydans, A. simplex, Brevibacterium lypolytica, Rhodococcus corallina, R.equi, R.terrae [5-9], отличающихся высокой способностью усваивать стерины в качестве единственного источника углерода. Условием успешного проведения процесса с помощью указанных бактерий является применение ингибиторов 9α-гидроксилазы, таких как соли никеля, кобальта, либо хелатных агентов (α,α-дипиридил, 8-оксихинолин), в отсутствии которых стерины расщепляются до углекислого газа и воды.

Общим недостатком ранних способов получения АДД является низкое содержание стеринов в трансформационной среде (не более 1-2 г/л). Это связано с особенностью АДД, заключающейся в его токсичности для бактерий - трансформаторов при концентрации в среде выше 1 г/л. Например, уже в концентрации 0,8 г/л АДД подавляет рост культуры Mycobacterium vaccae ZIMET 11094 [4]. При этом следует заметить, что теоретический выход АДД (100% из 1 г холестерина) составляет 0,74 г.

Для преодоления вышеуказанного барьера в содержании стеринов 1 г/л разработано несколько способов. Известен способ, который заключается в проведении процесса в 2 стадии. На первой стадии из стеринов получают АД с помощью микобактерий при содержании фитостеринов в среде 5 г/л, а на второй стадии трансформируют АД в АДД 1,2-дегидрирующими грибами рода Fusarium [10]. Однако количество АДД в культуральной жидкости, образуемое грибами, не превышает 40%, по-видимому, из-за способности плесневых грибов одновременно с 1,2-дегидрированием кольца А в АД раскрывать кольцо D [11]. Описаны способы получения АДД, в которых, с целью повышения содержания стеринов в культуральной жидкости и соответственно образуемого АДД, бактериальные клетки изолируют от продукта трансформации. К таковым относятся способы, в которых для трансформации используют так называемые иммобилизованные клетки. Живые бактериальные клетки включают или адсорбируют на твердом гранулированном носителе [8, 12]. Однако существенным недостатком иммобилизации является как снижение трансформирующей активности иммобилизованных клеток по сравнению со свободными клетками, так и ухудшение доступа к ним субстрата.

В литературе описаны способы получения АДД, которые отличаются использованием в процессе трансформации циклодекстринов и их модифицированных производных, образующих комплексы включения как с субстратами, так и с продуктами реакции [13].

Известны также способы трансформации стеринов в присутствии органических сорбентов, селективных по отношению к 17-кетостероидам [14]. При использовании циклодекстринов либо сорбентов достигается значительное повышение эффективности процесса благодаря ликвидации эффекта его ингибирования продуктом. В случае циклодекстринов ингибирование культуры предотвращается вследствие образования комплексов включения с продуктом трансформации [13], во втором случае - благодаря селективной адсорбции АДД на смоле-сорбенте [14].

Эти способы позволяют вести процесс при нагрузках субстрата до 20 г/л. Согласно способу [13] трансформацию 5-20 г/л ситостерина проводят с помощью Mycobacterium sp. в присутствии водорастворимых циклодекстринов. Длительность трансформации 5 г/л стерина составляет 72-120 ч в зависимости от наличия заместителя в молекуле циклодекстрина и используемого штамма. Получают технический продукт, содержащий по данным ВЭЖХ 47-83% АДД. Качественный и количественный состав примесей в техническом продукте не указан.

Следует заметить, что несмотря на достаточно успешное решение части проблем при использовании химически модифицированных циклодекстринов, этот способ имеет ряд недостатков, таких как сложность и дороговизна получения модифицированных циклодекстринов, необходимость их регенерации, а также большая длительность процесса трансформации стеринов, обусловленная, вероятно, снижением доступности бактерий к субстратам, находящимся в комплексе включения с циклодекстринами.

Из литературных данных следует, что независимо от способа и условий получения АДД в культуральной жидкости наряду с целевым продуктом присутствует промежуточный АД в соотношении АДД/АД 10/1-5/1. Кроме АД в качестве побочных продуктов могут также присутствовать тестостерон (ТС), 1-дегидро-ТС, продукты с недоокисленной боковой цепью, например спирты (20-гидроксиметилпрегн-4-ен-3-он (ГМП) и 1,2-дегидро-ГМП (ДГМП)) и другие, более полярные, чем целевой продукт, соединения [2,3,9,14]. Наличие указанных стероидных примесей, особенно АД, значительно усложняет выделение целевого продукта АДД.

Наиболее близким к заявляемому способу по существу является способ [14], согласно которому в качестве адсорбента АДД использовали смолы марки Wofatit. Трансформацию фитостерина осуществляли с помощью штамма М. vaccae ZIMET 11094. Посевной материал вносили в питательную среду, в которой присутствовали стерины и смола-сорбент, которая неспецифично адсорбировала образующиеся 3,17-дикетостероиды и другие побочные Δ⁴-3-кетопродукты. При нагрузке фитостеринов не менее 10 г/л процесс заканчивался через 90-96 ч инкубации с образованием в качестве основного продукта АДД, содержание которого в конечной пробе по данным анализа составляло 67%. Соотношение АДД/АД и АДД/ДГМП составляло соответственно 8,5/1 и 8/1.

Накопление на смоле промежуточных продуктов трансформации и главным образом АД происходит, вероятно, потому, что АД, будучи первым продуктом полного отщепления боковой цепи стеринов, появляется уже в лаг-фазе и соответственно сразу адсорбируется на смоле. Однако индукция 1,2-дегидрогеназы - фермента, необходимого для образования АДД из АД, наиболее активно протекает в период логарифмической фазы роста культуры, и наличие смолы в самом начале роста бактерий может тормозить индукцию фермента. Не исключено, что вследствие этого может понижаться продуктивность культуры.

Важным моментом для крупномасштабного процесса является его экономичность. При одноразовом использовании сорбента в большом количестве (в указанном способе [14] - 175 мл на 10 г стерина) существенно возрастает стоимость конечного продукта. Большое значение имеет также механическая прочность сорбента, поскольку процесс превращения стеринов в 17-кетостероиды протекает при интенсивном перемешивании.

Целью настоящего изобретения является повышение эффективности и экономичности процесса трансформации стеринов в АДД.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что стерины растительного или животного происхождения трансформируют в АДД в присутствии синтетического сорбента целевого продукта с помощью нового мутантного штамма Mycobacterium neoaurum, депонированного во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ Ас-1656. Штамм Mycobacterium neoaurum ВКПМ Ac-1656 получен в результате традиционного мутагенеза и лабораторной селекции микобактерий с высокой трансформирующей способностью в отношении фитостеринов [15].

По сравнению с известными культурами указанная микобактерия более устойчива к действию целевого продукта (АДД), бактериостатическая концентрация которого составляет 1,5-2,0 г/л. Культура практически не образует продуктов восстановления 17-кетогруппы - ТС и 1-дегидро-ТС. С целью ускорения трансформации и повышения выхода целевого продукта сорбент для извлечения АДД добавляют не в начале ферментации, а вносят в эффективном количестве в культуральную жидкость в конце ростовой лаг-фазы. В присутствии смолы-адсорбента АДД плотность биомассы в среде возрастает от начального значения 3·10⁷ КОЕ/мл (после внесения посевного материала) до 4,5·10⁹ КОЕ/мл, тогда как в отсутствие адсорбента она остается на том же уровне.

Предлагаемый способ позволяет проводить полную конверсию фитостеринов при нагрузках не ниже 10 г/л в течение 60-75 ч с сохранением баланса по сумме образующихся продуктов и содержанием АДД 66-76%, при этом соотношение АДД/АД и АДД/ДГМП варьирует в зависимости от состава стеринов в пределах 10/1-9/1 и 12/1-8/1 соответственно.

В качестве сорбента АДД могут быть использованы различные высокопористые неионогенные синтетические макросшитые полимеры. Могут быть использованы сорбенты марки «поролас», получаемые сополимеризацией дивинилбензола и этилстирола в присутствии различных модифицирующих добавок (например, винилацетат, акриловый эфир, метакриловая кислота), а также сверхсшитые полистиролы марки «пуролит» (например, смолы MN-200, MN-202).

Экономичность процесса повышается также за счет применяемых смол-сорбентов, отличающихся высокой механической прочностью и сорбционной емкостью. Используемые сорбенты не требуют регенерации, не разрушаются в ферментациях с отбойниками. Для полной адсорбции АДД достаточно количества смолы в отношении к стерину, равном 10:1, что почти в 2 раза меньше количества смолы Wofatit.

Предлагаемый способ осуществляется с применением мутантного штамма Mycobacterium neoaurum ВКПМ Ac-1656, однако он может быть использован для реализации аналогичных ферментационных процессов биоконверсии стеринов до АДД с помощью других видов бактерий. Следующие примеры иллюстрируют предлагаемый способ.

Качественный анализ продуктов трансформации проводили, используя метод тонкослойной хроматографии; количественный анализ - с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Содержание АДД и побочных продуктов оценивали в г/л и в % от теоретически возможного, учитывая истинное содержание стеринов в трансформируемом субстрате. Учитывали, что количество АДД при 100%-ном превращении 414 г смеси фитостеринов составляет 286 г, то есть теоретически из 10 г/л субстрата можно получить 6,87 г/л АДД.

Пример 1. Бактерии Mycobacterium neoaurum ВКПМ Ac-1656 поддерживают на твердой среде следующего состава, г/л: глюкоза - 10, соевая мука - 5,0, лимонная кислота - 2,2, мочевина - 0,5, аммоний хлористый - 1,0, калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,5, магний сернокислый - 0,5, кальций углекислый - 1,5, железо сернокислое - 0,05, агар-агар - 25, рН 7,0 - 7,5. Клетки в возрасте 10-15 сут переносят в жидкую среду того же состава, но без агара и содержащую 8 г/л соевой муки (обезжиренная мука и необезжиренная в соотношении 1,5:2.5). Инокулят выращивают в течение 4 сут при температуре 29-31°C и переносят в трансформационную среду, содержащую, г/л: измельченные в присутствии ПАВ (размер частиц не более 15 ммк) соевые фитостерины следующего состава - (25,6% (3-ситостерина, 23% кампестерина, 22,3% стигмастерина и 12,6% не идентифицированных стеринов) - 10 (в 100%-ном исчислении стероидного субстрата), глюкоза - 10, соевая мука - 15 (обезжиренная и необезжиренная в соотношении 1:2), лимонная кислота 2,2, (NH₄)₂HPO₄ - 1,5, MgSO₄ - 0,5, FeSO₄ - 0,05, СаСО₃ - 1,5, деионизированная вода, рН 6,8-7,2. Ферментацию проводят при температуре 30-31°С в течение 60 ч, полистирольный сорбент «Пуролит» в количестве 100 г вносят в культуральную жидкость в поздней ростовой лаг-фазе. О потреблении фитостерина судят с помощью ТСХ. По окончании процесса, определяемого по отсутствию стеринов в культуральной жидкости, смолу отделяют от культуральной жидкости фильтрацией, продукты трансформации элюируют со смолы последовательно спиртом и хлористым метиленом и определяют методом ВЭЖХ-анализа содержание АДД и других стероидов. Результатом трансформации 31,5 г фитостеринов (в пересчете на 100%-ное содержание) являются 22 г технического продукта, содержащего 74% АДД, 7,8% АД и 8,1% ДГМП.

Пример 2. Способ осуществляют по примеру 1, но в качестве полистирольного сорбента используют «Поролас» также в количественном отношении к стерину 10/1. Трансформацию проводят в течение 62 ч и получают элюат, содержащий 72% АДД с примесью АД и ДГМП в соотношении 10/1 и 11/1 соответственно.

Пример 3. Способ осуществляют по примеру 1, но в качестве субстрата используют соевые фитостерины (41,2% β-ситостерина, 23,8% кампестерина, 20,2% стигмастерина, ˜3% брассикастерина, кампастанола, стигмастанола). Трансформацию проводят в течение 65 ч и получают элюат, содержащий 70% АДД с примесью АД и ДГМП в соотношении 9,5/1 и 10/1 соответственно.

Пример 4. Способ осуществляют по примеру 1, но в качестве субстрата используют фитостерины из отходов переработки древесины хвойных пород (66,7% β-ситостерина, 20,7% смеси кампестерина и стигмастерина). Трансформацию проводят в течение 75 ч и получают элюат, содержащий 66% АДД с примесью АД и ДГМП в соотношении 9/1 и 8/1 и около 1% 1-дегидро-ТС.

Пример 5. Способ осуществляют по примеру 1, но в качестве субстрата используют холестерин (98%). Трансформацию проводят в течение 60 ч и получают элюат, содержащий 76% АДД с примесью 7,5% АД и 6,4% ДГМП.

Источники информации

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства, Харьков, Торсинг, 1997.

2. Wovcha M.G., Biggs С.В, Pyke T.R. US Pat. 4339539. C1. 435/253.

3. Imata Y., Takahashi K., Katogi S. Japan Pat. 79/59 395.

4. Hoerhold С., Gottschaldt В., Grosse H.-h. Fifth Int. Conf. on Chemistry & Biotechnol. Varna, Bulgaria. V.4, p.92-110, 1989.

5. Srivastava S.K., Srivastava R.A.K., Mathur S.N. J. Appl. Bacteriol. V.59, p.399-402, 1985.

6. Srivastava R.A.K., Srivastava S.K., Mathur S.N. Curr.Sci. V.52, p.823-824, 1983.

7. Nishikawa D., Imada Y., et al. US Pat 4057469. C1. 195/51 G.

8. Ahmad S., Roy P.K., Basu S.K., Johri B.N. Indian J.Exp.Biol. V. 31, p.319-322, 1993.

9. Japan Pat. 80.111796. C1. С 12 Р 33/00.

10. Kutney J.P., Hemngton E.J., Spassov G. et al. WO 03/064674. 2003.

11. Ахрем А.А., Титов Ю.А. Стероиды и микроорганизмы, М.: Наука, 1972.

12. Lee C.Y., Liu W.H. Appl. Microbiol. Biotechnol. V.36, p.598-603, 1992.

13. Донова М.В., Довбня Д.В., Калиниченко А.Н. и др. Патент РФ 2039824. Кл. С 12 Р 33/16, С 07 J 1/00.

14. Gottschaldt В., Grosse H-H., Hoerhold С. et al. DD Pat. 301 740. C1. С 12 Р 33/16.

15. Войшвилло Н.Б., Андрюшина В.А., Савинова Т.С. и др. Прикл. биохим. микробиол. Т.39. С.173-179. 2003.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробиологическому получению андроста-1,4-диен-3,17-диона (АДД). Способ основан на способности штамма бактерий Mycobacterium neoaurum ВКПМ AC-1656 селективно отщеплять боковую цепь указанных стеринов и накапливать АДД в присутствии сорбентов продуктов трансформации. В качестве сорбентов используют синтетические полимерные смолы, получаемые сополимеризацией дивинилбензола и этилстирола. Сорбенты добавляют в культуральную жидкость в конце лаг-фазы, АДД образуется в зависимости от строения боковой цепи трансформируемых субстратов с выходом 66-76%. Изобретение может быть использовано в микробиологической, химической и фармацевтической промышленности. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ получения андроста-1,4-диен-3,17-диона из стеринов растительного и животного происхождения в присутствии сорбентов продуктов трансформации, отличающийся тем, что трансформацию стеринов осуществляют с помощью бактерии Mycobacterium neoaurum ВКПМ Ac-1656, а сорбенты продуктов трансформации добавляют к трансформационной смеси в поздней лаг-фазе роста культуры.2. Способ получения андроста-1,4-диен-3,17-диона по п.1, отличающийся тем, что в качестве сорбентов продуктов трансформации используют синтетические смолы, получаемые сополимеризацией дивинилбензола и этилстирола в присутствии модифицирующих добавок.