КИТАЙСКИЙ ЛЕКАРСТВЕННЫЙ СОСТАВ, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2011 года по МПК A61K36/88 A61K36/48 A61K36/258 A61K36/16 A61K9/08 A61K9/14 A61K9/16 A61K9/20 A61K9/48 A61K125/00 A61K127/00 A61K131/00 A61P9/10 A61P25/28 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Данное изобретение относится к традиционному китайскому лекарственному составу, более конкретно - к традиционному китайскому лекарственному составу, применяемому для лечения ишемической болезни мозга и старческого слабоумия. Компоненты, входящие в состав, могут представлять собой традиционные китайские лекарственные материалы, которые непосредственно измельчают в порошок, и/или экстракты, полученные путем экстрагирования китайских лекарственных материалов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ишемическую болезнь мозга принято делить на два типа: ишемическую болезнь мозга и геморрагическую ишемическую болезнь мозга, причем ишемическая болезнь мозга является более распространенной, а инфаркт головного мозга случается в 59.2-85% случаев.

Ишемическая болезнь мозга включает:

1) временное нарушение мозгового кровообращения (ВНМК, также известное как малый инсульт, или кратковременное нарушение мозгового кровообращения), которое представляет собой дисфункцию, вызываемую временным, ишемическим или очаговым повреждением ткани головного мозга, этиология которой связана с атеросклерозом;

2) тромбоз сосудов головного мозга, который является результатом свертывания крови в случае атеросклероза, различных артериитов, травмы или других физических факторов или местных повреждений сосудов головного мозга вследствие заболеваний крови;

3) церебральную эмболию, вызываемая эмболами, образующимися из-за множества заболеваний, которые попадают в кровь и блокируют сосуды головного мозга.

На данный момент доступны многочисленные лекарственные средства для лечения ишемической болезни мозга. Аллопатические лекарственные препараты, в основном, являются тромболитическими, антитромбоцитарными и антикоагулянтными лекарственными средствами, в то время как традиционные китайские лекарственные препараты, главным образом, включают Ниохие Ниауи (содействующие циркуляции крови и устраняющие застой крови), инъекции традиционных китайских лекарственных препаратов, представленные корнем salivae miltiorrhizae (шалфея краснекорневого) и сапонины panax notogiseng (женьшеня), Qingre Jiedu, Xingnao Kaiqiao (жаропонижающие и антитоксические вещества), инъекции традиционных китайских лекарственных препаратов, представленные Xing Nao Jing и Qing Kai Ling и Yiqi Huoxue Tongluo (пополняющие энергию Ки (Qi), стимулирующие циркуляцию крови, устраняющие закупорку в коллатералях), пероральные медикаменты, представленные Ren Shen Zai Zao Wan (восстанавливающие пилюли корня женьшеня) и Hua Тио Zai Zao Wan (восстанавливающие пилюли Hua Tuo (Хуато)). В клинической практике аллопатические лекарственные препараты применяют, в основном, в критических ситуациях, и они имеют очевидные неблагоприятные эффекты. Традиционные китайские лекарственные инъекции недоступны для длительного применения, и с китайскими лекарственными соединениями связано много проблем, таких как неопределенный эффект, неясные действующие компоненты и недостаток стабильных стандартов для контроля качества.

Слабоумие - это приобретенный синдром стойкого нарушения способности к мышлению, вызванного органическими патологическими изменениями головного мозга. Глобальное эпидемиологическое исследование, проведенное в 2005 году, показало, что слабоумием страдает около 24,000,000 пациентов. Годовой прирост составляет 4,600,000 пациентов, что несколько более одного пациента каждые 7 секунд, и это число удваивается каждые 20 лет. В Китае, по осторожным оценками, с 2001 по 2040 годы число больных будет возрастать на 300% ежегодно. Ожидается, что к 2040 году число пациентов, страдающих слабоумием, составит 81,000,000. Частота заболеваемости деменцией увеличивается с возрастом. Старческое слабоумие обычно подразделяют на:

- А - первичную дегенеративную деменцию, например болезнь Альцгеймера (БА);

- Б - сосудистую деменцию (СД);

- В - смешанную деменцию (БА совместно с МС);

- Г - другие типы деменции (болезнь Пика и деменция с тельцами Леви).

БА и МС являются двумя типами, имеющими наибольшее значение в старческом слабоумии, на их счет относят более 90% всех случаев слабоумия, при этом наиболее БА распространена среди пациентов старше 65 лет и является наиболее смертельной.

В клинической практике препаратами первого выбора для лечения старческого слабоумия, доступными на данный момент, являются ингибиторы холинэстеразы (такие, кактакрин, донепезил, ривастигмин, галантамин и т.п.). Китайская медицина охватывает аллопатические лечение всех типов: БА, МС или смешанного типа, включая все заболевания и симптомы, связанные со старческим слабоумием (dementia sinilis). Традиционные китайские лекарственные соединения, обычно применяемые для лечения старческого слабоумия, включают Ding Zhi Xiao Wan (корень женьшеня, pachyma cocos, acorus calamus (пахима кокосовая) и polygala teuofolia (истод тонколистый)), Tiao Xin Fang (назначаемый для регулирования мыслительной деятельности) (codonopsis pilosula (конодопсис мелковолосистый), pachyma cocos, солодка, acorus gramineus soland (амир злаковидный), polygala teuofolia, etc.), Bu Shen Fang (назначаемый для тонизирования почек) (asparagus cochinchinesis (спаржа), ophiopogon japonicus (офиопогон японский), сырой корень ремании (rehmanniae), обработанный корень ремании, плоды дерена (corni) и т.д.), Dang Gui Shao Yao San (корень дудника китайского (angelicae sinensis) и порошок китайского пиона (paeonia lactiflora)), Huang Lian Jie Du Tang (токсичные материалы коптиса (золотой нити, coptis chinensis), выводящие жидкость), Gou Teng San (ветки uncariae совместно с порошком uncis), Yi Gan San, Xiao Chaihu Tang (жидкость корешков володушки (bupleuru)) и Chai Hu Jia Long Gu Mu Li Tang (корень bupleuri, "драконья кость" и ракушка устрицы). Однако в клинической практике ингибиторы холинэстеразы могут лишь обеспечить улучшение при расстройстве когнитивной способности и облегчить симптомы, связанные с эмоциями, не оказывают значимого действия при фундаментальных патологических изменениях. Они могут только отсрочить (на 1-2 года), но не могут предотвратить прогрессирование заболевания, т.е. они могут лишь облегчить симптомы, но не могут вылечить заболевание. Длительное применение может даже привести к увеличению синтеза холинэстеразы. Такрин чаще приводит к тяжелой реакции со стороны желудочно-кишечного тракта и токсическим поражениям печени. С соединениями традиционной китайской медицины связаны многие проблемы, например: действующие компоненты не всегда установлены, они неудобны для длительного применения, отсутствуют установленные стандарты контроля качества.

Соответственно аллопатические лекарственные препараты и традиционные китайские препараты для лечения ишемической болезни мозга и старческого слабоумия, доступные в данный момент, имеют очевидные ограничения и недостатки. Остается потребность в разработке типа лекарственных препаратов для лечения ишемической болезни мозга и старческого слабоумия с четко выраженным и значительным эффектом, совершенной методикой получения и стабильным качеством лекарственного препарата.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на теории традиционной китайской медицины и обеспечено комбинацией опыта и клинической практики. Данное изобретение относится к традиционному китайскому лекарственному составу, который представляет собой препарат чистых традиционных китайских медикаментов, полученных в результате экстракции и очистки из четырех природных растений. Экспериментально доказано, что данное изобретение обладает четко выраженным терапевтическим действием и безопасно.

Задача настоящего изобретения - обеспечить традиционный китайский лекарственный состав, а также лекарственные препараты, входящие в указанный состав. Этот лекарственный препарат можно применять для лечения ишемической болезни мозга и старческого слабоумия.

Другая задача настоящего изобретения - обеспечить способ получения указанного состава, который позволяет получить китайский медицинский состав, обладающий значительным терапевтическим действием и стабильным качеством. Такой состав можно применять для лечения ишемической болезни мозга и старческого слабоумия.

Еще одна задача настоящего изобретения - обеспечить применение указанного китайского лекарственного состава в приготовлении лекарственных препаратов для лечения ишемической болезни мозга и старческого слабоумия.

Для решения указанных задач согласно настоящему изобретению предложен традиционный китайский лекарственный состав, включающий 1-10 весовых частей корня женьшеня, 1-10 весовых частей листьев гинкго, 0.05-0.5 весовых частей рылец шафрана и 5-10 весовых частей сои культурной (glycine max I.Merrill). Каждый из указанных компонентов: корень женьшеня, листья гинкго, рыльца шафрана и соя культурная (зрелые семена Glycine max (L.) Merr.) можно получить из необработанного материала или экстрагировать из тех же количеств традиционного китайского медицинского материала.

Китайский лекарственный состав согласно настоящему изобретению предназначен для систематического лечения ишемической болезни мозга и старческого слабоумия. Указанный состав представляет собой комбинацию традиционных китайских медикаментов и обеспечивает улучшение состояния иммунной системы пациента. Указанные китайские медицинские материалы могут быть легко получены в больших количествах. Они не имеют токсических или нежелательных эффектов и при рациональном комбинировании оказывают благоприятное действие.

Весовое соотношение компонентов в традиционном китайском лечебном составе предпочтительно составляет: 2-6 весовых частей корня женьшеня, 3-6 весовых частей листьев гинкго, 0.06-0.2 весовых частей рылец шафрана и 7-8 весовых частей сои культурной. Более предпочтительным весовым соотношением является: 4 весовых части корня женьшеня, 4.5 весовых части листьев гинкго, 0.1 весовой части рылец шафрана и 7.5 весовых частей сои культурной.

Количество полученного в результате экстракции продукта (выход) в указанном составе различно для разных традиционных китайских медикаментов. Таким образом, настоящее изобретение также обеспечивает китайский лекарственный состав, включающий 1-10 весовых частей экстракта корня женьшеня, 1-10 весовых частей экстракта листьев гинкго, 0.5-5 весовых частей экстракта рылец шафрана и 0.1-1 весовых частей экстракта сои культурной. Все указанные экстракты: корня женьшеня, листьев гинкго, рылец шафрана и сои культурной являются спиртовыми экстрактами.

Китайский лекарственный состав согласно настоящему изобретению имеет рациональный состав. Основным лекарственным компонентом (лекарством-монархом) в составе в соответствии с принципом традиционной китайской медицины является корень женьшеня. Болезнь Альцгеймера (БА), которую лечат составом согласно настоящему изобретению, характеризуется нехваткой в глубине и избытком на поверхности и относится, главным образом, к дефектам внутренних органов и расстройствам Ки (Ци, Qi) и крови. Дефекты внутренних органов и блокирование коллатералей головного мозга токсинами являются фундаментальными патологическими причинами и сохраняются на всем протяжении заболевания. Основной лекарственный компонент в составе - корень женьшеня (эффективными компонентами являются гинзенозиды) может в значительной степени подпитывать Ки почек и активировать интеллект путем успокоения психики. Вспомогательные лекарственные средства (лекарство-подчиненный) - листья гинкго (основными действующими компонентами являются флавоноиды гинкго и гинкголиды) и рыльца шафрана (главными действующими компонентами являются гликозиды шафрана) могут стимулировать циркуляцию крови и выводить токсичные вещества. Вспомогательное лекарственное средство - соя культурная (главными действующими компонентами являются изофлавоноиды сои и витамин Е) способно удалять эндогенные токсины. Состав может пополнять Qi и стимулировать циркуляцию крови, удалять токсичные вещества, очищать коллатерали и успокаивать психику, что обеспечивает повышение интеллекта как в глубинном, так и в поверхностном рассмотрении.

Состав согласно настоящему изобретению можно получить путем добавления и смешивания необработанных порошков каждого из указанных китайских лекарственных материалов или их экстрактов. Данный состав может быть эффективен при лечении ишемической болезни мозга, старческого слабоумия при условии, что включает в себя смеси с указанными весовыми соотношениями, которые входят в объем защиты настоящего изобретения. В предпочтительных вариантах реализации данного изобретения все компоненты: корень женьшеня, листья гинкго, рыльца шафрана и соя культурная - являются экстрактами в этаноле китайских лекарственных материалов.

В предпочтительных вариантах реализации компоненты и весовое соотношение указанных компонентов следующие: экстракт корня женьшеня:экстракт листьев гинкго:экстракт рылец шафрана:экстракт сои культурной=5:5:1:0.5.

Указанный экстракт корня женьшеня может быть приготовлен любым известным способом. Предпочтительный для настоящего изобретения способ экстракции следующий.

Этанол в низкой концентрации (50-70%, предпочтительно 60%) добавляют в 2-кратном (предпочтительно 8-кратном) количестве по отношению к корню женьшеня и проводят экстракцию в течение, по меньшей мере, одного (предпочтительно 3) часа, по меньшей мере, один раз (предпочтительно 2 раза). Жидкие экстракты объединяют и концентрируют до тех пор, пока относительная плотность не достигнет значения приблизительно 1.05 (50°С). Жидкий концентрат добавляют к, по меньшей мере, однократному (предпочтительно 2-кратному) объему воды и фильтруют. Фильтрат хроматографируют на низкополярной, макропористой адсорбционной смоле полистирольного типа (предпочтительно типа АВ-8). Смолу с лекарственными веществами элюируют дистиллированной водой, а затем 10% этанолом. Водный элюент и элюент с 10% этанолом сбрасывают. Смолу элюируют 70% этанолом до получения объема, в 2.5 раза превышающего объем колонки. Элюент с 70% этанола собирают. Таким образом можно получить экстракт корня женьшеня, содержащий гинзенозиды.

Согласно данному изобретению макропористую смолу с лекарственными веществами элюируют водой, 10% этанолом и 70% этанолом соответственно. Выбор двух указанных концентраций этанола и процедура элюирования могут гарантировать не только соответствие технологическим требованиям к общему содержанию компонентов традиционных китайских медикаментов, но также более высокие скорость обработки и выход эффективных компонентов.

Экстракт листьев гингко можно получить, следуя следующему способу экстракции.

Этанол низкой концентрации (60-80%, предпочтительно 60%) добавляют в 2-кратном (предпочтительно 8-кратном) количестве по отношению к сухим листьям гинкго и проводят экстракцию при 50-70°С (предпочтительно при 60°С) в течение, по меньшей мере, одного (предпочтительно 4) часа, по меньшей мере, один раз (предпочтительно три раза). Жидкие экстракты объединяют и концентрируют путем понижения давления до относительной плотности около 1.05 (50°С). В жидкий концентрат добавляют воду, охлаждают, отстаивают и фильтруют. Фильтрат хроматографируют для обогащения действующими компонентами на полярной, макропористой адсорбционной смоле полистирольного типа в протонированной форме (предпочтительно типа ADS-17). Смолу с лекарственными веществами элюируют водой, а затем 60% этанолом. Водный элюент сбрасывают, а элюент с этанолом собирают и концентрируют до исчезновения запаха спирта. Затем к сырым лекарственным препаратам добавляют двукратное количество воды и смесь нагревают до кипения. Выпадение осадка при комнатной температуре продолжается 24 часа. После фильтрования фильтрат хроматографируют на слабополярной макропористой адсорбционной смоле полистирольного типа (предпочтительно типа DM-130), чтобы удалить примеси. Смолу с лекарственными веществами элюируют водой, затем 15% и 60% этанолом. Водный элюент и элюент с 15% этанола сбрасывают, а элюент с 60% этанола собирают. После этого могут следовать концентрирование и сушка. В результате получают продукт экстракции листьев гинкго.

Методика экстракции, в частности методика очистки листьев гинкго согласно настоящему изобретению, преодолевает ограничение методики экстракции органическим растворителем для удаления примесей (главным образом, включающих фенольную кислоту гинкго, полисахарид, моносахарид и неорганические соли). Поскольку опасные примеси фенольных кислот гинкго имеют чрезвычайно низкую растворимость в воде и существуют, главным образом, в элюенте, содержащем 60% и более этанола, в то время как основные примеси полисахаридов и неорганических солей можно элюировать 15% этанолом, большинство примесей можно удалить при помощи процедуры двойной очистки на макропористой адсорбционной смоле, как показано в настоящем изобретении.

Кроме того, элюенты с 15-60% этанола можно собирать после элюирования 60% этанолом, что может гарантировать содержание фенольной кислоты менее 5 ppm. Соотношение основных эффективных компонентов в экстракте листьев гинкго, полученном в результате описанного выше отбора, т.е. отношение флавоноидов гинкго к гинколидам, составляет 24:25-10, предпочтительно 24:20-10, и еще более предпочтительно 24:15. Эксперимент по исследованию фармакодинамики подтверждает, что эффект экстракта листьев гинкго с этим соотношением значительно выше, чем эффект экстракта листьев гинкго EGb761 по существующему международному стандарту, отношение флаваноидов гинкго к гинколидам в котором составляет 24:6.

Указанный экстракт рылец шафрана можно получить любым известным способом. Согласно настоящему изобретению предпочтительным способом экстракции является следующий.

60-80% Этанол добавляют в, по меньшей мере, 5-кратном (предпочтительно 20-кратном) количестве по отношению к рыльцам шафрана и выполняют экстракцию при 60-90°С (предпочтительно при 90°С), в течение, по меньшей мере, одного (предпочтительно 2) часа, по меньшей мере, один раз (предпочтительно 3 раза). Жидкие экстракты объединяют и концентрируют до исчезновения запаха спирта. Жидкий концентрат разбавляют водой более чем в 1-кратном количестве по сравнению с сырыми лекарственными препаратами и фильтруют. Фильтрат хроматографируют на слабополярной макропористой адсорбционной смоле полистирольного типа (например, типа АВ-8). Смолу с лекарственными веществами элюируют водой, после чего постепенно увеличивают концентрацию этанола меньше 30% (например, для элюирования применяют 20% этанол, а затем - 30% этанол). Наконец, для элюирования смолы, содержащей лекарственные вещества, применяют 70% этанол. Водный элюент и элюент с концентрацией спирта меньше 30% сбрасывают, а элюент с 70% этанола собирают. В результате получают экстракт, содержащий гликозиды рылец шафрана.

Поскольку материалы дороги, предпосылкой для выбора методики получения должна быть гарантия высокого выхода. Несмотря на то, что концентрации 20% и 30% этанола, выбранные, согласно настоящему изобретению, для элюирования, различается всего на 10%, автором изобретения при проведении экспериментов было обнаружено, что потеря гликозидов рылец шафрана после элюирования 20% и 30% этанолом мала. А если для элюирования применять непосредственно 30% этанол или этанол в другой концентрации, то результатом будет большая потеря гликозидов рылец шафрана.

Этанольный экстракт сои культурной можно получить с применением следующего способа экстракции.

Материал сои культурной экстрагируют 85-90% этанолом и фильтруют. Остаток экстрагируют 60-80% (предпочтительно приблизительно 70%) этанолом и фильтруют. Экстракты в этаноле объединяют и концентрируют до исчезновения запаха спирта. Добавляют воду в количестве, равном по весу материалам, тщательно перемешивают и фильтруют. Фильтрат хроматографируют на слабополярной макропористой адсорбционной смоле полистирольного типа, например макропористой адсорбционной смоле типа АВ-8. В предпочтительном случае смолу с лекарственными веществами сначала элюируют водой, водный элюент сбрасывают. Затем проводят элюирование с использованием 50-65% этанола (предпочтительно 60%). Элюент собирают и получают часть А. Основными компонентами части А являются изофлавоноиды. Затем осуществляют элюирование с использованием 90-95% этанола. Элюент полностью собирают. Добавляют безводный этанол для осуществления этерификации. Снова добавляют воду для промывки, получают слоистый раствор. Давление раствора понижают 0.1 МПа для дегазации (желательно, для дегазации при 0.1 МПа использовать ротационный испаритель), после чего нижний слой (кислая вода) удаляют. Добавляют гидроксид натрия для алкоголиза (спиртового гидролиза). Затем добавляют воду для промывки. Нижний слой щелочной воды удаляют. Для дегазации давление над органической жидкостью из верхнего слоя снижают до 0.1 МПа и затем подвергают ее мембранной дистилляции, что позволяет удалить этиловый эфир жирной кислоты. Остаток подвергают молекулярной дистилляции (желательно, при давлении 0.133 Па, зазор между испарительной пластиной и охлаждающей пластиной 0.5 мм). Получают часть Б, компонентом которой является смешанный токоферол (витамин Е). Части Б и А смешивают и применяют в настоящем изобретении в качестве экстракта сои культурной.

Указанный способ экстракции для экстрактов корня женьшеня, листьев гинкго, рылец шафрана и сои культурной является способом получения основных компонентов для капсул китайского медицинского состава, которые применяли в Примере 1.

Установлено, что в экстракте сои культурной, полученном согласно настоящему изобретению, в основном присутствуют изофлавоноиды сои культурной и витамин Е, в весовом соотношении 4:2-0.5, предпочтительно около 4:1.

Настоящее изобретение также обеспечивает лекарственный препарат для лечения ишемической болезни мозга и старческого слабоумия, включающий указанный традиционный китайский лекарственный состав и фармацевтически приемлемые вспомогательные материалы. Вспомогательные материалы варьируются в зависимости от типа получения лекарственного препарата. Для лекарственного препарата эффективные компоненты в экстракте корня женьшеня (гинзенозиды) составляют не менее чем 13.75 мг/0.15 г из расчета на гинзенозид Re (С₄₈Н₈₂О₁₈). Действующие компоненты в экстракте листьев гингко (содержащем гингколиды) составляют не менее 2.75 мг/0.15 г из расчета на общее количество гингколида А (С₂₀Н₂₄О₉), гингколида В (С₂₀Н₂₄О₁₀), гингколида С (С₂₀Н₂₄О₁₁) и билобалида (C₁₅H₁₈O₈). Указанные 0.15 г - это вес полученных лекарственных препаратов.

Указанная форма препарата может быть любой формой препарата, предпочтительно медикаментом для перорального применения, включая любые доступные в фармакологии лекарственные формы медикаментов для перорального приема, предпочтительно гранулы, капсулы, таблетки, жидкости и сиропы для перорального приема. Для реализации изобретения предпочтительными являются гранулы и капсулы. Экспериментально подтверждено, что терапевтический эффект лекарственных препаратов согласно данному изобретению при лечении ишемической болезни мозга и старческого слабоумия значительно лучше, чем эффект коммерчески доступных лекарственных препаратов. Состав, описанный в настоящем изобретении, максимально уменьшает дозу, и, в то же время, сохраняет высокий эффект при низкой токсичности.

Автор выполнил дальнейшее исследование на основании этого изобретения для того, чтобы получить китайский лекарственный состав с более стабильными активными компонентами и большим содержанием эффективных компонентов. Он обнаружил, что отношение флавоноидов гинкго к гинкголидам в экстракте листьев гинкго EGb761 - согласно международному стандарту - составляет 24:6, однако эксперименты по фармакодинамике, проведенные изобретателем, показали, что наилучшее отношение флавоноидов гинкго к гинкголидам в экстракте листьев гинкго для лечения ишемической болезни мозга и старческого слабоумия составляет 24:15. На основании этого результата провели общий анализ и анализ по ортогональному плану с использованием фактической погрешности для экстракта корня женьшеня, экстракта листьев гинкго, экстракта рылец шафрана и экстракта сои культурной. Количественные показатели поведения животных в эксперименте исследовали с использованием водяного лабиринта Морриса в качестве средства для определения уровня памяти у мышей с индуцированным D-галактозой одряхлением головного мозга и нормальных мышей. Тщательный анализ результатов показывал, что терапевтический эффект состава, состоящего из четырех компонентов, превосходит эффект любого отдельно взятого компонента и что существуют взаимодействия между экстрактом сои культурной и экстрактами каждого из корня женьшеня и листьев гинкго в составе из трех компонентов (корень женьшеня, листья гинкго и рыльца шафрана), показывающие, что соя культурная или ее экстракт являются необходимым для приготовления состава для лечения старческого слабоумия.

Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения всех указанных типов медикаментов из лекарственных препаратов для перорального приема, включая:

- гранулы: декстрин или другие клеящие вещества добавляют в смеси заданного состава, хорошо перемешивают, сушат при 60-80°С и измельчают. К полученному продукту добавляют корректор вкуса (например, стевиозин) и перемешивают в достаточной степени, затем гранулируют и сушат. В результате получают гранулы продукта;

- таблетки: декстрин или другие клеящие вещества добавляют в смеси заданного состава, перемешивают до гомогенного состояния, сушат при 60-80°С и измельчают. К полученному продукту добавляют подходящее количество связующего вещества (например, крахмала) и разрыхляющего агента (например, натриевой соли карбоксиметилкрахмала), затем смесь равномерно перемешивают, гранулируют и сушат. После этого добавляют подходящее количество смазывающих материалов (например, стеарата магния) и разрыхляющего агента (натриевой соли карбоксиметилкрахмала), затем смесь равномерно перемешивают и прессуют в таблетки. В случае необходимости можно применять пленочное покрытие. В результате получают таблетки;

- капсулы: декстрин или другие клеящие вещества добавляют в смеси заданного состава, равномерно перемешивают, сушат и измельчают. К полученному продукту добавляют корректор вкуса (например, стевиозин) и разбавитель (например, крахмал), смесь равномерно перемешивают. Гранулы высушивают и засыпают в капсулы;

- пилюли: декстрин или другие клеящие вещества добавляют в смеси заданного состава, равномерно перемешивают, сушат и измельчают. К полученному продукту добавляют мед, воду, пчелиный воск, рисовую муку или рисовую пасту. Пилюли продукта можно получить с применением рутинного способа для приготовления других пилюль.

Состав - согласно настоящему изобретению - также можно изготовить в виде медовой пилюли, водно-медовой пилюли, смоченной пилюли, пилюли с пастообразными веществами, пилюли с воском и концентрированной пилюли. Технологические процедуры являются рутинными, но технологические условия могут меняться в зависимости от изменения характеристик китайских лекарственных материалов, что хорошо известно специалистам в данной области.

Процедуры получения лекарственных препаратов - согласно настоящему изобретению - могут варьироваться для различных продуктов. Однако они представляют собой хорошо известную обычную технологию получения, которую можно не приводить в настоящем описании.

В указанных предпочтительных схемах реализации условия способа (лучшие параметры процесса экстракции) основаны на скорости образования пасты и содержании действующих компонентов, и их выбирают на основании трехфакторного - трехуровневого независимых экспериментов.

Все использованные для получения состава - согласно настоящему изобретению - традиционные китайские лекарственные материалы приведены в Фармакопее 2005, все индексы даны согласно правилами фармакопеи относительно идентификации. Образцы трех серий тестируют на соли мышьяка и тяжелых металлов по правилам Китайской Фармакопеи 2005, Том первый, приложения IXE и IXF, и полученные результаты лежат в допустимых диапазонах.

Гигиенические тесты лекарственных препаратов согласно настоящему изобретению подтвердили, что образцы соответствуют фармакопейному гигиеническому стандарту.

Данное исследование также подтверждает, что китайский лекарственный состав можно применять для получения лекарственного препарата для лечения ишемической болезни мозга и старческого слабоумия.

Данное исследование показывает, что данный лекарственный препарат может иметь различные функциональные характеристики по сравнению с применяемыми в настоящий момент в клинике ИАХЭ (ингибитором ацетилхолинэстеразы) и EGb761 (формальное название: таблетки экстракта листьев гинкго, т.е. стандартный экстракт листьев гинкго), а также более эффективен. Данный лекарственный препарат будет более успешным на рынке. Механизм может быть следующим: данный лекарственный препарат оказывает действие на множественные мишени патологических изменений при ишемической болезни мозга и старческом слабоумии, включая лежащий в основе БА, т.е. нарушений экспрессии гена белка-предшественника β-амилоида (БПА), что обеспечивает экспериментальную основу для создания состава эффективных компонентов традиционного китайского лекарственных материалов для лечения ишемической болезни мозга и старческого слабоумия.

Исследование фармакодинамики.

Тестируемые лекарственные препараты: капсулы лекарственных препаратов, которые применяли в Примере 1 (далее упоминаемые как лекарственный препарат согласно данному изобретению).

Контрольные лекарственные препараты: таблетки Хуперзина А (формальное название: Huperzine Tablets, Henan Joyline & Joysun Pharmaceutical Stock Co., Ltd.. Главные компоненты: Huperzine A C₁₅Hi₈N₂O); Танакан (формальное название: таблетки экстракта листьев гинкго, Beaufour Ipsen Industrie S.A.S., France); Wei Nao Kang (полученный в нашей лаборатории, содержащий экстракты корня женьшеня, листьев гинкго и рылец шафрана).

1 Поведенческие эксперименты

1.1 Эксперимент со спуском по ступенькам

1.1.1.1 Воздействие на модельных мышей с нарушением памяти, индуцированным гидробромидом скополамина

1.1.1.2 Данный эксперимент выполняли согласно Nervous System Drugs Section 5 в Methodology of Pharmaceutical Experiment (XU Shu-yun, et al.). Число ошибок у мышей в модельной группе за 5 минут значительно больше, чем в контрольной группе (Р<0.05). Через 15 дней после введения лекарственного препарата число ошибок у мышей в группе положительного контроля, получавших Хуперзин А, и группе, получавшей Танакан, значительно ниже, чем в модельной группе (Р<0.05), и латентный период в модельной группе был значительно дольше (Р<0.001). Число ошибок у мышей в группах, получавших средние и высокие дозы лекарственного препарата согласно настоящему изобретению, значительно ниже (Р<0.05~0.01), в модельной группе латентный период значительно более длительный (Р<0.05). Результаты представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Воздействие на модельных мышей с нарушением памяти, индуцированным гидробромидом скополамина Группа Дозировка (мг/кг) n Латентный период (с) Число ошибок Контроль   10 279.2±65.8 0.3±0.9 Модельная   13 192.81±107.3 1.2±1.3# Хуперзин 0.08 12 271.8±54.6*** 0.6±0.9* Танакан 30 12 233.4±71.5 0.7±0.7* Препарат согласно данному изобретению 11.5 12 209.8±96.3 0.9±1.0 Препарат согласно данному изобретению 23 12 226.3±111.3 0.6±0.7** Препарат согласно данному изобретению 46 12 248.5±88.8* 0.5±0.7** Комментарий: в сравнении с контрольной группой: #Р<0.05; в сравнении с модельной группой: *Р<0.05, **Р<0.01, ***Р<0.001.

1.2 Эксперимент с пропуском ступеньки

Данный эксперимент выполняли согласно Nervous System Drugs Section 5 в Methodology of Pharmaceutical Experiment (XU Shu-yun, et al.). Число ошибок у мышей в модельной группе за 5 минут значительно больше, чем в контрольной группе (Р<0.05). Через 15 дней после введения лекарственного препарата, по сравнению с контрольной группой, у мышей из группы, получавшей Танакан, наблюдали более длительный латентный период и меньше ошибок. Число ошибок у мышей в группах, получавших средние и высокие дозы лекарственного препарата, согласно настоящему изобретению значительно снижается (Р<0.05). Результаты представлены в Таблице 2.

Таблица 2. Воздействие на модельных мышей, имеющих возвратное нарушение памяти, индуцированное этанолом Группа Дозировка (мг/кг) N Латентный период (с) Число ошибок Контроль   10 234.3±130.3 0.4±0.9 Модель   10 204.9±102.4 2.1±2.0# Хуперзин А 0.08 10 214.1±127.8 1.0±1.3 Танакан 30 10 255.8±69.5* 0.4±0.5* Препарат согласно данному изобретению 11.5 10 221.5±92.6 1.3±1.1 Препарат согласно данному изобретению 23 10 212.2±128.2 0.7±0.7* Препарат согласно данному изобретению 46 10 253.7±65.2 0.6±0.7* Комментарий: в сравнении с контрольной группой: #Р<0.05; в сравнении с модельной группой: *Р<0.05.

1.3 Эксперимент с водным лабиринтом Морриса

Данный эксперимент выполняли, следуя методу, описанному в Morris RGM, Garrud Р, Rawlins JNP et al. Place navigation impaired in rats with hippocampus lesions. Nature; 297: 681~3.

1.3.1 Влияние на пространственное научение и память модельных крыс с нарушениями, индуцированными токсичностью белка-предшественника β-амилоида (Аβ)

Через четыре недели после двусторонней инъекции Аβ1-40 в область СА1 гиппокампа продолжительность плавания и маршрут в водном лабиринте Морриса у крыс модельной группы была больше, со значительной разницей, чем в группе, подвергнутой имитации операции (Р<0.05). Стратегия поиска, в основном, заключается в передвижении по границе или случайном передвижении. Через четыре недели после двусторонней инъекции А1-40 в область СА1 гиппокампа продолжительность времени плавания и маршрут в водном лабиринте Морриса в группе, получавшей высокие и средние дозы лекарственного препарата согласно настоящему изобретению, гораздо короче, чем у модельной группы (Р<0.05), стратегия поиска заключается, в основном, в движении по таксису. Результаты представлены в Таблице 3.

Таблица 3. Влияние на пространственное научение и память у модельных крыс с нарушениями, вызванными токсичностью белка-предшественника β-амилоида (Аβ) Группа Дозирование (мг/кг) n Продолжительность Длина маршрута Имитация операции   11 9.3±5.1 268.9±186.9 Модель   11 23.0±9.1# 696.3±227.3## Хуперзин А 0.08 11 16.3±10.6 436.7±284.4* Препарат согласно данному изобретению 11.5 11 11.6±10.0* 335.7±413.6* Препарат согласно данному изобретению 23 11 11.3±5.6* 301.1±179.1* Препарат согласно данному изобретению 46 11 10.1±7.0* 280.5±250.6* Комментарий: в сравнении с группой с имитацией операции #Р<0.05, ##Р<0.01; в сравнении с модельной группой *Р<0.05.

1.3.2 Влияние на пространственное научение и память крыс VD, перенесших двустороннюю продолжительную перевязку (легирование) сонной артерии (2VO)

Через один месяц после того, как крысам перевязывали общую сонную артерию с двух сторон, у них не наблюдали существенных отличий от группы, которую подвергали имитации операции, хотя наблюдали тенденцию к нарушению научения и памяти. Через два и три месяца после перевязывания время прохождения лабиринта у крыс модельной группы было значительно большим, чем у группы, в которой операцию имитировали (Р<0.01), что указывает на то, что способность к научению и запоминанию крыс будет значительно снижаться с течением времени в условиях ишемии. Через один или два месяца после введения лекарственного препарата способность к научению и запоминанию у крыс во всех трех группах, которые получали дозы лекарственного препарата согласно настоящему изобретению, значительно возросла, время прохождения лабиринта значительно сократилось по сравнению с модельной группой (Р<0.05~0.01); Подобные эффекты наблюдали в группах, получавших Wei Nao Kang и Хуперзин А (Р<0.05~0.01). Через два месяца после введения лекарственного препарата способность к научению и запоминанию у крыс в группе, получавшей Танакан, значительно увеличилась (Р<0.05) по сравнению с Nao Wei Kang. Через один или два месяца после введения лекарственных препаратов согласно настоящему изобретению способность к научению и запоминанию крыс во всех группах, получавших высокие и средние дозы, значительно увеличилась, время прохождения лабиринта значительно сократилось по сравнению с модельной группой (Р<0.05~0.01). Результаты представлены в Таблице 4.

Таблица 4. Влияние лекарственного препарата данного изобретения на время прохождения лабиринта для крыс 2VO Группа Дозировка (мг/кг) N   Время (с)   1 месяц после перевязки 2 месяц после перевязки 3 месяца после перевязки Имитация операции   10 36.8±23.1 10.1±5.3 8.2±4.6 Модель   10 60.3±26.1 55.2±26.1## 45.1±23.2## Хуперзин А 0.06 10 61.3±25.2 29.1±18.5* 10.8±5.6** Танакан 20 10 59.7±21.8 50.2±29.1 22.2±10.2* Wei Nao Kang 15 10 60.9±27.5 34.3±16.9* 23.4±12.6 Препарат согласно данному изобретению 11.5 10 61.2±23.5 26.6±10.2** 15.6±7.9** Препарат согласно данному изобретению 23 10 60.5±26.7 19.5±12.6**^Δ 13.2±6.6**^Δ Препарат согласно данному изобретению 46 10 60.8±24.0 17.1±11.4** ^Δ 7.6±5.5**ΔΔ Комментарий: в сравнении с группой с имитирующей операцией: ## Р<0.01, в сравнении с модельной группой: *Р<0.05, **Р<0.01; в сравнении с группой Nao Wei Kang: ΔР<0.05, ΔΔР<0.01.

1.4 Обсуждение и краткое резюме

(1) При исследовании настоящего изобретения также проводили эксперименты по фармакодинамике с повреждениями, индуцированными скополамином, хлорпромазином, резерпином или нитритом натрия. После указанных химических повреждений проводили эксперимент со спуском по ступенькам на мышах, причем оценивали задержку избегания и число ошибок за 5 минут. Через 15 дней после внутрижелудочного введения лекарственных препаратов согласно настоящему изобретению оба показателя улучшаются в различной степени, указывая на то, что лекарственный препарат согласно данному изобретению может обеспечить улучшения в модели приобретенного и стабильного нарушения памяти на мышах.

(2) После повреждения, вызванного этанолом, проводили эксперимент с пропусканием ступеньки на мышах, причем оценивали задержку избегания и число ошибок за 5 минут. Через 15 дней после внутрижелудочного введения лекарственных препаратов согласно настоящему изобретению наблюдали улучшение обоих показателей в разной степени, что свидетельствует о том, что лекарственный препарат согласно настоящему изобретению может обеспечить улучшение при нарушении воспроизведения у модельных мышей.

(3) В этом исследовании в качестве модели БА использовали крыс с индуцированным D-галактозой старением мозга, крыс с нарушениями, индуцированными Аβ, крыс с нарушениями в результате естественного старения и трансгенных мышей с геном APР, а в качестве модели СД использовали крыс 2VO. В качестве основных показателей выбрали продолжительность времени плавания и маршрут в течение 3 минут, а исследование стратегии и т.п. взяли в качестве вспомогательных показателей. Наблюдали влияние лекарственных препаратов на количественные показатели плавания мышей. Результаты показывают, что количественные показатели плавания крыс или мышей в различной степени увеличиваются после внутрижелудочного введения лекарственных препаратов согласно настоящему изобретению, что свидетельствует о том, что данные лекарственные препараты могут увеличить способности к научению и память у животных в моделях БА и СД. Далее, лекарственные препараты согласно данному изобретению могут значительно улучшить показатели прохождения водяного лабиринта Морриса у 2VO крыс, по сравнению с Wei Nao Kang, что указывает на улучшение терапевтического эффекта лекарственного препарата с добавлением сои культурной согласно настоящему изобретению.

2 Определение нейротрансмиттера

Эксперимент выполняли согласно методу, описанному в Liu JX, Cong WH, Xu L, Wang JN., Effect of combination of extracts of radix ginseng and ginkgo biloba on acetylcholine in amyloid beta-peptide-treated rats determined by an improved HPLC. Acta Pharmacol Sin. 2004; 25: 1118-23.

2.1 Ацетилхолин (Ach)

2.1.1 Влияние на содержание Ach во всем мозге модельных крыс с нарушениями, индуцированными токсичностью Аβ

Через четыре недели после двусторонней инъекции Aβ_1-40 в область СА1 билатерального гиппокампа содержание Ach во всем мозге крыс в модельной группе значительно снизилось по сравнению с группой, в которой операцию имитировали (Р<0.01). Через четыре недели после введения лекарства содержание Ach в стволе головного мозга крыс во всех группах, получавших лекарственный препарат согласно настоящему изобретению, значительно увеличилось по сравнению с крысами модельной группы (Р<0.05~0.01). Существует тенденция к увеличению уровня Ach во всем мозге крыс в группе положительного контроля, получавшей Хуперзин А, но без значимого различия. Результаты приведены в Таблице 5.

Таблица 5 Влияние на содержание Ach во всем мозге модельных крыс с нарушениями, вызванными токсичностью Аβ Группа Дозировка (мг/кг) n Содержание Ach (µг/л) Имитация операции   6 242.8±39.7 Модель   6 155.7±15.5## Хуперзин А 0.08 6 180.0±23.5 Препарат согласно данному изобретению 11.5 6 211.2±39.3* Препарат согласно данному изобретению 23 6 227.8±54.1* Препарат согласно данному изобретению 46 6 235.4±25.4** Примечание: по сравнению с группой с имитацией операции ##Р<0.01; по сравнению с модельной группой *Р<0.05, **Р<0.01.

2.1.2 Влияние на Ach во всем мозге крыс с СД, индуцированной двусторонней продолжительной перевязкой сонной артерии

Содержание Ach в мозге крыс модельной группы значительно уменьшается через 3 месяца после 2VO по сравнению с группой, в которой операцию имитировали (Р<0.01). Через два месяца после введения лекарственного препарата содержание Ach в крысах всех групп, получавших лекарственный препарат согласно настоящему изобретению, значительно возрастает (Р<0.05~0.01); Wei Nao Kang, Хуперзин А и Танакан оказывают такое же действие (Р<0.05~0.01). По сравнению с группой, получавшей Танакан, содержание Ach у крыс в группах, получавших высокие и средние дозы лекарственного препарата согласно настоящему изобретению, значительно увеличилось (Р<0.05~0.01). Результаты представлены в Таблице 6.

Таблица 6 Влияние лекарственного препарата согласно настоящему изобретению на содержание Ach в мозге 2VO крыс Группа Дозировка (мг/кг) n Содержание Ach (µг/л) Имитация операции   10 284.4±51.2 Модель   10 146.4±13.2## Хуперзин А 0.06 10 221.4±41.9** Танакан 20 10 182.4±40.3* Wei Nao Kang 15 10 173.2±23.6** Препарат согласно данному изобретению 11.5 10 183.3±22.7** Препарат согласно данному изобретению 23 10 201.2±31.2**^Δ Препарат согласно данному изобретению 46 10 218.1±34.9**^ΔΔ Примечание: по сравнению с группой с имитацией операции: ^# #Р<0.01; по сравнению с модельной группой: *Р<0.05, **Р<0.01; по сравнению с Wei Nao Kang: ^ΔР<0.05, ^ΔΔР<0.01.

2.1 Обсуждение и краткое резюме

После внутрижелудочного введения лекарственного препарата согласно данному изобретению содержание ACh во всем головном мозге или гиппокампе животных значительно увеличивается, указывая на то, что лекарственный препарат согласно данному изобретению может регулировать высвобождение и снижение Ach в описанных моделях БА и СД на животных, повышать уровня ACh в центральной нервной системе и улучшать состояние центральной холинергической системы. Более того, содержание ACh в центральной нервной системе у 2VO крыс, получающих лекарственный препарат согласно настоящему изобретению, значительно повышается, что указывает на лучший эффект лекарственного препарата с добавлением сои культурной согласно настоящему изобретению.

2.2 Нейротрансмиттеры - моноамины и их метаболиты

2.2.1 Влияние на содержание нейротрансмиттеров-моноаминов и их метаболитов во всем мозге модельной крысы с повреждениями, индуцированными токсичностью Аβ

По сравнению с группой, в которой операцию имитировали, содержание 5-гидрокситриптамина (5-НТ) во всем мозге крыс модельной группы значительно снизилось (Р<0.05). Имеет место тенденция к снижению уровня допамина (DA) и норэпинефрина (NE). Не наблюдали значительных изменений уровней DA и 5-НТ в мозге животных всех групп, получавших препарат согласно настоящему изобретению (Р>0.05), по сравнению с модельной группой, и имела место тенденция к снижению уровня гомоваллиновой кислоты (HVA) и 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-HIAA), в частности к значительному снижению HVA в группе, получавшей низкие дозы лекарственного препарата согласно настоящему изобретению (Р<0.005). Результаты представлены в Таблице 7.

Таблица 7. Влияние на содержание моноаминных нейротрансмиттеров и их метаболитов во всем мозге модельной крысы, имеющей повреждения в результате Аβ-токсичности Unit: µг/л Группа Дозировка (мг/кг) n NE DOPAC DA 5-HIAA HVA 5-НТ Имитация операции   9 105.7±16.5 17.2±3.6 160.4±36.5 39.7±11.4 16.3±3.3 59.3±9.0 Модель   6 88.6±19.5 13.7±2.0 139.4±14.2 35.6±113.2 13.5±4.2 42.6±7.6# Хуперазин А 0.08 6 75.9±11.3 13.4±1.3 136.2±8.5 27.3±3.1 15.4±9.4 41.7±5.9 Препарат согласно данному изобретению 11.5 6 85.6±5.8 12.6±2.0 137.3±12.9 29.3±6.2 9.4±1.5* 39.9±8.4 Препарат согласно данному изобретению 23 6 82.2±12.5 14.1±2.4 135.7±15.6 27.4±3.6 13.1±4.6 42.7±8.8 Препарат согласно данному изобретению 46 6 84.7±8.4 13.8±1.9 137.3±14.4 26.1±2.0 12.4±2.5 37.5±10.8 Примечание: по сравнению с группой: с имитацией операции: #Р<0.05 по сравнению с модельной группой: *Р<0.05.

2.2.2 Обсуждение и краткое резюме

(1) Низкий уровень метаболизма нейротрансмиттеров-моноаминов в мозге крыс с нарушениями, индуцированными токсичностью Аβ, аналогичен патологическим возрастными изменениями у пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, что указывает на то, что нарушения памяти, вызванные повреждением в результате токсичности Аβ, могут быть связаны с изменениями метаболизма нейротрансмиттеров DA и 5-НТ. Лекарственный препарат согласно настоящему изобретению, возможно, замедляет расщепление DA и 5-НТ и обеспечивает относительное повышение уровня DA и 5-НТ в центральной нервной системе, что приводит к улучшению активности моноаминоэргической системы головного мозга.

(2) При исследовании настоящего изобретения проводили аналогичный эксперимент по исследованию фармакодинамики на модели естественного ослабления когнитивной способности. Было обнаружено, что уровень DA, HVA, 5-НТ и 5-HIAA в гиппокампе всех модельных крыс значительно снижается, имеет место тенденция к снижению для NE и дигдроксифениуксусной кислоты (DOPAC), что указывает на низкую активность метаболизма нейротрансмиттеров-моноаминов, что согласуется с активностью NE, DA, 5-НТ центральной нервной системы у пациентов с болезнью Альцгеймера и пожилых людей. Через 12 недель после введения лекарственного препарата согласно настоящему изобретению отмечали тенденцию к повышению уровня DA, DOPAC, 5-НТ и 5-HIAA и значительное повышение уровней DA и 5-НТ в гиппокампе группы, получавшей высокие дозы препарата согласно настоящему изобретению, что указывает на то, что данный препарат способен улучшать активность систем DA и 5-НТ, возможно, путем ингибирования захвата DA и 5-НТ. Также было обнаружено, что механизм действия лекарственного препарата согласно настоящему изобретению, повышающий уровень DA и 5-НТ, может отличаться от механизма действия Хуперзина А и Табакана. Хуперзин, вероятно, ингибирует метаболизм DA в нейронах и разрушение 5-НТ, а Танакан, возможно, ингибирует метаболизм DA в нейронах и захват 5-НТ.

(3) При исследовании настоящего изобретения провели аналогичный эксперимент по исследованию фармакодинамики для трансгенных мышей с АРР. В отличие от изменения уровня нейротрансмиттеров-моноаминов в мозге двух описанных выше моделей БА, уровень 5-НТ и 5-HIAA во всем мозге АРР трансгенных мышей значительно повышается, и имеет место тенденция к повышению для NE и AD, что указывает на то, что нарушенная экспрессия гена АРР, возможно, влияет на метаболизм нейротрансмиттеров-моноаминов в центральной нервной системе по механизму, отличному от других моделей животных, что согласуется с литературными данными. 5-НТ и 5-HIAA в группе положительного контроля, получавшей Хуперзин А, и в группе, получавшей высокие дозы лекарственного соединения согласно настоящему изобретению, снижается в различной степени, что указывает на то, что оба препарата, возможно, регулируют активность данной системы путем регулирования анормального метаболизма 5-НТ в ЦНС.

Приведенные результаты показывают, что лекарственный препарат согласно настоящему изобретению может регулировать уровень NE, DA и 5-НТ центральной нервной системы и активировать системы NE, DA и 5-НТ. С учетом того, что взаимодействие (зависимость и взаимное усиление) между холинэргической и моноаминэргической системами участвует в процессах познания (когнитивных), эффект улучшения памяти научения лекарственным препаратом согласно настоящему изобретению, возможно, происходит за счет его вмешательства в захват и разрушение нейротрансмиттеров-моноаминов.

3 Обнаружение других биохимических индикаторов

Обнаружение выполняли, следуя инструкции к набору реагентов.

3.1 Ацетилхолинэстераза (AChE)

3.1.1 Влияние на активность AChE во всем мозге модельных крыс с нарушением когнитивной способности, вызванным естественным старением

Активность AChE во всем головном мозге крыс в контрольной группе старых животных значительно ниже, чем в контрольной группе молодых животных (Р<0.05). Через 12 недель после введения лекарственного препарата активность AchE во всем мозге крыс в группе положительного контроля, получавшей Хуперзин А, группе, получавшей Танакан и группе получавшей лекарственный препарат согласно настоящему изобретению, была значимо выше, чем у крыс в контрольной группе старых животных (Р<0.05~0.01). Результаты представлены в Таблице 8.

Таблица 8. Влияние на активность AChE во всем мозге модельных крыс нарушением когнитивной способности, вызванным естественным старением Группа Дозировка (мг/кг) n Активность AChE (Ед/мг белка) Молодая контрольная   7 1.31±0.26 Старая контрольная   15 0.88±0.28# Хуперзин А 0.08 7 1.18±0.19* Танакан 30 7 1.19±0.22* Препарат согласно данному изобретению 11.5 7 1.49±0.47* Препарат согласно данному изобретению 23 7 1.51±0.16** Препарат согласно данному изобретению 46 7 1.31±0.17** Примечание: по сравнению с контрольной группой молодых животных: #Р<0.05; по сравнению с контрольной группой старых животных: *Р<0.05, **Р<0.01.

3.2 Малоновый диальдегид (MDA)

3.2.1 Влияние на содержание MDA во всем головном мозге модельных крыс с нарушением когнитивной способности, вызванной естественным старением

Содержание MDA во всем головном мозге у крыс контрольной группы старых животных существенно выше, чем в контрольной группе молодых животных (Р<0.05). Через 12 недель после введения лекарственного препарата содержание MDA во всем головном мозге у крыс всех групп, получавших лекарственны препарат согласно настоящему изобретению, существенно снижается (Р<0.05). Имела место тенденция к снижению содержания MDA в мозге крыс в группе положительного контроля, получавшей Хуперзин А, и в группе, получавшей Танакан, однако без значимого различия различий (Р>0.05). Результаты представлены в Таблице 9.

Таблица 9 Влияние на содержание MDA во всем головном мозге модельных крыс с нарушением когнитивной способности, вызванной естественным старением
Группа Дозировка (мг/кг) n Содержание MDA (нмоль/мг белка) Молодая контрольная   7 2.97±0.20 Старая контрольная   7 4.46±1.41# Хуперзин А 0.08 7 3.50±0.43 Танакан 30 7 4.35±0.66 Препарат согласно данному изобретению 11.5 7 3.16±0.61* Препарат согласно данному изобретению 23 7 3.08±0.73* Препарат согласно данному изобретению 46 7 3.17±0.25* Примечание: по сравнению с контрольной группой молодых животных: #Р<0.05; по сравнению с контрольной группой старых животных: *Р<0.05.

3.3 Супероксиддисмутаза (SOD)

3.3.1 Влияние на активность SOD во всем головном мозге модельных крыс с нарушением когнитивной способности, вызванной естественным старением

Содержание SOD во всем головном мозге у крыс контрольной группы старых животных существенно ниже, чем в контрольной группе молодых животных (Р<0.05). Через 12 недель после введения лекарственного препарата активность SOD во всем головном мозге у крыс в группе положительного контроля, получавшей Хуперзина А, в группе, получавшей Танакан, и во всех группах, получавших лекарственный препарат согласно настоящему изобретению, была существенно выше, чем в контрольной группе старых животных (Р<0.05). Результаты представлены в Таблице 10.

Таблица 10. Влияние на активность SOD во всем головном мозге модельных крыс с нарушением когнитивной способности, вызванной естественным старением Группа Дозировка (мг/кг) n Активность SOD (NU/мг белка) Молодая контрольная   7 44.34±7.66 Старая контрольная   7 32.22±12.77# Хуперзин А 0.08 7 43.68±12.55* Танакан 30 7 40.18±4.74* Препарат согласно данному изобретению 11.5 7 46.84±3.47* Препарат согласно данному изобретению 23 7 47.94±6.07* Препарат согласно данному изобретению 46 7 45.16±5.83* Примечание: по сравнению с контрольной группой молодых животных: #Р<0.05; по сравнению с контрольной группой старых животных: *Р<0.05.

3.4 Влияние на активность Na⁺-К⁺-АТФазы во всем головном мозге у крыс с нарушениями, индуцированными токсичностью Аβ

Через четыре недели после двусторонней инъекции Aβ_1-40 в область СА1 гиппокампа активность Na⁺-К⁺-ATФазы во всем головном мозге крыс была значительно существенно снизилась по сравнению с контрольной группой (Р<0.05); через четыре недели после введения лекарственного препарата, активность Na⁺-К⁺-ATФазы в мозге крыс группы, получавшей Хуперазин А, группы, получавшей Танакан, и во всех группах, получавших лекарственный препарат согласно настоящему изобретению, значительно повысилась по сравнению с крысами модельной группы (Р<0.05-0.01). Результаты представлены в Таблице 11.

Таблица 11 Влияние на активность Na⁺-K⁺-ATФазы во всем головном мозге у крыс с нарушениями, возникшими в результате Аβ-токсикации Группа Дозировка (мг/кг) n Активность Na⁺-К⁺-АТФазы (мкмоль Pi/мг белка/ч) Имитация операции   7 0.205±0.037 Модель   7 0.161±0.013# Хуперазин А 0.08 7 0.207±0.025* Препарат согласно данному изобретению 11.5 7 0.218±0.018** Препарат согласно данному изобретению 23 7 0.195±0.012** Препарат согласно данному изобретению 46 7 0.193±0.032* Примечание: по сравнению с группой с имитацией операции: #Р<0.05; по сравнению с модельной группой: *Р<0.05 **Р<0.01.

3.5 Обсуждение и краткое резюме

3.5.1 Влияние на активность AChE

(1) Активность AChE во всем головном мозге крыс с нарушением когнитивной способности вследствие естественного старения значительно снижается, также как при старении и БА (болезнью Альцгеймера). Лекарственный препарат согласно настоящему изобретению способен значительно повышать активность указанной AChE, регулировать анормальный уровень метаболизма и улучшать функцию центральной холинэргической нервной системы, а также нарушения памяти научения, возникшее в результате старения или БА.

(2) Такие же эксперименты проводили для крыс с индуцированным D-галактозой старением головного мозга и трансгенных мышей с геном АРР. Активность AChE во всем головном мозге двух модельных животных во всех случаях значительно повышалась, а слишком высокая активность ускоряет разложение ACh. Лекарственный препарат согласно настоящему способен значительно ингибировать активность AChE во всем мозге животных обеих моделей и может замедлить расщепление ACh, что увеличит уровень ACh и улучшит память и способность к научению.

3.5.2 Влияние на содержание MDAn активность SOD

После введения лекарства крысам с нарушением когнитивной способности вследствие естественного старения активность SOD увеличивается во всем головном мозге, в то время как уровень MDA понижается. Это свидетельствует о способности лекарственного препарата согласно настоящему изобретению улучшать антиоксидантную функцию и устранять свободные радикалы у старых животных, препятствовать старению и улучшать способность к запоминанию.

3.5.3 Влияние на активность Na⁺-K⁺-ATP во всем головном мозге крыс с повреждением, вызванным токсичностью Аβ

После введения лекарственного препарата активность Na⁺-К⁺-АТФазы во всем головном мозге крыс с повреждением, полученным в результате Аβ-токсичности, значительно увеличилась. Это указывает на способность лекарственного препарата согласно настоящему изобретению защищать активность АТФазы и регулировать клеточный обмен, что улучшает функционирование плазматической мембраны нервных клеток и функционирование клеток.

4 Определение уровня экспрессии гена АРР

4.1 Влияние уровня экспрессии гена АРР в коре головного мозга и гиппокампе крыс с нарушением когнитивной способности в результате естественного старения

Уровень экспрессии гена АРР в коре головного мозга и гиппокампе крыс контрольной группы старых животных значительно выше, чем в контрольной группе молодых животных (Р<0.05). Через 12 недель после введения препарата уровень экспрессии гена АРР в группе положительного контроля, получавшей Танакан, и во всех группах дозирования, получавших лекарственный препарат согласно настоящему изобретению, значительно снижался по сравнению с контрольной группой старых животных (Р<0.05). Результаты представлены в Таблице 12.

Таблица 12. Влияние уровня экспрессии гена АРР в коре головного мозга и гиппокампе крыс с нарушением когнитивной способности вследствие естественного старения Группа Дозировка (мг/кг) n АРР/β-актин (%) Молодая контрольная   3 87.8±10.8 Старая контрольная   3 143.4±16.9# Танакан 30 3 104.4±6.6* Препарат согласно данному изобретению 11.5 3 101.4±20.9* Препарат согласно данному изобретению 23 3 108.4±15.0* Препарат согласно данному изобретению 46 3 97.2±22.5* Примечание: по сравнению с контрольной группой молодых животных: #Р<0.05; по сравнению с контрольной группой старых животных: *Р<0.05.

4.2 Обсуждение и краткое резюме

Приведенные результаты показывают, что лекарственный препарат согласно настоящему изобретению способен в значительной степени регулировать избыточную экспрессию гена АРР в коре головного мозга и гиппокам крыс с нарушением когнитивной функции в результате естественного старения. Это указывает на то, что улучшение при нарушении памяти научения, обеспечиваемое лекарственным препаратом, может являться следствием ингибирования анормальной экспрессии данного гена в коре головного мозга и гиппокампе, снижения образования и анормального накопления Аβ и образования SP, воздействия на патологическое нарушение, возможно, индуцируемое Аβ, образующихся первичных патологических изменений и действия факторов, функционированию центральной памяти научения.

5 Эксперимент по гистологии и клеточной морфологии

5.1 Окрашивание НЕ (Haematoxylin and Eosin Staining)

Эксперимент выполняли согласно Разделу 2 Главы 7 Pathological Tissue Sectioning and Staining Technology (Gong Zhi-jin et al.).

5.1.1 Влияние на гистоморфологию крыс в модели старения головного мозга, вызванным D-галактозой

Пирамидные клетки гиппокампа крыс в группе, не подвергавшейся никакому воздействию, плотно располагаются на одной оси, с явными верхним и нижним очертаниями клеток с большим количеством клеток; ядерные мембраны прозрачные, можно различить отдельные ядрышки. Пирамидные клетки гиппокампа крыс модельной группы утрачивают упорядоченное расположение, клеточная структура искривляется, тело клеток разбухает, и наблюдается неправильность верхнего и нижнего очертаний клеток; у некоторых клеток наблюдают кариопикноз и глубокое окрашивание. По сравнению с модельной группой в гиппокампе крыс и в группе положительного контроля, получавшей Хуперзин А, и всех группах, получавших лекарственный препарат согласно настоящему изобретению, пирамидные клетки располагаются в строгом порядке с более явными очертаниями клеток; уровень кариопикноза и глубокого окрашивания в них ниже. Наиболее очевидны эти эффекты в группе, получавшей Хуперзин А, и группах, получавших высокие и средние дозы лекарственного препарата согласно настоящему изобретению.

5.1.2 Влияние на гистоморфологию крыс в модели нарушения когнитивной способности в результате естественного старения

Пирамидные клетки гиппокамп крыс в контрольной группе молодых животных сконцентрированы в упорядоченной структуре, верхние и нижние контуры клеток хорошо выражены. Ядерные мембраны прозрачны, и видны ядрышки. Пирамидные клетки гиппокампа крыс в контрольной группе старых животных утрачивают упорядоченное расположение, некоторые клетки имеют дефектную структуру; у некоторых наблюдают пикноз и глубокое окрашивание с треугольным контуром; по сравнению со контрольной группой старых животных пирамидные клетки гиппокампа крыс в группе, получавшей Танакан, и во всех группах, получавших лекарственный препарат согласно настоящему изобретению, имеют четкое линейное расположение и лучшую клеточную морфологию, присутствует менее выраженный клеточный пикноз и темное окрашивание. Наиболее очевидны эти эффекты в группе, получавшей Танакан, и группах, получавших высокие и средние дозы лекарственного препарата согласно настоящему изобретению.

5.2 Влияние на ультраструктуру нервных клеток гиппокампа

Использовали метод, описанный на стр.1-4 Modern Medical Experimental Method (WANG Qian)

5.2.1 Влияние на ультраструктуру нервных клеток гиппокампа крыс в модели нарушения, вызванного токсичностью Аβ

Ультраструктура нервных клеток гиппокампа крыс в группе с имитацией операции является нормальной, с крупными круглыми или овальными ядрами, равномерным распределением эухроматина, видимыми ядрышками и неповрежденной ядерной мембраной; структура митохондрий и шероховатого эндоплазмотического ретиколома в цитоплазме четкая; присутствуют обильные рибосомы и синапсы. У крыс модельной группы присутствуют скопления лейкоцитов на периферии участка воспаления и пикноз хромосом ядер нервных клеток гиппокампа; объем клеток уменьшается, и цитоплазма является более концентрированной; в некоторых клетках митохондрии слегка раздуваются; клеточные органеллы, такие как шероховатый эндоплазматический ретикулум и рибосомы, по существу, нормальны; пресинаптические и постсинаптические мембраны непрозрачны. Синаптическое пространство исчезает. Присутствует значительное уменьшение синаптической щели по сравнению с группой с имитацией операции. В сравнении с модельной группой, нервные клетки гиппокампа в группе, получавшей Хуперзин А, и во всех группах, получавших лекарственный препарат согласно настоящему изобретению, имеют лучшую морфологию и структуру, прозрачные клеточные мембраны и пре- и постсинаптические мембраны; большинство клеток имеют стандартные ядерные хромосомы; кристы митохондрий прозрачны.

5.2.2 Влияние на ультраструктуру нервных клеток гиппокампа крыс в модели нарушения когнитивной способности в результате естественного старения

Нервные клетки гиппокампа в контрольной группе молодых животных сохраняют нормальные морфологические характеристики: большие круглые или овальные ядра, равномерное распределение хроматина, отчетливые ядрышки; структура митохондрий и шероховатого эндоплазмотического ретикулума в цитоплазме четкая; много рибосом и синапсов. В контрольной группе старых животных очевидны фрагментация и разрушение мембран, вакуолей и меиолидных структур в некоторых нервных клетках гиппокампа; ядра неправильной формы, хроматин слипается, и периферическое пространство ядер значительно утолщается; митохондрии раздуваются и вакуолизируются; эндоплазматический ретикулум растягивается, обнаруживается много пигмента старения и масляных капель. В отличие от модельной группы в группе, получавшей Хуперзин А, и во всех группах, получавших лекарственный препарат согласно настоящему изобретению, нервные клетки гиппокампа имеют лучшую морфологию и структуру, прозрачные клеточные мембраны; некоторые клетки имеют стандартные хромосомы ядра, пластинчатые кристы митохондрий прозрачны; число рибосом увеличивается, а также число синапсов увеличивается. Наиболее очевидны эти эффекты в группе, получавшей Танакан, и группах, получавших высокие с средние дозы лекарственного препарата согласно настоящему изобретению.

5.2.3 Влияние на ультраструктуру нервных клеток гиппокампа модельных трансгенных мышей с геном АРР

Ультраструктура нервных клеток гиппокампа нетрансгенных мышей одного помета нормальна: большие круглые и овальные ядра, равномерно распределенный хроматин и четкие ядрышки; структура митохондрий и шероховатого эндоплазматического ретикулума в цитоплазме четкая; много рибосом и синапсов. В группе мышей, не подвергавшихся никакому воздействию, наблюдают кариопинкоз, скопление лейкоцитов по краю участка воспаления и нерегулярное расположение; митохондрий немного, кристы не упорядочены и расстояние между ними велико, шероховатый эндоплазматический ретикулум не упорядочен и даже фрагментирован; число лизосом снижается, и они приобретают неправильную форму; в цитоплазме иногда обнаруживают вакуоли, миелоидные структуры и кое-где липофусцин. Клетки в группе, получавшей высокие дозы лекарственного препарата согласно настоящему изобретению, имеют лучшую морфологию и структуру, чем в группе, не подвергавшейся никакому лечению. Некоторые клетки имеют четкую структуру, а некоторые ядра содержат равномерно распределенный хроматин.

5.3 Краткое резюме

Неповрежденная морфология нервных клеток гиппокампа является условием их нормального функционирования. Патологические факторы, такие как ишемическая болезнь мозга, старение или старческое слабоумие, могут вызвать нарушение морфологии и структуры нервных клеток, что неизбежно приведет к нарушению функционирования. Например, повреждение ядер и шероховатого эндоплазматического ретикулума может привести к ослаблению функции синтеза белка; повреждение митохондрий может вызвать нарушение энергетического метаболизма; накопление большого количества липофусцина будет нарушать пространственное расположение; потеря синапсов будет означать исчезновение ткани-мишени для нервных клеток; и все изменения, в конечном счете, приводят к старению и смерти. Крысы с индуцированным D-галактозой старением головного мозга и крысы с нарушением когнитивной способности, вызванным естественным старением, служат в качестве моделей для окрашивания НЕ. Крысы с нарушением, вызванным токсичностью Аβ, крысы с нарушением когнитивной способности, вызванным естественным старением, и трансгенные мыши с геном служат в качестве моделей для трансмиссионной электронной микроскопии для исследования влияния лекарственного препарата согласно настоящему изобретению на нервные клетки гиппокампа модельных животных. Результаты показывают, что у различных модельных животных, которым вводили лекарственный препарат согласно настоящему изобретению, морфология и структура нервных клеток гиппокампа может быть в различной степени улучшена, число синапсов возрастает, апоптоз и потеря нервных клеток могут быть замедлены или снижены. Все это свидетельствует о том, что лекарственный препарат согласно настоящему изобретению способен защищать нервные клетки.

Токсикологический тест

Крысам, не получавшим пищи в течение 16 часов, два раза в день внутрижелудочным путем вводят препарат в дозе с максимальной концентрации (57.5 мг/мл) и максимальным объемом (20 мл/кг веса тела). Ежедневная максимальная доза составляет 2300 мг/кг веса тела и эквивалентна 670-кратной клинической дозе для человека, составляющей (240 мг/день). За 14 последовательных дней наблюдения смертей зафиксировано не было. На протяжении 6 месяцев крысам вводили лекарственный препарат в 70-, 35- и 17.5-кратной клинической дозе, запланированной для назначения человеку. Исследовали общие показатели, вес тела, потребление пищи, обычные показатели крови, свертываемость крови, биохимию крови, ЭКГ, показатели макро- и микроскопических обследований главных внутренних органов соответственно через 3, 6 месяцев после введения препарата и через 4 недели после прекращения введения препарата. Существенных патологических изменений обнаружено не было. Токсикологическое исследование показало, что лекарственный препарат является низкотоксичным и безопасным.

В целом, состав согласно настоящему изобретению является лучшим и обладает более выраженным действием, чем широко применяемые лекарственные препараты для лечения ишемической болезни мозга и старческого слабоумия. Долгосрочное исследование также показывает, что традиционный китайский лекарственный состав согласно настоящему изобретению является стабильным и надежным.

Лучший вариант реализации изобретения

Задача и техническое решение данного изобретения подробно иллюстрируют приведенные ниже примеры.

Пример 1

Получение китайского лекарственного состава согласно настоящему изобретению (экстракты).

Формула:

Экстракт корня женьшеня 27.5 г Экстракт листьев гинкго 27.5 г Экстракт рылец шафрана 5.5 г Экстракт сои культурной 2.75 г

Способ получения:

К сырому лекарственному препарату корня женьшеня добавили 8-кратное количество 60% этанола, и смесь кипятили с обратным холодильником. Экстракцию повторяли дважды. Жидкие экстракты объединили и концентрировали до относительной плотности около 1.05 (50°С). К жидкому концентрату добавили 2-кратный объем дистиллированной воды и фильтровали. Фильтраты хроматографировали на макропористой адсорбционной смоле типа АВ-8. Смолу с лекарственными веществами элюировали дистиллированной водой, а затем 10% этанолом. Водный элюент и элюент с 10% этанолом сбрасывали, а смолу элюировали 70% этанолом до тех пор, пока объем не составил примерно 2.5-кратный объем колонки. Элюент с 70% этанолом собирали. В результате получали содержащий гинзенозиды экстракт корня женьшеня.

К сухим листьям гинкго добавили 8-кратное количество 70% этанола, погрузили в жидкость при 60°С и дважды провели экстракцию в течение по меньшей мере часа. Жидкие экстракты объединили и концентрировали при пониженном давлении до тех пор, пока относительная плотность не составила приблизительно 1.05 (50°С). К жидкому концентрату добавили дистиллированную воду в 2-кратном объеме и фильтровали. Фильтрат хроматографировали на макропористой адсорбционной смоле типа ADS-17. Смолу с лекарственными веществами элюировали водой, затем 60% этанолом. Водный элюент сбрасывали, а элюент с 60% этанола собирали и концентрировали до исчезновения запаха спирта. Затем к сырым лекарственным препаратам добавили 2-кратное количество воды и нагрели до кипения. Отстаивали при комнатной температуре в течение 24 часов. После фильтрования фильтрат хроматографировали на макропористой адсорбционной смоле типа DM-130. Смолу с лекарственными веществами элюировали водой, затем 15% этанолом и, наконец, 60% этанолом. Водный элюент и элюент с 15% этанола сбрасывали, а элюент с 60% этанола собирали. Концентрирование и сушку продолжали до получения продукта экстракции листьев гинкго. Соотношение флавоноидов гинкго к гинколидам в продукте составило 24:15.

К необработанному лекарственному препарату рылец шафрана добавили 20-кратное количество 60% этанола, погрузили в жидкость при 70-80°С и дважды повторили экстракцию. Жидкие экстракты объединили и концентрировали до исчезновения запаха спирта. Жидкий концентрат разбавили водой в объеме, превышающем количество сырого лекарственного препарата. Разбавленную жидкость хроматографировали на макропористой адсорбционной смоле типа АВ-8. Смолу с лекарственными веществами элюировали водой, затем 20%, 30% и, наконец, 70% этанолом. Водный элюент и элюент с 30% этанола сбросили, а элюент, содержащий 70% этанол, собирали. В результате получили экстракт рылец шафрана, содержащий гликозиды рылец шафрана.

Сою культурную экстрагировали 95% этанолом и фильтровали. Остаток экстрагировали 70% этанолом и фильтровали. Экстракты в этаноле объединили и концентрировали до исчезновения запаха спирта. К полученным материалам прибавили 2-кратное количество воды, хорошо перемешали и фильтровали. Фильтрат хроматографировали на макропористой адсорбционной смоле типа АВ-8. Смолу с лекарственными препаратами элюировали водой и водный элюент отбросили. Затем использовали в качестве элюента 60% этанол. Элюент собрали и получили часть А. Главным компонентом в части А являются изофлавоноиды. Затем использовали в качестве элюента 90-95% этанол. Элюент собрали. Добавили безводный этанол для этерификации. Снова добавили воду для промывки и получили слоистый раствор. Для дегазации давление раствора снизили до 0.1 МПа на ротационном испарителе, после чего удалили нижний слой (кислый водный). Для алкоголиза добавили гидроокись натрия. Затем для промывания добавили воду. Удалили водный щелочной нижний слой. Давление органической жидкости в верхнем слое для дегазации снизили до 0.1 МПа и подвергли мембранной дистилляции. Остаток подвергли молекулярной дистилляции (при 0.133 Па, <0.5 мм между испарительной пластиной и охлаждающей пластиной). Получили часть Б, компонентами которой является смесь токоферола. Части А и Б смешали и использовали согласно настоящему изобретению в качестве экстракта сои культурной. Экстракт сои культурной согласно настоящему изобретению содержит в основном изофлавоноиды и витамин Е в весовом соотношении 4:1.

Указанные высушенные экстракты измельчили до размера гранул 20 меш, смешивали с 86.75 г крахмала и помещали в капсулы №3. В результате получили лекарственный препарат согласно настоящему изобретению в капсулах.

Результаты показывают, что препарат китайского лекарственного состава в капсулах соответствует следующим сопутствующим нормам.

Квалификационные требования и качественные показатели: идентификацию гинкголидов и определение их состава выполняли в соответствии с разделом Китайской Фармакопеи, посвященному экстракту листьев гинкго; идентификацию гликозидов I рылец шафрана и определение их состава выполняли в соответствии с разделом Китайской Фармакопеи, посвященным рыльцам шафрана; идентификацию и определение состава корня женьшеня выполняли в соответствии с разделом Китайской Фармакопеи, посвященным корню женьшеня.

Метод определения изофлавоноида сои культурной и генистеина: соответствующее количество экстракта сои культурной точно взвешивали и добавляли к 25 мл воды. После перемешивания и суспендирования добавляли 1 мл раствора ацетатного буфера (рН 4.5) и 15 мкл β-глюкосахарозы. Для гидролиза использовали водяную баню, нагретую до 37°С. Растворитель удаляли до сухого состояния путем понижения давления. Для растворения использовали метанол. Фильтровали с использованием микропористой фильтровальной мембраны. Анализировали путем использования жидкостной хроматографии (хроматографическая колонка Zorbax-C₁₈. Подвижная фаза метанол-вода-уксусная кислота 45:55:1, скорость потока 0.8 мл/мин, длина волны детектирования 260 нм).

Определение содержания VE: отобрали подходящее количество продукта, точно взвесили и поместили в ступку. В ступку добавили две капли безводного этанола и продукт растерли. Использовали 20 мл безводного этанола для количественного переноса продукта (порошка и жидкости) в делительную воронку. Перенос осуществляли несколькими приемами. Прибавили 10 мл воды и трижды провели экстракцию н-гексаном, порциями по 5 мл. Экстракционные жидкости объединили. Растворитель удалили и сушили при пониженном давлении. Подвижную фазу остатка количественно перенесли в 1 мл пузырек. Добавили подвижную фазу до отмеченного уровня. Жидкость в пузырьке равномерно встряхивали и пропустили через 0.45 мкм микропористую фильтровальную мембрану как тестовую жидкость. Отобрали по 10 мкл контрольной и тестовой жидкости и ввели в установку жидкостной хроматографии для анализа (в качестве подвижной фазы использовали смесь метанол-вода 97:3 по объему, длина волны детектирования 207 нм).

Состав капсулы смеси лекарственных препаратов следующий (1.5 г для каждой капсулы):

(1) Общее количество гликозидов не менее чем 13.75 мг в расчете на гинзенозиды Re (С₄₈Н₈₂О₁₈).

(2) В расчете на гинзенозиды Rg₁ (С₄₂Н₇₂О₁₄), Re (C₄₈H₈₂O₁₈) и гинзенозиды Rb₁ (С₅₄Н₉₂О₂₃) общее количество гинзенозидов составляет не менее 1.375 мг, 0.825 мг и 0.825 мг соответственно.

(3) Общее количество флавоноидов не менее 11.00 мг в расчете на рутин (С₂₇Н₃₀О₁₆).

(4) Общее количество флавоноидных гликозидов не менее 6.60 мг в расчете на кверцетин, камферид и изорамнетин соответственно.

(5) Терпенового лактона не менее 2.75 мг в расчете на общее количество гингколидов А (С₂₀Н₂₄О₉), гингколидов В (С₂₀Н₂₄О₁₀), гингколидов С (С₂₀Н₂₄О₁₁) и билобалида (C₁₅H₁₈O₈).

(6) Общее количество гликозидов рылец шафрана не менее 2.75 мг в расчете на безводный гликозид-l рылец шафрана (С₄₄Н₆₄О₂₄);

(7) Гликозид-l рылец шафрана (C₄₄H₆₄O₂₄) не менее 1.375 мг.

(8) Общее количество изофлавоноидов сои культурной не менее 1.35 мг в расчете на генистеин (C₂₇H₃₀O₁₆).

(9) Гинестеина (С₂₇Н₃₀О₁₆) не менее 0.5 мг.

(10) Витамина Е не менее 0.5 мг в расчете на витамин Е (С₃₁Н₅₂О₃).

Согласно настоящему изобретению рекомендованная клиническая доза состава в капсулах составляет 150 мг три раза в день.

Пример 2

Рецептура состава согласно настоящему изобретению:

Корня женьшеня 40 весовых частей Листьев гинкго 45 весовых частей Рылец шафрана 1 весовая часть Сои культурной 75 весовых частей

Способ получения состава: указанные лекарственные материалы измельчили до размера 20 меш и получили состав.

Получение гранул: после смешивания порошка лекарственного препарата к нему добавили декстрин и стевиозин, равномерно перемешали, сушили в вакууме при 70-75°С. Превращали в порошок и гранулировали. Получили состав согласно настоящему изобретению в виде темно-коричневых гранул продукта.

Результаты показывают, что гранулы состава согласно настоящему изобретению соответствуют правилам раздела, посвященного гранулам (Chinese Pharmacopoeia, 2005 edition volume Appendix 1С). Содержание компонентов определяли согласно Примеру 1. Содержание гинзенозида Re не менее 9.15 мг/г.

Пример 3

Состав: экстракт корня женьшеня: 2 части; экстракт листьев гинкго: 10 частей; экстракт рылец шафрана: 0.5 части; экстракт сои культурной: 1 часть.

Способ получения таблеток: после смешивания экстрактов компонентов согласно настоящему изобретению добавили склеивающее вещество, такое как декстрин, тщательно перемешали, сушили в вакууме при 60-80°С и измельчили. Добавили наполнители (например, крахмал), смазывающие вещества (например, стеарат магния), а также разрыхляющий агент (например, натриевую соль карбоксиметил крахмала), и равномерно перемешали. Смесь гранулировали и прессовали в таблетки. В результате получили таблетки продукта.

Результаты показывают, что таблетки состава согласно настоящему изобретению соответствуют установленным правилам раздела, посвященного таблеткам. Количественное и качественное определение выполняют так же, как и в Примере 1. Продукт содержит не менее 9.15 мг/г гинзенозида Re.

Пример 4

Состав: экстракт корня женьшеня: 10 частей; экстракт листьев гинкго: 3 части; экстракт рылец шафрана: 4 части; экстракт сои культурной: 0.2 части.

Способ получения состава: такой же, как в Примере 1.

Способ получения таблеток: после смешивания экстрактов компонентов согласно настоящему изобретению добавили клеящее вещество, такое как декстрин, тщательно перемешали, сушили в вакууме при 60-80°С и измельчили. Добавили наполнители (например, крахмал), смазывающие вещества (например, стеарат магния), а также разрыхляющий агент (например, натриевую соль карбоксиметилкрахмала) и равномерно перемешали. Смесь гранулировали и прессовали в таблетки. В результате получили таблетки продукта.

Результаты показывают, что таблетки состава согласно настоящему изобретению соответствуют установленным правилам раздела, посвященного таблеткам. Количественное и качественное определение выполняли так же, как и в Примере 1. Продукт содержит не менее чем 9.15 мг/г гинзенозида Re.

Пример 5

Состав: экстракт корня женьшеня: 10 частей; экстракт листьев гинкго: 1 часть; экстракт рылец шафрана: 0.5 части; экстракт сои культурной: 80 частей.

Способ получения состава: указанные лекарственные материалы измельчили до размера 20 меш и получили состав согласно настоящему изобретению. Содержание компонентов определяли так же, как и в Примере 1. Содержание гинзенозидов не менее 9.15 мг/г.

Изобретение относится к медицине. Лекарственный состав для лечения ишемической болезни мозга и старческого слабоумия содержит 1-10 весовых частей корня женьшеня, 1-10 весовых частей листьев гинкго, 0,05-0,5 весовых частей рылец шафрана и 5-10 весовых частей сои культурной, причем указанные корень женьшеня, листья гинкго, рыльца шафрана и соя культурная могут быть в форме необработанных растительных материалов или экстрактов, полученных путем экстрагирования тех же количеств необработанного растительного материала. В листья гинкго добавляют по меньшей мере 2-кратное количество 60-80% этанола и осуществляют экстракцию погружением при 50-70°С, по меньшей мере, один раз с получением жидких экстрактов; жидкие экстракты объединяют и концентрируют до тех пор, пока относительная плотность полученного жидкого концентрата не достигнет приблизительно 1.05; к жидкому концентрату добавляют воду и фильтруют полученную смесь с получением фильтрата; фильтрат хроматографируют на полярной, макропористой адсорбционной смоле полистирольного типа в протонированной форме, смолу с лекарственными веществами элюируют водой, затем 60% этанолом; водный элюент сбрасывают, а элюент, содержащий этанол, собирают и концентрируют до исчезновения запаха спирта, в результате получают концентрированный элюент; к концентрированному элюенту добавляют воду и фильтруют с получением другого фильтрата; фильтрат хроматографируют на слабополярной макропористой адсорбционной смоле полистирольного типа, смолу с лекарственными веществами элюируют водой, затем 15% этанолом и 60% этанолом соответственно; водный элюент и элюент с 15% этанола сбрасывают, а элюент с 60% этанола собирают. Применяют для получения лекарственных средств для лечения ишемической болезни мозга и старческого слабоумия. Изобретения позволяют реализовать указанные назначения. 6 н. и 6 з.п. ф-лы, 12 табл.

1. Лекарственный состав для лечения ишемической болезни мозга и старческого слабоумия, содержащий 1-10 вес.ч. корня женьшеня, 1-10 вес.ч. листьев гинкго, 0,05-0,5 вес.ч. рылец шафрана и 5-10 вес.ч. сои культурной, причем указанные корень женьшеня, листья гинкго, рыльца шафрана и соя культурная могут быть в форме необработанных растительных материалов или экстрактов, полученных путем экстрагирования тех же количеств необработанного растительного материала.

2. Лекарственный состав по п.1, отличающийся тем, что содержит 2-6 вес.ч. корня женьшеня, 3-6 вес.ч. листьев гинкго, 0,06-0,2 вес.ч. рылец шафрана и 7-8 вес.ч. сои культурной.

3. Лекарственный состав для лечения ишемической болезни мозга и старческого слабоумия, содержащий 1-10 вес.ч. экстракта корня женьшеня, 1-10 вес.ч. экстракта листьев гинкго, 0,05-0,5 вес.ч. экстракта рылец шафрана и 0,1-1 вес.ч. экстракта сои культурной.

4. Лекарственный состав по п.3, отличающийся тем, что указанный экстракт листьев гинкго содержит, по меньшей мере, флавоноиды гинкго и гинкголиды в весовом отношении 24:25-10.

5. Лекарственный состав по п.1 или 3, отличающийся тем, что указанный экстракт листьев гинкго получают следующим образом:
в листья гинкго добавляют, по меньшей мере, 2-кратное количество 60-80%-ного этанола и осуществляют экстракцию погружением при 50-70°С, по меньшей мере, один раз с получением жидких экстрактов;
жидкие экстракты объединяют и концентрируют до тех пор, пока относительная плотность полученного жидкого концентрата не достигнет приблизительно 1,05;
к жидкому концентрату добавляют воду и фильтруют полученную смесь с получением фильтрата;
фильтрат хроматографируют на полярной, макропористой адсорбционной смоле полистирольного типа в протонированной форме, смолу с лекарственными веществами элюируют водой, затем 60%-ным этанолом; водный элюент сбрасывают, а элюент, содержащий этанол, собирают и концентрируют до исчезновения запаха спирта, в результате получают концентрированный элюент;
к концентрированному элюенту добавляют воду и фильтруют с получением другого фильтрата;
фильтрат хроматографируют на слабополярной макропористой адсорбционной смоле полистирольного типа, смолу с лекарственными веществами элюируют водой, затем 15%-ным этанолом и 60%-ным этанолом соответственно; водный элюент и элюент с 15% этанола сбрасывают, а элюент с 60% этанола собирают.

6. Лекарственный состав по п.1 или 3, отличающийся тем, что указанный экстракт сои культурной содержит, по меньшей мере, изофлавоноид сои культурной и витамин Е в весовом соотношении 4:2-0,5.

7. Лекарственный состав по п.6, отличающийся тем, что экстракт сои культурной получен следующим образом:
материал сои культурной экстрагируют 85-95%-ным этанолом и фильтруют, полученный остаток экстрагируют 60-80%-ным этанолом и фильтруют;
полученные экстракты в этаноле объединяют и концентрируют до исчезновения запаха спирта, к концентрированному экстракту добавляют количество воды, равное по весу материалу, и фильтруют, в результате получают фильтрат;
фильтрат хроматографируют на макропористой адсорбционной смоле, указанную макропористую адсорбционную смолу элюируют 50-65%-ным этанолом, полученный элюент собирают и получают часть А;
затем макропористую адсорбционную смолу элюируют 90-95%-ным этанолом, элюент с 90-95% этанола собирают и упаривают с получением остатка;
в остаток добавляют безводный этанол для этерификации, затем снова добавляют воду, в результате чего получают слоистый раствор; для дегазации снижают давление раствора до 0,1 МПа, после чего нижний слой раствора удаляют;
добавляют гидроксид натрия, что приводит к алколизу, затем добавляют воду для промывания, промывную жидкость из нижнего слоя удаляют, давление органической жидкости снижают до 0,1 МПа для дегазации, а затем подвергают мембранной дистилляции;
остаток подвергают молекулярной дистилляции, в результате получают часть Б;
части А и Б смешивают.

8. Способ получения лекарственного состава по п.1 или 3, отличающийся тем, что он включает смешивание экстракта корня женьшеня, экстракта листьев гинкго, экстракта рылец шафрана и экстракта сои культурной; причем указанный экстракт корня женьшеня получают следующим образом:
к корню женьшеня добавляют, по меньшей мере, 2-кратное количество 50-70%-ного этанола и, по меньшей мере, один раз осуществляют экстракцию с дефлегмацией; жидкие экстракты концентрируют до тех пор, пока относительная плотность полученного жидкого концентрата не достигнет приблизительно 1,05; к жидкому концентрату добавляют, по меньшей мере, однократный объем воды и фильтруют; фильтрат хроматографируют на низкополярной макропористой адсорбционной смоле полистирольного типа; смолу с лекарственными веществами элюируют водой, затем 10%-ным этанолом; водный элюент и элюент с 10% этанола отбрасывают; затем смолу элюируют 60-75%-ным этанолом, элюент с 60-75% этанола собирают и получают в результате экстракт корня женьшеня;
указанный экстракт листьев гинкго получают следующим способом:
к сухим листьям гинкго добавляют, по меньшей мере, 2-кратное количество 60-80%-ного этанола и проводят экстракцию при 50-70°С, по меньшей мере, один раз, жидкие экстракты концентрируют путем понижения давления до тех пор, пока относительная плотность полученного жидкого концентрата не достигнет приблизительно 1,05; к жидкому концентрату добавляют воду, охлаждают, отстаивают и фильтруют; фильтрат хроматографируют на полярной, макропористой, адсорбционной смоле полистирольного типа в протонированной форме; смолу с лекарственными веществами элюируют водой, а затем 60%-ным этанолом, водный элюент отбрасывают, а элюент с 60% этанола собирают и концентрируют до исчезновения запаха спирта; добавляют воду и нагревают до кипения; проводят осаждение при комнатной температуре; после фильтрования фильтрат хроматографируют на слабополярной, макропористой, адсорбционной смоле полистирольного типа; смолу с лекарственными веществами элюируют водой, затем 15%-ным и 60%-ным этанолом соответственно; водный элюент и элюент с 15% этанола, сбрасывают, элюент с 60% этанола, собирают;
указанный экстракт рылец шафрана получают следующим образом:
к рыльцам шафрана добавляют, по меньшей мере, 5-кратное количество 60-80%-ного этанола, выполняют экстракцию при 70-80°С, по меньшей мере, один раз; жидкие экстракты концентрируют до исчезновения запаха спирта; жидкий концентрат разбавляют более, чем 1-кратным объемом воды по отношению к лекарственному сырью; разбавленную жидкость хроматографируют на слабополярной, макропористой, адсорбционной смоле полистирольного типа; смолу, содержащую лекарственное средство, элюируют водой, затем менее чем 30%-ным этанолом, постепенно повышая его концентрацию; наконец, для элюирования смолы с лекарственными веществами используют 70%-ный этанол; водный элюент и элюент с менее чем 30% этанола отбрасывают, элюент с 70% этанола собирают;
указанный спиртовой экстракт сои культурной получают следующим образом:
материал сои культурной экстрагируют 85-95%-ным этанолом и фильтруют; остаток экстрагируют 60-80%-ным этанолом и фильтруют; экстракты в этаноле объединяют и концентрируют до исчезновения запаха спирта; к полученному концентрату добавляют количество воды, равное по весу материалу, после этого смесь фильтруют; фильтрат хроматографируют на макропористой, адсорбционной смоле; смолу с лекарственными веществами в начале элюируют водой и водный элюент сбрасывают, затем элюируют 50-65%-ным этанолом; элюент собирают и получают часть А; затем для элюирования смолы используют 90-95%-ный этанол; элюент полностью собирают и добавляют безводный этанол для этерификации; опять добавляют воду и получают слоистый раствор; давление раствора снижают до 0,1 МПа для дегазации, после чего нижний слой раствора удаляют; добавляют гидроксид натрия для алкоголиза; добавляют воду для промывания; водную промывную жидкость из нижнего слоя полученной жидкости удаляют; давление органической жидкости из верхнего слоя снижают до 0,1 МПа для дегазации, затем ее подвергают мембранной дистилляции; остаток подвергают молекулярной дистилляции и получают часть Б; смешивают части А и Б и используют в качестве экстракта сои культурной.

9. Лекарственный состав для лечения ишемической болезни мозга и старческого слабоумия, включающий лекарственный состав по любому из пп.1-6 и дополнительно фармацевтически приемлемый вспомогательный материал.

10. Лекарственный состав по п.9, отличающийся тем, что лекарственный состав изготовлен в виде лекарственной формы для перорального применения, выбранной из медовой пилюли, концентрированной пилюли, водных пилюль, гранул, капсул, таблеток, порошков, мазей, жидкостей для перорального приема и сиропа.

11. Применение состава по п.1 в получении лекарственных средств для лечения ишемической болезни мозга и старческого слабоумия.

12. Применение состава по п.3 в получении лекарственных средств для лечения ишемической болезни мозга и старческого слабоумия.