Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области медицины, и относится к лекарственному препарату или лечебному средству для лечения цитомегаловирусной инфекции человека, в частности, к применению экстрактов женьшеня (традиционная китайская медицина) и его производных в лекарственных препаратах или лечебных продуктах для лечения цитомегаловирусной инфекции.
Уровень техники
Цитомегаловирус человека (ЦМВЧ), известный также как болезнь с клеточными включениями, получил свое название вследствие разбухания инфицированных клеток и образования крупных внутриядерных включений. ЦМВЧ относится к подсемейству β-герпесвирусов, имеет диаметр около 200 нм, представляет собой один из самых крупных вирусов животных и содержит внутреннее ядро диаметра 64 нм с вирусной ДНК, окруженное оболочкой из икосаэдров размером 110 нм с внешним покрытием. Интегрированные частицы завернуты в конверт, в котором BJ состоит из белка или гликопротеина, кодированного по меньшей мере 25-30 вирусными частицами. Длина генома ЦМВЧ составляет 235-240 килобаз (kb), а его молекулярная масса - 150-160⋅103 кДа и, кроме того, он состоит из линейной двух цепочечной ДНК, и относится к ДНК-содержащим вирусам. ЦМВЧ состоит из длинных (Д) и коротких (К) компонентов, или сегментов. Благодаря различной ориентации или инверсии взаимного соединения двух компонентов, структура молекул ДНК включает в себя 4 гомогенных изомера. Вследствие широкой распространенности данного вируса, инфицированию могут подвергаться другие животные, приобретая иные виды системной инфекции, от легкой бессимптомной инфекции до серьезных заболеваний или смерти, вследствие заболеваний, поражающих, главным образом, мочеполовую систему, центральную нервную систему и печень. Структура гена ЦМВЧ содержит полипептидные сегменты, кодирующие 3 специфичности инфекционной клетки, а именно, область немедленного раннего белка, область раннего белка и область позднего белка, при этом 3 типа белка обладают иммуногенностью и временными фазами.
Транскрипция-трансляция у ЦМВЧ регулируется и контролируется клетками ЦМВЧ и клетками организма-носителя. Экспрессия немедленных ранних генов и ранних генов регулируется и контролируется промоторами, что обычно определяется как острая инфекция. Транскрипция и трансляция поздних генов регулируется и контролируется генами и белком IE и E, которые определяют инкубационный период вирусов после обнаружения. Зрелость сборки вирусов представляет собой результат анафазы инфекции ЦМВЧ. Геном ЦМВЧ включает в себя 3 морфологических трансформирующих области, вызывающих трансформацию клетки, а именно, mtrI, mtrII and mtrIII. Область mtrI находится на фрагменте E HindIII в концевом хвосте левой стороны генома U штамма ADl69, генома U штамма, имеет длину 588 пар оснований (bp) и может использоваться для трансформации NIH3T3 и первичных эмбриональных клеток крысы. МtrII находится на фрагменте Xbal/Bam HI EM ДНК, полученной из штамма HCMV Towne, имеет длину 980 bp и способен трансформировать NIH3T3 и клетки крысы-2 cells; штаммы HCMV ADl69 и TdCMv Танака имеют области, соответствующие штаммам, которые содержат 2 отдельных промотора, P1 и P2, а все трансформированные клетки и опухолевые клетки, образованные из них, существуют в mtrII. МtrIII находится на сегменте Xbal/BamHI и может использоваться для кодирования основного немедленного раннего гена, имеющего молекулярную массу 72 кДа, при этом данный белок относится к трансактивации и авторегуляции вирусов, а mtrIII не существует в трансформированных клетках.
На клеточном уровне инфекция подразделяется на три типа: a. токсикогенная инфекция, b. латентная инфекция и c. клеточная трансформация, или латентная карциногенная инфекция. Полученный из эксперимента in vitro ЦМВЧ может образовывать клеточную линию с вирусными антигенами после инокуляции в фибробласты человека, и имеет характеристики трансформированных клеток. Трансфектированные клетки можно экстрагировать из определенного фрагмента ДНК ЦМВЧ, а частичные клетки можно интегрировать в ДНК хромосомы клетки путем трансформации ДНК и инокулировать в голых бестимусных мышей, чтобы генерировать опухоли. В случае ПВИ иммортализованной клеточной линии эпителиальных клеток шейки матки человека, полученной в результате трансфекции промотора IE ЦМВЧ, Chaoqi Liu и др. получен результат, согласно которому ЦМВЧ способен содействовать злокачественной трансформации эпителиальных клеток шейки матки в сочетании с ПВИ16 и образовывать опухоли у голых мышей после внедрения в хромосому клетки, что объясняет тесную взаимосвязь между ЦМВЧ и раком шейки матки. ЦМВЧ, инактивированный действием ультрафиолетового облучения, в работе Deyin Lu и др., инокулировали в отдел шейки матки мыши 3 раза в неделю, всего в течение 8 недель. Исходя из полученных результатов, в группе ЦМВЧ процент предракового поражения шейки матки составлял 27,8% (23/83), а частота случаем заболевания раком составляла 20,5% (17/83).
Цитомегаловирус (ЦМВ) имеет типичную морфологию вируса герпеса, при этом структура ДНК похожа на структуру вируса простого герпеса (ВПГ), но на 5% больше структуры ВПГ. Данный вирус имеет высокую видоспецифичность по отношению к клеткам-хозяевам или клеточным культурам. ЦМВЧ может инфицировать только людей и размножаться в фибробластах человека. Вирусы медленно размножаются в клеточной культуре, имеют длинный цикл репликации и способны вызывать цитопатические эффекты через 30-40 дней во время первичной сегрегации. ЦМВ характеризуется набуханием и округлением клеток, увеличением ядра и окруженным «гало» крупным ацидофильным включением в ядре. Клеточная иммунная функция организма играет важную роль в образовании и развитии инфекции ЦМВ. Люди с недостаточностью клеточного иммунитета могут подвергаться инфекции ЦМВ в течение длительного времени, а также дальнейшему угнетению клеточного иммунитета организма, такому как активное сокращение цитотоксических Т-клеток, функциональное сокращение естественных киллеров (NK-клеток) и т.д. Организм способен вырабатывать специфические антитела и цитотоксичные Т-лимфоциты после первичного заражения ЦМВ для активации NM клеток. Данные антитела способны ограничивать репликацию ЦМВ, а также обладают определенной резистентностью к повторному заражению тем же штаммом, но не могут противостоять возбуждению эндогенных латентных вирусов и экзогенной инфекции, вызванной другими штаммами ЦМВ. Однако такие клетки могут содействовать максимальному противовирусному эффекту благодаря токсичности специфических цитотоксических Т-лимфоцитов и антитело-зависимых клеток.
Инфекция ЦМВЧ очень часто встречается в местах массового скопления народа и способна вызвать серьезные заболевания. Инфекция у взрослых часто проявляется в состояниях иммунодефицита или иммунного ингибирования. В частности, инфицирование ЦМВЧ зачастую очень легко происходит после терапии иммунодепрессантами, проводимой во время трансплантации органов и трансплантации костного мозга, а также при проведении лучевой терапии и химиотерапии у пациентов, имеющих злокачественные опухоли. Самая высокая заболеваемость инфекцией ЦМВЧ наблюдается у пациентов со СПИДом. Инфекция ЦМВЧ имеет большое значение во всем мире вследствие своей универсальности и возможным серьезным последствиям, что крайне важно для фундаментальных исследований в области эпидемиологии, диагностических методов, лечения и предупреждения данного заболевания, а также соответствующей вирусологии, занимающейся инфекцией ЦМВЧ. После прохождения курса химиотерапии или лучевой терапии иммунитет пациентов, имеющих опухоли, значительно ниже, чем у обычных людей. Латентный ЦМВЧ легко реактивируется, вызывая серьезное инфекционное заболевание, что является важным фактором инфекционного процесса, влияющим на процент выживания и качество жизни пациентов с опухолями.
Инфекционное заболевание ЦМВ является врожденным или приобретенным инфекционным заболеванием, вызванным ЦМВ. В случае врожденного или приобретенного инфекционного заболевания, вызванного ЦМВ, ЦМВ представляет собой вирус с двухцепочечной ДНК, который относится к группе вирусов герпеса и имеет форму, сходную с формой других вирусов герпеса, а также выраженную видоспецифичность по отношению к организму хозяина или клеткам культур тканей. ЦМВЧ можно выделить и выращивать только в фибробластах эмбрионов человека.
Инфекция ЦМВЧ очень часто встречается в местах массового скопления народа. Уровень заболеваемости взрослого населения в Китае достигает свыше 95%. Инфицирование взрослых часто происходит в состояниях иммунодефицита или иммунного ингибирования. В частности, инфицирование ЦМВЧ часто очень легко происходит после терапии иммунодепрессантами, проводимой во время трансплантации органов и трансплантации костного мозга, а также при проведении лучевой терапии и химиотерапии у пациентов, имеющих злокачественные опухоли. У большинства инфицированных не проявляются клинические симптомы, но в некоторых условиях, при поражении нескольких органов и систем, могут возникнуть серьезные заболевания. Вирусы могут поражать легкие, печень, почки, слюнные железы, молочные железы и другие железы, а также многоядерные лейкоциты и лимфоциты, и могут выделяться со слюной, человеческим молоком, потом, кровью, мочой, спермой, маточным секретом и другими физиологическими жидкостями в течение длительного периода времени или с интервалами, и обычно распространяются через ротовые полости, половые пути, плаценту, при переливании крови или трансплантации органов, а также другими путями.
(I) Врожденная инфекция: инфекция ЦМВЧ из организма беременной женщин, способна проникать в плод, вызывая врожденную инфекцию и незначительное количество преждевременных родов, выкидышей, мертворождения или постнатальной смертности. Больные дети могут страдать желтухой, гепатоспленомегалией, тромбоцитопенической пурпурой и гемолитической анемией. У выживших детей обычно сохраняется перманентная умственная отсталость, нейромышечная дискинезия, глухота, хориоретинит и т.д.
(II) Перинатальная инфекция: ЦМВЧ секретируется мочевыводящими путями и шейкой матки рожениц, после этого младенцы могут быть инфицированы при прохождении через родовые пути во время рождения, при этом у большинства из них проявляются легкие симптомы или субклиническая инфекция без клинических симптомов, а у некоторых из них возникают небольшие проблемы с дыхательными путями или нарушения функции печени.
(III) Инфекция детей и взрослых: субклинический тип обычно вызывается инфекцией, передающейся при грудном вскармливании, поцелуях, половом контакте, переливании крови и т.д., которые могут иногда вызвать также гетерофил-отрицательный мононуклеоз или гетерофильные антитела. Вирусы, скрытые в моноцитах и лимфоцитах, могут активироваться в результате иммуносупрессивной терапии, трансплантации органов, наличия опухолей и других факторов во время беременности, которые могут вызвать мононуклеоз, гепатит, интерстициальную пневмонию, ретинит, энцефалит и т.д.
(IV) Трансформация клеток и возможный канцерогенез: фибробласты эмбрионов грызунов могут трансформироваться под действием ЦМВЧ, инактивированного путем ультрафиолетового излучения. ЦМВЧ в некоторых опухолях, таких как рак шейки матки, рак толстой кишки, рак предстательной железы и саркома Каши, имеет высокий уровень обнаружения ДНК и более высокий титр антител по сравнению с обычными людьми. Частицы вируса обнаруживаются также в клеточных штаммах, полученных из опухолей, что наводит на мысль, что ЦМВЧ обладает такой же потенциальной канцерогенностью, что и вирусы герпеса типа ЦМВЧ. Иммунитет пациентов с опухолями после курса лечения химиотерапией или лучевой терапией значительно ниже, чем иммунитет у нормальных пациентов Латентный ЦМВЧ легко реактивируется, вызывая серьезную инфекцию, что является важным фактором инфекционного процесса, влияющим на процент выживания и качество жизни пациентов с опухолями.
Большинство пациентов, инфицированных ЦМВЧ, находятся в состоянии латентной инфекции, так что часто можно избежать бессимптомной инфекции, даже если ЦМВЧ обладает удвоенной активностью in vivo. В настоящее время не существует эффективных и безопасных препаратов против ЦМВЧ, так что лечение инфекции ЦМВЧ все еще ограничено симптоматическим лечением во время симптоматических инфекций, при этом для лечения симптоматической инфекции можно применять ганцикловир, но с осторожностью, вследствии миелодепрессии и других токсических или подобных эффектов. Ганцикловир, или 3,5-дигидроксифенилглицин (ДГФГ), предупреждает диффузию ЦМВЧ и способен снижать коэффициент смертности от осложнений ЦМВ пневмонии при трансплантации костного мозга при совместном применении с иммуноглобулином против ЦМВЧ с высоким титром. В случае инфекции ЦМВЧ, резистентной к ганцикловиру ДГФГ, можно выбрать фоскарнет натрия, который обладает меньшим эффектом, чем ганцикловир ДГФГ, но способен постоянно подавлять диффузию ЦМВЧ. Живая вирусная вакцина против ЦМВЧ способна вызвать выработку антител, но необходимо решить проблему исключения онкогенного потенциала.
Женьшень обыкновенный (т.е. женьшень), средство традиционной китайской медицины, представляет собой ценный лекарственный материал. Гинзенозид, являющийся основным действующим веществом женьшеня, исследован и широко применяется. Для получения гинзенозида наибольшее значение имеют экстракты женьшеня и его производные. При использовании в качестве основного действующего вещества женьшеня, на основе гинзенозида были получены полностью безопасные противоопухолевые пероральные препараты, применяемые в клинической практике, и широко исследовано их применение в качестве инъекций.
Используя современные технологии разделения и очистки, авторы изобретения выделили экстракты женьшеня и его производных, являющихся действующими веществами для лечения инфекции ЦМВЧ, из лекарственного сырья женьшеня, использовав большой объем современных научных разработок, и провели фармакодинамическое и фармакологическое исследование, связанное с лечением инфекции ЦМВЧ экстрактами женьшеня и его производными и соответствующими лекарственными препаратами на его основе. На основании полученных результатов было установлено, что экстракты женьшеня и его мономерные производные обладают очевидными фармакологическими эффектами, выраженным эффектом в отношении лечении инфекции ЦМВЧ, низкой токсичностью или побочными эффектами и высокой безопасностью, и на их основе можно получить эффективный низкотоксичный лекарственный препарат для лечения инфекции ЦМВЧ.
Раскрытие изобретения
Для решения описанных выше технических проблем при лечении инфекционного заболевания, вызванного ЦМВЧ, цель настоящего изобретения заключалась в предоставлении нового применения экстрактов женьшеня, гинзенозида или производных гинзенозида для получения лекарственных препаратов или лечебных продуктов для лечения инфекционного заболевания, вызванного цитомегаловирусом человека (ЦМВЧ). Экстракты женьшеня, гинзенозид или производные гинзенозида обладают активностью и эффективностью при лечении инфекции ЦМВЧ.
Для достижения описанной выше цели, в одном из аспектов настоящего изобретения предоставлено применение экстракта женьшеня, гинзенозида или производного гинзенозида для получения лекарственного препарата или лечебного продукта для лечения инфекционного заболевания, вызванного цитомегаловирусом человека (ЦМВЧ).
При этом сопутствующие заболевания, вызванные инфекцией ЦМВЧ, включают в себя заболевания, вызванные инфекцией ЦМВЧ в процессе лечения сердечно-сосудистых и цереброваскулярных заболеваний, опухолей, ожогов, СПИДа, периодов после трансплантации органов, или перинатального периода и т.д.
В ходе скрининга природных активных компонентов, эффективных при лечении инфекции ЦМВЧ, автором изобретения найдено, что химические компоненты женьшеня, представляющие собой экстракты женьшеня, гинзенозид или производные гинзенозида, обладают высокой эффективностью при лечении инфекции ЦМВЧ.
При этом лекарственный препарат включает в себя экстракт женьшеня, гинзенозид или производное гинзенозида и фармацевтически приемлемый носитель.
В частности, экстракт женьшеня выбирают из спиртового экстракта женьшеня и водного экстракта женьшеня, гинзенозид представляет собой все гинзенозиды корня женьшеня, гинзенозид типа панаксадиола и 20(R)-гинзенозид rg3, а производное гинзенозида представляет собой производное 20(R)-гинзенозида rg3.
В частности, производное гинзенозида rg3 представляет собой 20(R)-гинзенозид Rg3 8-N-бутират, имеющее молекулярную формулу C86H144O21 и структурную формулу, представленную в виде формулы (I):
(I)
При этом спиртовый экстракт женьшеня получают в результате следующих стадий:
1) равномерное перемешивание растения женьшеня обыкновенного (Panax ginseng C. A. Mey) с растворителем экстракции и обработка вымачиванием,
2) горячая экстракция вымачиваемой смеси женьшеня и растворителя экстракции, и фильтрование и сбор экстракционной жидкости,
3) концентрирование полученной экстракционной жидкости с получением экстракта, а затем сушка данного экстракта с получением спиртового экстракта женьшеня.
В частности, длительность обработки вымачиванием на стадии 1) составляет 30-60 мин, предпочтительно, 30 мин.
В частности, массовое соотношение лекарственного сырья женьшеня к растворителю экстракции составляет 1:8-12, предпочтительно 1:10.
Лекарственным сырьем женьшеня в настоящем изобретении также называют растение женьшень обыкновенный (Panax ginseng C. A. Mey).
В частности, растворитель экстракции представляет собой раствор этанола с объемной процентной концентрацией ≥50%, предпочтительно, 50-75%-ный раствор этанола.
При этом количество раз осуществления горячей экстракции на стадии 2) составляет 2-3 раза, предпочтительно 3 раза.
В частности, при каждом осуществлении горячей экстракции, массовое соотношение лекарственного сырья женьшеня к растворителю экстракции составляет 1:8-12, предпочтительно 1:8, температура каждого нагревания и экстракции составляет 60-80°С, предпочтительно, 70°С, а продолжительность горячей экстракции составляет 0,5-2 ч, предпочтительно, 1 ч.
При этом на стадии 3) температура концентрирования в процессе концентрирования составляет 65-85°С, предпочтительно, 80°С, относительная плотность концентрированного экстракта составляет 1,05-1,15, предпочтительно, 1,1, а температура сушки составляет 70-90°С, предпочтительно, 85°С.
В частности, содержание общего гинзенозида в спиртовом экстракте женьшеня составляет 2-5% (способ определения в соответствии с национальным стандартом: GB/T19506-2009 Appendix B).
При этом водный экстракт получают с использованием следующих стадий:
1) вымачивание женьшеня обыкновенного в воде,
2) декокционная экстракция вымоченной смеси женьшеня обыкновенного и воды, и фильтрование и сбор экстракционной жидкости,
3) концентрирование экстракционой жидкости с получением экстракта, а затем сушка экстракта с получением водного экстракта женьшеня.
В частности, на стадии 1), продолжительность обработки вымачиванием составляет 30-60 мин, предпочтительно, 30 мин.
В частности, массовое соотношение женьшеня обыкновенного и воды составляет 1:8-12, предпочтительно, 1:10.
При этом число раз проведения декокционной экстракции на стадии 2) составляет 2-3 раза, предпочтительно, 3 раза.
В частности, при каждом осуществлении декокционной экстракции, массовое соотношение лекарственного сырья женьшеня к растворителю экстракции составляет 1:8-12, предпочтительно 1:8, температура каждой декокционной экстракции составляет 90-100°С, предпочтительно, 90-95°С, а продолжительность декокционной экстракции составляет 0,5-2 ч, предпочтительно, 1 ч.
При этом температура на стадии 3) составляет 70-95°С, предпочтительно, 80°С, относительная плотность экстракта 1,05-1,15, предпочтительно, 1,1, а температура сушки составляет 70-95°С, предпочтительно, 85°С.
В частности, содержание общего гинзенозида в водном экстракте женьшеня составляет 2-5% (способ определения в соответствии с национальным стандартом: GB / T19506-2009 Appendix B).
При этом общий гинзенозид из корня женьшеня выделяют путем осуществления следующих стадий:
1) равномерное перемешивание лекарственного сырья женьшеня с растворителем экстракции и обработка вымачиванием,
2) горячая экстракция вымачиваемой смеси женьшеня и растворителя экстракции, и фильтрование и сбор экстракционной жидкости,
3) разделение жидкого экстракта женьшеня на макропористой смоле, и получение и объединение элюата с получением элюата женьшеня после колонки со смолой,
4) Концентрирование и сушка элюата женьшеня после колонки со смолой с получением общего гинзенозида из корня женьшеня.
В частности, обработка вымачиванием на стадии 1) составляет 30-60 мин, предпочтительно, 30 мин.
В особенности, массовое соотношение лекарственного сырья женьшеня к растворителю экстракции составляет 1:8-12, предпочтительно 1:10.
В частности, растворитель экстракции представляет собой раствор этанола с объемной процентной концентрацией ≥50%, предпочтительно, 50-75%-ный раствор этанола.
При этом число раз проведения горячей экстракции на стадии 2) составляет 2-3 раза, предпочтительно, 3 раза.
В частности, при каждом осуществлении горячей экстракции, массовое соотношение лекарственного сырья женьшеня к растворителю экстракции составляет 1:8-12, предпочтительно 1:8, температура каждой горячей экстракции составляет 60-80°С, предпочтительно, 70°С, а продолжительность горячей экстракции составляет 0,5-2 ч, предпочтительно, 1 ч.
В частности, данный способ включает в себя также концентрирование экстракта женьшеня, полученного на стадии 2), с получением концентрата женьшеня, а затем проведение разделения на колонке с макропористой смолой.
В особенности, концентрат женьшеня содержит, из расчета на миллилитр, 1-3,5 г сырого лекарственного сырья женьшеня/мл концентрата женьшеня, предпочтительно, 2,5 г сырого лекарственного сырья женьшеня/мл концентрата женьшеня.
При этом колоночная хроматография на макропористой смоле на стадии 3) состоит из следующих последовательных стадий: 3A) внесение жидкого экстракта женьшеня, а затем элюирование колонки с макропористой смолой водой в качестве элюата, и 3B) элюирование колонки с макропористой смолой раствором этанола с объемной концентрацией раствора этанола, составляющей 30% -50% (об./об.), в качестве элюата, сбор жидкости из колонки с макропористой смолой после элюирования с получением элюата женьшеня после разделения на смоле.
В частности, в процессе колоночной хроматографии на макропористой смоле, соотношение массы женьшеня в экстракте женьшеня к объему макропористой смолы составляло 1:0,8-2,5, предпочтительно, 1:1.
В частности, в процессе разделения на макропористой смоле, соотношение диаметра колонки с макропористой смолой к высоте колонки составляет 1:5-10, предпочтительно, 1:5-7, еще более предпочтительно, 1:5.5-5.9.
При этом макропористую адсорбционную смолу на стадии 3) выбирают из числа X-5, AB-8, NK-2, NKA-2, NK-9, D3520, D101 и WLD, предпочтительно, D101.
В частности, соотношение массы воды, использованной на стадии 3A), к объему колонки с макропористой смолой составляет 2-4: 1, предпочтительно, 4: 1, на стадии 3B) соотношение массы раствора этанола (30%-50%,об./об.) к объему макропористой смолы составляет 2-8:1, предпочтительно, 4-8:1, еще более предпочтительно, 8:1.
В особенности, на стадии 3B), объемная процентная концентрация раствора этанола, являющегося элюатом, составляет 50%.
При этом температура концентрирования на стадии 4) составляет 65-90°С, предпочтительно, 80°С, а температура сушки составляет 75-95°С, предпочтительно, 85°С.
В частности, содержание общего гинзенозида в общем гинзенозиде корня женьшеня составляет 20-50% (способ определения согласно национальному стандарту GB/T19506-2009 Appendix B).
При этом гинзенозид типа панаксадиола получают с использованием следующих стадий:
1) равномерное перемешивание лекарственного сырья женьшеня с растворителем экстракции и обработка вымачиванием с получением вымачиваемой смеси,
2) горячая экстракция вымачиваемой смеси женьшеня, и фильтрование и получение экстракционной жидкости,
3) хроматографическое разделение жидкого экстракта женьшеня на макропористой смоле, и получение и объединение элюата с получением первого элюата женьшеня после колонки со смолой,
4) второе хроматографическое разделение первого элюата женьшеня после колонки со смолой, и получение и объединение элюата с получением второго элюата женьшеня после колонки со смолой,
5) концентрирование и сушка второго элюата женьшеня после колонки со смолой с получением гинзенозида типа панаксадиола.
В частности, время вымачивания на стадии 1) составляет 30-60 мин, предпочтительно, 30 мин.
В частности, массовое соотношение лекарственного сырья женьшеня и растворителя экстракции составляет 1:8-12, предпочтительно, 1:10.
В частности, растворитель экстракции представляет собой раствор этанола с объемной процентной концентрацией ≥50%, предпочтительно, 50-75% раствор этанола.
При этом количество горячих экстракций на стадии 2) составляет 2-3, предпочтительно, 3.
В частности, в каждом процессе горячей экстракции массовое соотношение лекарственного сырья женьшеня и растворителя экстракции составляет 1:8-12, предпочтительно, 1:8, температура горячей экстракции каждый раз составляет 60-80°С, предпочтительно, 70°С, а продолжительность горячей экстракции составляет 0,5-2 ч, предпочтительно, 1 ч.
В частности, данный способ включает в себя также стадию 2A): концентрирование жидкого экстракта женьшеня, полученного на стадии 2) с получением концентрированной жидкости женьшеня, а затем разделение на колонке с макропористой смолой.
В частности, в концентрированной жидкости женьшеня содержится, из расчета на миллилитр, 1-3,5 г лекарственного сырья женьшеня, что эквивалентно 1-3,5 г лекарственного сырья женьшеня/мл концентрированной жидкости женьшеня, предпочтительно, 2,5 г лекарственного сырья женьшеня/мл концентрированной жидкости женьшеня.
При этом первая колоночная хроматография на макропористой смоле на стадии 3) включает в себя следующие последовательные стадии: 3A) внесение экстракционной жидкости женьшеня на колонку с макропористой смолой, а затем элюирование водой в качестве элюата, и 3B) элюирование колонки с макропористой смолой раствором этанола, где объемная процентная концентрация раствора этанола составляет 30%-50% (об./об), в качестве элюата, собирая жидкость с колонки с макропористой смолой после элюирования, получая первый элюат женьшеня после колонки со смолой.
В частности, во время колоночной хроматографии на макропористой смоле, соотношение массы женьшеня в экстракционной жидкости женьшеня к объему макропористой смолы составляет 1:0,8-2,5, предпочтительно, 1:1.
В частности, во время разделения на макропористой смоле, соотношение диаметра колонки к высоте колонки со смолой составляет 1:5-10, предпочтительно, 1:5-7, еще более предпочтительно, 1:5,5-5,9.
При этом макропористую адсорбционную смолу на стадии 3) выбирают из X-5, AB-8, NK-2, NKA-2, NK-9, D3520, D101 и WLD, предпочтительно, D101.
В частности, соотношение объема воды, используемой на стадии 3A), к объему колонки с макропористой смолой составляет 2-4: 1, предпочтительно, 4: 1, на стадии 3B соотношение объема раствора этанола (30%-50%, об./об.) к объему колонки с макропористой смолой составляет 2-8:1, предпочтительно, 4-8:1, еще более предпочтительно, 8:1.
В частности, на стадии 3B) объемная процентная концентрация раствора этанола, являющегося элюатом, составляет 50%.
В частности, данный способ включает в себя также концентрирование первого элюата женьшеня, собранного с колонки со смолой на стадии 3), с получением первой концентрированной жидкости женьшеня после обработки смолой, а затем второе хроматографическое разделение на макропористой смоле.
В частности, в первой концентрированной жидкости женьшеня после обработки смолой содержится, из расчета на миллилитр, 3,5-6 г лекарственного сырья женьшеня, что эквивалентно 3,5-6 г лекарственного сырья женьшеня/мл концентрированной жидкости женьшеня, предпочтительно, 5,0 г лекарственного сырья женьшеня/мл концентрированной жидкости женьшеня.
В частности, вторая колоночная хроматография на макропористой смоле на стадии 4) включает в себя последовательность следующих стадий: 4A) внесение первого элюата женьшеня после колонки со смолой на колонку с макропористой смолой, а затем элюирование раствором этанола (50-60%, об./об.) в качестве элюата, и 4B) элюирование раствором этанола (70-80%, об./об.) в качестве элюата, и сбор жидкости с колонки с макропористой смолой после элюирования, с получением второго элюата женьшеня после колонки со смолой.
В частности, во время второй колоночной хроматографии на макропористой смоле на стадии 4), соотношение массы женьшеня в первом элюате женьшеня после колонки со смолой к объему макропористой смолы составляет 1:0,8-2,5, предпочтительно, 1:1.
В частности, во время разделения на макропористой смоле, соотношение диаметра колонки с макропористой смолой к высоте колонки со смолой составляет 1:5-10, предпочтительно, 1:5-7, еще более предпочтительно, 1:5,5-5,9.
При этом макропористую адсорбционную смолу на стадии 4) выбирают из числа HPD-200, D203, XAD-4 и HPD-100, предпочтительно, HPD-100.
В частности, соотношение массы раствора этанола (50-60%, об./об.) на стадии 4А) к объему колонки с макропористой смолой составляет 2-4: 1, предпочтительно, 4: 1, а на стадии 4B) соотношение массы раствора этанола (70%-80%, об./об.) к объему колонки с макропористой смолой составляет 2-8:1, предпочтительно, 4-8:1, еще более предпочтительно, 8:1.
При этом температура концентрирования на стадии 5) составляет 65-95°С, предпочтительно, 80°С, а температура в процессе сушки составляет 70-95°С, предпочтительно, 85°С.
В частности, содержание общего сапонина панаксадиола (PDS) в гинзенозиде типа панаксадиола составляет 30-70% (способ определения: определение способами, описанными в приложении B национального стандарта GB/T19506-2009).
При этом содержание 20(R)-гинзенозида Rg3 составляет 1%-98%, предпочтительно, 30-80%, более предпочтительно, 60%.
В частности, содержание 20(R)-гинзенозида Rg3 составляет ≥1%, предпочтительно, ≥30%, более предпочтительно, ≥60%, еще более предпочтительно, ≥80%, намного более предпочтительно, ≥98%.
При этом содержание производного 20(R)-гинзенозида Rg3 составляет 1%-98%, предпочтительно, 30-80%, более предпочтительно, 60%.
В частности, содержание производного 20(R)-гинзенозида Rg3 составляет ≥1%, предпочтительно, ≥30%, более предпочтительно, ≥60%, еще более предпочтительно, ≥80%, намного более предпочтительно, ≥98%.
При этом содержание общего гинзенозида в спиртовом экстракте женьшеня составляет 2-5%, содержание общего гинзенозида в водном экстракте женьшеня составляет 2-5%, содержание общего гинзенозида в общем гинзенозиде, содержащемся в корне женьшеня, составляет 20-50%, а содержание сапонина панаксадиола в гинзенозиде типа панаксадиола составляет 30-70%.
В частности, профессионалы в области здравоохранения обычно считают, что фармацевтически приемлемый носитель способен достичь данной цели и выступать в качестве неактивного компонента лекарственных препаратов. Вещества, являющиеся фармацевтически приемлемыми носителями, описаны в справочниках, например, таких как Handbook of Pharmaceutical excipients, 2nd Edition, edited by A. Wade and P. J. Weller, опубликованном Фармацевтической ассоциацией США, Washington and the Pharmaceutical Press, London, 1994.
В частности, носители включают в себя эксципиенты, такие как крахмал, вода и т.д., смазывающие средства, такие как стеарат магния и т.д., разрыхлители, такие как микрокристаллическая целлюлозы и т.д., наполнители, такие как лактоза и т.д., связывающие вещества, такие как прежелатинизированный крахмал, декстрин и т.д., подсластители, антиоксиданты, и консерванты, вкусоароматические добавки, ароматизаторы и т.д.
При этом лекарственный препарат имеет форму таблеток, капсул, пилюль, порошка, гранул, сиропов, растворов, эмульсий, инъекций, спреев, аэрозолей, гелей, кремов, настоек, катаплазмы, резинового пластыря, или пластыря.
С другой стороны, в изобретении предоставлен лекарственный препарат или лекарственный продукт для лечения инфекционного заболевания, вызванного ЦМВЧ, содержащий экстракт женьшеня, гинзенозид или производное гинзенозида.
При этом экстракт женьшеня выбирают из спиртового экстракта женьшеня и водного экстракта женьшеня, гинзенозид представляет собой общий гинзенозид из корня женьшеня, гинзенозид типа панаксадиола и 20(R)-гинзенозид rg3, а производное гинзенозида представляет собой производное 20(R)-гинзенозида rg3.
В частности, производное гинзенозида rg3 представляет собой 20(R)-гинзенозид Rg3 8-N-бутират.
При этом содержание 20(R)-гинзенозида Rg3 составляет 1%-98%, предпочтительно,30-80%, более предпочтительно, 60%.
В частности, содержание 20(R)-гинзенозида Rg3 составляет ≥1%, предпочтительно, ≥30%, более предпочтительно, ≥60%, еще более предпочтительно, ≥80%, намного более предпочтительно, ≥98%.
При этом содержание производного 20(R)-гинзенозида Rg3 составляет 1%-98%, предпочтительно, 30-80%, более предпочтительно, 60%.
В частности, содержание производного 20(R)-гинзенозида Rg3 составляет ≥1%, предпочтительно, ≥30%, более предпочтительно, ≥60%, еще более предпочтительно, ≥80%, намного более предпочтительно, ≥98%.
При этом содержание общего гинзенозида в спиртовом экстракте женьшеня составляет 2-5%, содержание общего гинзенозида в водном экстракте женьшеня составляет 2-5%, содержание общего гинзенозида в общем гинзенозиде из корня женьшеня составляет 20-50%, а содержание сапонина панаксадиола в гинзенозиде типа панаксадиола составляет 30-70%.
В частности, соотношение массы экстракта женьшеня, гинзенозида или производного гинзенозида к общей массе лекарственного препарата или лечебного продукта составляет 0,01-10:100, предпочтительно, 0,1-10:100, более предпочтительно, 1-10:100.
В частности, лекарственный препарат или лечебный продукт также содержит один или более экстрактов из числа вьетнамского экстракта корня софоры (Radix Sophorae Tonkinensis), экстракта плода дурнишника (Fructus Xanthii), экстракт шлемника (Herba Scutellariae barbata), экстракт корня софоры желтеющей (Radix Sophorae flavescentis), экстракт корня одуванчика (Herba Taraxac), экстракт жимолости (Flos Lonicerae), экстракт имбиря (Zingiber officinale Rosc.), экстракт виноградных косточек, экстракт семян граната, витамин С и его производные, или витамин Е и его производные.
На основе данного лекарственного средства общеизвестным в данной области способом можно получить различные фармацевтические препараты, такие как таблетки, капсулы, пилюли, порошки, гранулы, сиропы, растворы, эмульсии, инъекции, спреи, аэрозоли, гели, кремы, настойки, катаплазм, резиновый пластырь или пластырь.
В настоящем изобретении также предоставлен способ лечения инфекционного заболевания, вызванного ЦМВЧ, включающий в себя введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтического препарата на основе экстракта женьшеня, гинзенозида или производного гинзенозида, при этом терапевтически эффективная доза составляет 0,6-12 мг/кг·сутки, предпочтительно, 1-6 мг/кг·сутки, более предпочтительно, 1,5-3 мг/кг·сутки.
Если не указано иначе, использованный в настоящем описании термин «терапевтически эффективная доза» означает дозу лекарственного препарата, желательную для получения эффективного результата, при этом «терапевтически эффективную дозу» можно регулировать и изменять, в конечном итоге она определяется медицинским персоналом в зависимости от рассматриваемых факторов, включая способ введения, свойство препарата, массу пациента, возраст и другие факторы общего состояния, а также природу и тяжесть заболеваний, подлежащих лечению.
По сравнению с предшествующей областью, настоящее изобретение обладает следующими очевидными преимуществами:
1. В изобретении установлено новое медицинское свойство экстрактов женьшеня, гинзенозида или производных гинзенозида, которые применяются для лечения заболеваний, связанных с инфекцией ЦМВЧ. Данные заболевания включают в себя инфекцию ЦМВЧ у пациентов в ходе лечения сердечно-сосудистых и цереброваскулярных заболеваний, трансплантации органов, перинатального периода, опухолей, ожогов, СПИДа и других заболеваний, в частности, инфекцию ЦМВЧ в состояниях иммунодефицита или подавления иммунитета после лечения иммунодепрессантами в ходе трансплантации органов и пересадки костного мозга, а также у пациентов, проходящих курс лучевой терапии и химиотерапии. Кроме того, экстракты женьшеня, гинзенозид или производные гинзенозида могут применяться для получения лекарственных препаратов или лечебных продуктов для лечения инфекции ЦМВЧ, что открывает, таким образом, новую область применения медицинских материалов на основе женьшеня.
2. На основании ряда экспериментальных исследований, проведенных в рамках настоящего изобретения, показано, что экстракты женьшеня, гинзенозид или производные гинзенозида обладают прекрасным эффектом для предупреждения и лечения инфекции ЦМВЧ.
3. Экстракты женьшеня, гинзенозид или производные гинзенозида по настоящему изобретению обладают сильным фармакологическим действием, прекрасным эффектом при лечении инфекции ЦМВЧ, быстрым откликом, небольшими токсическими или побочными эффектами, высокой безопасностью, а также хорошей перспективой применения в медицине, и могут применяться в течение длительного времени.
4. Продукты настоящего изобретения имеют богатые и дешевые ресурсы для получения, безопасное клиническое применение, простой способ получения и небольшую дозировку, на их основе можно получить различные препараты, а также они удобны в использовании, за счет чего достигается легкая популяризация.
5. В настоящем изобретении экстракты женьшеня, гинзенозид или производные гинзенозида можно использовать для получения лекарственных средств для лечения инфекции ЦМВЧ, и экстракты женьшеня, гинзенозид или производные гинзенозида можно соединить с другими активными ингредиентами (такими как один или более экстрактов из числа вьетнамского экстракта корня софоры, экстракта плодов дурнишника сибирского, экстракта шлемника, экстракт корня софоры желтеющей, экстракт корня одуванчика (Herba Taraxac), экстракт цветов жимолости, экстракт имбиря, экстракт виноградных косточек, экстракт семян граната, витамин С и его производные, получая медицинские вещества для лечения инфекции ЦМВЧ.
Осуществление изобретения
Далее преимущества настоящего изобретения описаны с использованием конкретных вариантов осуществления. Данные примеры являются лишь иллюстративными и не предназначены для ограничения рамок изобретения. Специалистам в данной области должно быть понятно, что можно модифицировать или изменять детали и формы в техническом решении настоящего изобретения, не выходя из концепции и рамок применения препаратов изобретения, однако все эти модификации и изменения входят в рамки настоящего изобретения.
Вариант осуществления 1 получение спиртового экстракта женьшеня
1. Первая экстракция
Женьшень (300 г) и раствор этанола (3000 г) с объемным процентным содержанием этанола 70% (об./об.) помещали в многофункциональный резервуар для экстрагирования, используемый в традиционной китайской медицине. После вымачивания в течение 30 мин, в многофункциональном резервуаре для экстрагирования включали нагревание, осуществляя первую горячую экстракцию лекарственного материала женьшеня. Первый процесс горячей экстракции проводили при 70°С в течение 1 ч, а затем осуществляли фильтрование, получая первую экстракционную жидкость и первые остатки женьшеня, при этом массовое соотношение женьшеня и растворителя экстракции (раствор этанола) составляло 1:10.
В настоящем изобретении для изобретения подходят все остальные соотношения женьшеня и растворителя экстракции от 1:8-12, кроме массового соотношения (1:10), для изобретения подходят любое другое время вымачивания ≥30 мин, кроме времени вымачивания, составляющего 30 мин, предпочтительно, 30-60 мин, для изобретения подходят любые другие растворы этанола с объемной процентной концентрацией ≥50%, кроме раствора этанола (70%, об./об.), предпочтительно, раствор этанола с объемной процентной концентрацией 50-75% и абсолютный этанол, и для изобретения подходит температура экстракции 60-80°С и продолжительность экстракции 0,5-2 ч.
2. Вторая экстракция
Добавление раствора этанола (70%, об./об.) к первым остаткам женьшеня, нагревание смеси, осуществление второй горячей экстракции лекарственного материала женьшеня при 70°С в течение 1 ч, а затем фильтрование с получением второй экстракционной жидкости и вторых остатков женьшеня, при этом массовое соотношение женьшеня и растворителя экстракции составляет 1:10.
3. Третья экстракция
Добавление раствора этанола (70%, об./об.) ко вторым остаткам женьшеня, нагревание смеси, осуществление третьей горячей экстракции лекарственного материала женьшеня при 70°С в течение 1 ч, а затем фильтрование с получением третьей экстракционной жидкости, при этом массовое соотношение женьшеня и растворителя экстракции составляет 1:10.
В данном варианте осуществления изобретения для изобретения подходят любые другие растворы этанола с объемной процентной концентрацией ≥50%, кроме раствора этанола с объемной процентной концентрацией 70%, предпочтительно, раствор этанола с концентрацией 70% и абсолютный этанол, для изобретения подходят все температуры экстракции от 60-80°С, и для изобретения подходят любая продолжительность экстракции 0,5-2 ч.
В данном варианте осуществления изобретения горячую экстракцию повторяют 3 раза, а для изобретения подходят любое количество раз от 2-3.
4. Конденсация и сушка
Объединение первой, второй и третьей экстракционных жидкостей, полученных после фильтрования, помещение объединенных экстракционных жидкостей в роторный испаритель, а затем их концентрирование путем упаривания при температуре 80°С с получением экстракта с относительной плотностью 1:1, а потом сушка данного экстракта до постоянной массы в печи при температуре 85°С, с получением спиртового экстракта женьшеня.
Спиртовый экстракт женьшеня представляет собой коричневато-желтый порошок с характерным запахом, растворимый в этаноле. Содержание общего гинзенозида в спиртовом экстракте женьшеня, определенное методами национального стандарта (женьшень с горы Чанбай провинции Цзилинь, продукт с географическим указанием, получаемый методами приложения B GB/T19506-2009), составляет 3%.
В процессе конденсации спиртового экстракта женьшеня по настоящему изобретению, для изобретения подходит температура конденсации 65-85°С и относительная плотность 1,05-1,15 концентрированного экстракта, для изобретения подходит температура высушивания 70-90°С. Содержание общего гинзенозида в спиртовом экстракте женьшеня, полученном способом изобретения, составляет 2-5%.
Вариант осуществления 2. Получение водного экстракта женьшеня
1. Обработка вымачиванием
Поместить измельченный женьшень (300 г) и водопроводную воду в качестве растворителя экстракции (3000 г) в многофункциональный резервуар для экстракции, используемый в традиционной китайской медицине, при равномерном перемешивании, а затем вымачивании, при этом массовое соотношение женьшеня и воды составляет 1:10.
Во время получения водного экстракта женьшеня по настоящему изобретению, для изобретения подходит любая продолжительность вымачивания ≥30 мин, предпочтительно, 30-60 мин, и для изобретения подходят все прочие массовые соотношения женьшеня и воды, такие как 1:8-12, кроме 1:10.
2. Первая экстракция
После вымачивания в течение 30 мин в многофункциональном резервуаре для экстракции включают нагревание для осуществления первой декокционной экстракции лекарственного материала женьшеня, проводя экстракцию при 95°С в течение 1 ч, а затем осуществляя фильтрование с получением первой экстракционной жидкости и первых остатков женьшеня.
3. Вторая экстракция
Добавление водопроводной воды к первым остаткам женьшеня, нагревание смеси, осуществление второй декокционной экстракции лекарственного материала женьшеня, проводя экстракцию при 90°С в течение 1 ч, а затем осуществляя фильтрование с получением второй экстракционной жидкости и вторых остатков женьшеня, при этом массовое соотношение женьшеня и растворителя экстракции составляет 1:10.
4. Третья экстракция
Добавление водопроводной воды ко вторым остаткам женьшеня, нагревание смеси, осуществление третьей декокционной экстракции лекарственного материала женьшеня, с осуществлением экстракции при 90°С в течение 1 ч, а затем фильтрования с получением третьей экстракционной жидкости, при этом массовое соотношение женьшеня и растворителя экстракции составляет 1:10.
В данном варианте осуществления изобретения, для изобретения подходят любые массовые соотношения лекарственного материала женьшеня и растворителя экстракции в первом, втором и третьем процессах получения водного экстракта женьшеня, такие как 1:8-12, кроме 1:10, для изобретения подходят любая температура экстракции от 90-100°С, предпочтительно, 90-95°С, и для изобретения подходят любая продолжительность экстракции при нагревании от 0,5-2 ч, предпочтительно, 1 ч.
В варианте осуществления настоящего изобретения, количество раз осуществления экстракции при нагревании в способе получения водного экстракта женьшеня составляет 3, и для изобретения подходит любое число раз осуществления экстракции от 2-3.
5. Конденсация и сушка
Объединение первой, второй и третьей экстракционных жидкостей, полученных в результате трех фильтрований, помещение их в роторный испаритель, а затем их концентрирование путем упаривания при температуре 80°С, с получением экстракта с относительной плотностью 1:1, а после этого сушка экстракта до постоянной массы в печи при температуре 85°С, с получением водного экстракта женьшеня.
Водный экстракт женьшеня представляет собой коричневато-желтый порошок с характерным запахом, хорошо растворимый в воде. Содержание общего гинзенозида в водном экстракте женьшеня, определенное методами национального стандарта (приложение B GB/T19506-2009), составляет 2%.
Во время конденсации водного экстракта женьшеня в настоящем изобретении для изобретения подходит как температура конденсации 70-95°С, так и относительная плотность от 1,05-1,15 концентрированного экстракта, а также для изобретения подходит любая температура высушивания от 70-95°С. Содержание общего гинзенозида в водном экстракте женьшеня, полученного способом настоящего изобретения, составляет 2-5%.
Вариант осуществления 3. Получение общего гинзенозида из корня женьшеня
1. Первая экстракция
По аналогии с вариантом осуществления 1
2. Вторая экстракция
Аналогично варианту осуществления 1
3. Третья экстракция
Аналогично варианту осуществления 1
4. Концентрирование
Объединение первой, второй и третьей экстракционных жидкостей, полученных после трех фильтрований, помещение данной смеси в роторный испаритель, а затем концентрирование смеси упариванием при температуре 80°С, с получением концентрированной жидкости женьшеня (120 мл), что эквивалентно 2,5 г сырого лекарственного средства (вещества женьшеня) /мл раствора женьшеня.
В процессе концентрирования по настоящему изобретению, для настоящего изобретения подходит другая концентрированная жидкость, содержащая женьшень, эквивалентная 1-3,5 г сырого лекарственного вещества (т.е. 1-3,5 г сырого лекарственного вещества/мл) на мл, отличающаяся от жидкости, содержащей 2,5 г сырого лекарственного вещества на мл концентрированной жидкости, содержащей женьшень.
5. Колоночная хроматография на макропористой смоле
Внесение концентрированной жидкости женьшеня на колонку с макропористой смолой для разделения, где макропористая смола представляет собой макропористую адсорбционную смолу D101, а соотношение объема (300 мл) смолы в колонке со смолой к массе (масса сухого вещества) женьшеня составляет 1:1 (то есть если масса сухого вещества женьшеня составляет 1 кг, то объем макропористой смолы составляет 1 л, а если масса сухого лекарственного вещества составляет 1 г, то объем макропористой смолы составляет 1 мл). Элюирование водой в объеме, превышающем объем колонки в 4 раза, после полного внесения концентрированной надосадочной жидкости в колонку со смолой, и отбрасывание элюата, элюирование раствором этанола (50%, об./об.) в объеме, превышающем объем колонки в 8 раз, и сбор элюата с получением элюата женьшеня после макропористой смолы.
В процессе колоночной хроматографии концентрированной жидкости женьшеня на макропористой смоле соотношение массы женьшеня (неочищенного лекарственного средства) в экстракционной жидкости женьшеня к объему макропористой смолы составляет 1:0,8-2,5, что подходит для настоящего изобретения, для настоящего изобретения подходят другие типы макропористой абсорбционной смолы, такие как X-5, AB-8, NK-2, NKA-2, NK-9, D3520, D101 и WLD, кроме D101, соотношение массы воды к объему колонки с макропористой смолой составляет 2-4:1, что подходит для настоящего изобретения, при элюировании раствором этанола для настоящего изобретения подходят все остальные объемные процентные концентрации раствора этанола в интервале 30%-50%, кроме 50%, а объемное соотношение раствора этанола к макропористой смоле составляет 2-4:1, что подходит для настоящего изобретения.
6. Концентрирование и сушка
Помещение элюата женьшеня после колонки со смолой в роторный испаритель и, в вакууме, в результате концентрирования при температуре 80°С, с повторным использованием растворителя, помещения остатков в сушильную камеру и сушки при температуре 85°С, получение 2,6 г общего гинзенозида из корня женьшеня.
Общий гинзенозид из корня женьшеня представляет собой коричневато-желтый порошок с характерным запахом. Содержание полученного общего гинзенозида в общем гинзенозиде из корня женьшеня составляет 32%, при определении методами, описанными в приложении B GB/T19506-2009.
В данном варианте осуществления изобретения, для изобретения подходят все остальные массовые соотношения лекарственного материала женьшеня и растворителя экстракции в первом, втором и третьем процессах получения водного экстракта женьшеня, такие как 1:8-12, кроме 1:10, для изобретения подходит любая температура экстракции от 90-100°С, предпочтительно, 90-95°С, и для изобретения подходит любая продолжительность экстракции при нагревании от 0,5-2 ч, предпочтительно, 1 ч.
В процессе концентрирования элюата женьшеня после колонки со смолой по настоящему изобретению, для изобретения подходит любая температура концентрирования в интервале 65-90°С, любая температура сушки в интервале 70-90°С. Содержание общего гинзенозида, полученного способом настоящего изобретения, составляет 20-50%.
Вариант осуществления 4. Получение гинзенозида типа панаксадиола
1. Первая экстракция
Аналогично варианту осуществления 3
2. Вторая экстракция
Аналогично варианту осуществления 3
3. Третья экстракция
Аналогично варианту осуществления 3
4. Концентрирование
Аналогично варианту осуществления 3
5. Первая колоночная хроматография на макропористой смоле
Аналогично варианту осуществления 3, с получением первого элюата женьшеня после колонки со смолой.
Внесение концентрированной жидкости женьшеня на колонку с макропористой смолой для разделения, где макропористая смола представляет собой макропористую адсорбционную смолу D101, а соотношение объема (300 мл) смолы в колонке со смолой к массе (масса сухого вещества) женьшеня составляет 1:1 (то есть если масса сухого вещества женьшеня составляет 1 кг, то объем макропористой смолы составляет 1 л, а если масса сухого лекарственного вещества составляет 1 г, то объем макропористой смолы составляет 1 мл). Элюирование водой в объеме, превышающем объем колонки в 4 раза, после полного внесения концентрированного супернатанта в колонку со смолой, и отбрасывание элюата, элюирование раствором этанола (50%, об./об.) в объеме, превышающем объем колонки в 8 раз, и сбор элюата с получением первого элюата женьшеня после макропористой смолы.
6. Вторая колоночная хроматография на макропористой смоле
Помещение первого элюата женьшеня после колонки со смолой в роторный испаритель и, в результате концентрирования при температуре 80°С, получение первой концентрированной жидкости (60 мл), соответствующей 5,0 г неочищенного лекарственного вещества/мл раствора женьшеня.
Внесение образца первой концентрированной жидкости женьшеня после колонки со смолой на колонку с макропористой смолой для разделения, где макропористая смола представляет собой макропористую адсорбционную смолу HPD-100, а соотношение объема (300 мл) смолы в колонке со смолой к массе (масса сухого вещества) женьшеня составляет 1:1 (то есть если масса сухого вещества женьшеня составляет 1 кг, то объем макропористой смолы составляет 1 л, а если масса сухого лекарственного вещества составляет 1 г, то объем макропористой смолы составляет 1 мл). Элюирование раствором этанола (60%, об./об.) в объеме, превышающем объем колонки в 8 раз, после полного внесения концентрированного супернатанта в колонку со смолой, и отбрасывание элюата, и элюирование раствором этанола (80%, об./об.) в объеме, превышающем объем колонки в 8 раз, и сбор элюата с получением второго элюата женьшеня после макропористой смолы.
В процессе концентрирования по настоящему изобретению, для изобретения подходит любая концентрация первой концентрированной жидкости женьшеня после колонки со смолой, эквивалентная 3,5-6 г неочищенного лекарственного вещества (т.е. 3,5-6 г неочищенного лекарственного вещества/мл) на мл, отличающаяся от 5,0 г неочищенного лекарственного вещества на мл первой концентрированной жидкости женьшеня после колонки со смолой.
В процессе колоночной хроматографии первой концентрированной жидкости женьшеня после колонки со смолой на колонке с макропористой смолой, соотношение массы женьшеня (неочищенного лекарственного вещества) в первой концентрированной жидкости женьшеня после колонки со смолой к объему макропористой смолы составляет 1:0,8-2,5, что подходит для настоящего изобретения, для настоящего изобретения подходят другие типы макропористой адсорбционной смолы, такие как HPD-200, D203 и XAD-4, кроме HPD-100, при элюировании 60%-ным раствором этанола объемное соотношение раствора этанола (60%, об./об.) и макропористой смолы составляет 2-4:1, что подходит для настоящего изобретения, и при элюировании 80%-ным раствором этанола объемное соотношение раствора этанола (80%, об./об.) и макропористой смолы составляет 2-4:1, что подходит для настоящего изобретения.
7. Концентрирование и сушка
Помещение второго элюата женьшеня после колонки с макропористой смолой в роторный испаритель и, в вакууме, в результате концентрирования при температуре 80°С, с повторным использованием растворителя, помещения остатков в сушильную камеру и сушки при температуре 85°С, получение 0,7 г общего гинзенозида типа панаксадиола.
Общий гинзенозид типа панаксадиола представляет собой светло-желтый порошок с характерным запахом и хорошей растворимостью в воде. Содержание полученного общего гинзенозида типа панаксадиола определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в соответствии с методами, описанными в приложении B VI Китайской фармакопеи I (версия 2010 г.). Содержание гинзенозида типа панаксадиола составляет 59%.
В процессе концентрирования элюата женьшеня после колонки с макропористой смолой по настоящему изобретению, для изобретения подходит любая температура концентрирования в интервале 65-90°С, и для изобретения подходит любая температура высушивания в интервале 70-95°С. Содержание сапонина панаксадиола (PDS) в гинзенозиде типа панаксадиола, полученном способом настоящего изобретения, составляет 30-70%.
Вариант осуществления 5. Таблетка на основе спиртового экстракта женьшеня
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
составляет 2%)
2. Перемешать спиртовый экстракт женьшеня и крахмал до однородности, затем получить из смеси гранулы, добавить порошок талька и стеарата магния, при перемешивании до однородности, а после этого осуществить прессование смеси, получая 10000 таблеток.
Вариант осуществления 6. Таблетка на основе спиртового экстракта женьшеня
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Перемешать спиртовый экстракт женьшеня и крахмал до однородности, затем получить из смеси гранулы, добавить порошок талька и стеарата магния, при перемешивании до однородности, а после этого осуществить прессование смеси, получая 10000 таблеток.
Вариант осуществления 7. Таблетка на основе спиртового экстракта женьшеня
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Перемешать спиртовый экстракт женьшеня и крахмал до однородности, затем получить из смеси гранулы, добавить порошок талька и стеарат магния, перемешивания до однородности, а после этого осуществить прессование смеси, получая 10000 таблеток.
Вариант осуществления 8. Капсула на основе спиртового экстракта женьшеня
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Смешать спиртовый экстракт женьшеня, вьетнамского экстракта корня софоры, витамина С и крахмала, а затем заполнение данной смесью капсул, получая 10000 капсул.
Вариант осуществления 9. Гранулы на основе спиртового экстракта женьшеня
1. Приготовление сырья в соответствии со следующими массовыми соотношениями:
2. Смешать спиртовый экстракт женьшеня, экстракт имбиря, витамин С и порошкообразную сахарозы до однородности, получить из смеси гранула, а затем расфасовать гранулы по пакетам, получая 10000 пакетов.
Вариант осуществления 10. Жидкость для перорального приема на основе спиртового экстракта женьшеня
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Растворить спиртовый экстракт женьшеня в небольшом объеме этанола, добавить экстракт шлемника, экстракт корня софоры желтеющей и сироп глюкозы в раствор и, наконец, добавить деионизированную воду до 100 мл, получая жидкость для перорального приема на основе спиртового экстракта женьшеня.
Вариант осуществления 11. Таблетка на основе водного экстракта женьшеня
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Равномерно перемешать водный экстракт женьшеня и крахмал, затем получить из данной смеси гранулы, добавляя порошкообразный тальк и стеарат магния, а после этого осуществить прессование смеси, получая 10000 таблеток.
Вариант осуществления 12. Таблетка на основе водного экстракта женьшеня
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Равномерно перемешать водный экстракт женьшеня и крахмал, затем получить из данной смеси гранулы, добавить порошкообразный тальк и стеарат магния, перемешивая до однородности, а после этого осуществить прессование смеси, получая 10000 таблеток.
Вариант осуществления 13. Таблетка на основе водного экстракта женьшеня
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Равномерно перемешать водный экстракт женьшеня и крахмал, затем получить из данной смеси гранулы, добавить порошкообразный тальк и стеарат магния, перемешивая до однородности, а после этого осуществить прессование смеси, получая 10000 таблеток.
Вариант осуществления 14. Капсула на основе водного экстракта женьшеня
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Смешать водный экстракт женьшеня, вьетнамский экстракт корня софоры, витамин С и крахмал, затем заполнить данной смесью капсулы, получая 10000 капсул.
Вариант осуществления 15. Гранулы на основе водного экстракта женьшеня
1. Приготовление сырья в соответствии со следующими массовыми соотношениями:
2. Смешать водный экстракт женьшеня, экстракт имбиря, витамин С и порошкообразную сахарозу до однородности, получить из данной смеси гранулы, а затем расфасовать смесь по пакетам, получая 10000 пакетов.
Вариант осуществления 16. Жидкость для перорального приема на основе водного экстракта женьшеня
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Растворить водный экстракт женьшеня в небольшом объеме этанола, добавить экстракт шлемника, экстракт корня софоры желтеющей и сироп глюкозы в раствор и, наконец, добавить деионизированную воду до 100 мл, получая жидкость для перорального приема на основе водного экстракта женьшеня.
Вариант осуществления 17. Таблетка на основе общего гинзенозида корня женьшеня
1. Приготовление сырья в соответствии со следующими массовыми соотношениями:
2. Равномерно перемешать общий гинзенозид женьшеня и крахмал, затем получить из данной смеси гранулы, добавить порошкообразный тальк и стеарат магния, перемешивая до однородности, а после этого осуществить прессование смеси, получая 10000 таблеток.
Вариант осуществления 18. Таблетка на основе общего гинзенозида корня женьшеня
1. Приготовление сырья в соответствии со следующими массовыми соотношениями:
2. Равномерно перемешать общий гинзенозид женьшеня и крахмал, затем получить из данной смеси гранулы, добавить порошкообразный тальк и стеарат магния, перемешивая до однородности, а после этого осуществить прессование смеси, получая 10000 таблеток.
Вариант осуществления 19. Таблетка на основе общего гинзенозида корня женьшеня
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Равномерно перемешать общий гинзенозид женьшеня и крахмал, затем получить из данной смеси гранулы, добавить порошкообразный тальк и стеарат магния, перемешивая до однородности, а после этого осуществить прессование смеси, получая 10000 таблеток.
Вариант осуществления 20. Капсула на основе общего гинзенозида корня женьшеня
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Смешать общий гинзенозид женьшеня, вьетнамский экстракт корня софоры, витамин С и крахмал, затем заполнить данной смесью капсулы, получая 10000 капсул.
Вариант осуществления 21. Гранулы на основе общего гинзенозида корня женьшеня
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Смешать общий гинзенозид женьшеня, экстракт шлемника, витамин С и порошкообразную сахарозу до однородности, получить из данной смеси гранулы, а затем расфасовать гранулы по пакетам, получая 10000 пакетов.
Вариант осуществления 22. Жидкость для перорального приема на основе общего гинзенозида корня женьшеня
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Растворить общий гинзенозид корня женьшеня в небольшом объеме этанола, добавить экстракт шлемника, экстракт корня софоры желтеющей и сироп глюкозы в раствор и, наконец, добавить деионизированную воду до 100 мл, получая жидкость для перорального приема на основе общего гинзенозида.
Вариант осуществления 23. Таблетка на основе гинзенозида типа панаксадиола
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Равномерно перемешать гинзенозид типа панаксадиола и крахмал, затем получить из данной смеси гранулы, добавить порошкообразный тальк и стеарат магния, перемешивая до однородности, а после этого осуществить прессование смеси, получая 10000 таблеток.
Вариант осуществления 24. Таблетка на основе гинзенозида типа панаксадиола
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Равномерно перемешать гинзенозид типа панаксадиола и крахмал, затем получить из данной смеси гранулы, добавить порошкообразный тальк и стеарат магния, перемешивая до однородности, а после этого осуществить прессование смеси, получая 10000 таблеток.
Вариант осуществления 25. Таблетка на основе гинзенозида типа панаксадиола
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Равномерно перемешать гинзенозид типа панаксадиола и крахмал, затем получить из данной смеси гранулы, добавить порошкообразный тальк и стеарат магния, перемешивая до однородности, а после этого осуществить прессование смеси, получая 10000 таблеток.
Вариант осуществления 26. Таблетка на основе гинзенозида типа панаксадиола
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Смешать гинзенозид типа панаксадиола, вьетнамский экстракт корня софоры, витамин С и крахмал, затем заполнить данной смесью капсулы, получая 10000 капсул.
Вариант осуществления 27. Гранулы на основе гинзенозида типа панаксадиола
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Смешать гинзенозид типа панаксадиола, экстракт имбиря, витамин С и порошкообразную сахарозу до однородности, получить из данной смеси гранулы, а затем расфасовать гранулы по пакетам, получая 10000 пакетов.
Вариант осуществления 28. Жидкость для перорального приема на основе гинзенозида типа панаксадиола
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Растворить гинзенозид типа панаксадиола в небольшом объеме этанола, добавить экстракт шлемника, экстракт корня софоры желтеющей и сироп глюкозы в раствор и, наконец, добавить деионизированную воду до 100 мл, получая жидкость для перорального приема на основе гинзенозида типа панаксадиола.
Вариант осуществления 29. Таблетка на основе гинзенозида rg3
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Равномерно перемешать гинзенозид rg3 и крахмал, затем получить из данной смеси гранулы, добавить порошкообразный тальк и стеарат магния, перемешивая до однородности, а после этого осуществить прессование смеси, получая 10000 таблеток.
Вариант осуществления 30. Таблетка на основе гинзенозида rg3
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Равномерно перемешать гинзенозид rg3 и крахмал, затем получить из данной смеси гранулы, добавить порошкообразный тальк и стеарат магния, перемешивая до однородности, а после этого осуществить прессование смеси, получая 10000 таблеток.
Вариант осуществления 31. Таблетка на основе гинзенозида rg3
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Равномерно перемешать гинзенозид rg3 и крахмал, затем получить из данной смеси гранулы, добавить порошкообразный тальк и стеарат магния, перемешивая до однородности, а после этого осуществить прессование смеси, получая 10000 таблеток.
Вариант осуществления 32. Капсула на основе гинзенозида rg3
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Смешать гинзенозид rg3, вьетнамский экстракт корня софоры, витамин С и крахмал, затем заполнить данной смесью капсулы, получая 10000 капсул.
Вариант осуществления 33. Гранулы на основе гинзенозида rg3
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Смешать гинзенозид rg3, экстракт имбиря, витамин С и порошкообразную сахарозу до однородности, получить из данной смеси гранулы, а затем расфасовать гранулы по пакетам, получая 10000 пакетов.
Вариант осуществления 34. Жидкость для перорального приема на основе гинзенозида rg3
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Растворить гинзенозид rg3 в небольшом объеме этанола, добавить экстракт шлемника, экстракт корня софоры желтеющей и сироп глюкозы в раствор и, наконец, добавить деионизированную воду до 100 мл, получая жидкость для перорального приема на основе гинзенозида rg3.
Вариант осуществления 35. Таблетка на основе производного гинзенозида rg3 (20(R)-гинзенозид Rg3 8-N-бутирата)
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Равномерно перемешать производное гинзенозида rg3 и крахмал, затем получить из данной смеси гранулы, добавить порошкообразный тальк и стеарат магния, перемешивая до однородности, а после этого осуществить прессование смеси, получая 10000 таблеток.
Вариант осуществления 36. Таблетка на основе производного гинзенозида rg3 (20(R)-гинзенозид Rg3 8-N-бутирата)
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Равномерно перемешать производное гинзенозида rg3 и крахмал, затем получить из данной смеси гранулы, добавить порошкообразный тальк и стеарат магния, перемешивая до однородности, а после этого осуществить прессование смеси, получая 10000 таблеток.
Вариант осуществления 37. Таблетка на основе производного гинзенозида rg3 (20(R)-гинзенозид Rg3 8-N-бутирата)
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Равномерно перемешать производное гинзенозида rg3 и крахмал, затем получить из данной смеси гранулы, добавить порошкообразный тальк и стеарат магния, перемешивая до однородности, а после этого осуществить прессование смеси, получая 10000 таблеток.
Вариант осуществления 38. Капсула на основе производного гинзенозида rg3 (20(R)-гинзенозид Rg3 8-N-бутирата)
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Смешать производное гинзенозида rg3, вьетнамский экстракт корня софоры, витамин С и крахмал, затем заполнить данной смесью капсулы, получая 10000 капсул.
Вариант осуществления 39. Гранулы на основе производного гинзенозида rg3 (20(R)-гинзенозид Rg3 8-N-бутирата)
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Смешать производное гинзенозида rg3, экстракт имбиря, витамин С и порошкообразную сахарозу до однородности, получить из данной смеси гранулы, а затем расфасовать гранулы по пакетам, получая 10000 пакетов.
Вариант осуществления 40. Жидкость для перорального приема на основе производного гинзенозида rg3 (20(R)-гинзенозид Rg3 8-N-бутирата)
1. Приготовление сырья в соответствии со следующим массовым соотношением:
2. Растворить производное гинзенозида rg3 в небольшом объеме этанола, добавить экстракт шлемника, экстракт корня софоры желтеющей и сироп глюкозы в раствор и, наконец, добавить деионизированную воду до 100 мл, получая жидкость для перорального приема на основе производного гинзенозида rg3.
Тестовый пример 1. Влияние экстракта женьшеня, гинзенозида и его производных на иммунную функцию мышей, инфицированных ЦМВЧ.
1. Экспериментальные материалы
1.1 Животные, вирусы и клетки
Мыши линии Kunming (масса: 18-22 г), половина из них - самцы и половина - самки, предоставлены Центром исследования животных Китайского медицинского университета Чжецзяне, номер лицензии SCXK (Шанхай) 2008-00l6.
Вирусы и клетки: стандартные штаммы HCMVADl69 и эмбриональные фибробласты легких человека (HEL), предоставленные лабораторией вирусологии Шаньдунской академии медицинских наук.
Моноклональные антитела к цитомегаловирусу человека (HCMVMcAb) получены от диагностической лаборатории Института Вирусологии Китайской Академии превентивной медицины, и представляют собой моноклональные антитела к ранним антигенам. Использовали ELISA (иммуносорбетный ферментный анализ) с титром рабочего раствора l×10-5.
1.2 Лекарственные средства
Спиртовые экстракты женьшеня: коричневато-желтый порошок, содержащий 3% общего гинзенозида, производства Dalian Fusheng Natural Medicine Development Co., Ltd., номер партии 20120601,
Водные экстракты женьшеня: коричневато-желтый порошок, содержащий 2% общего гинзенозида, производства Dalian Fusheng Natural Medicine Development Co., Ltd., номер партии 20120602,
Общий гинзенозид из корня женьшеня: коричневато-желтый порошок, содержащий 32% общего гинзенозида, производства Dalian Fusheng Natural Medicine Development Co., Ltd., номер партии 20120502;
Гинзенозид типа панаксадиола: светло-желтый порошок, содержащий 59% сапонина панаксадиола PDS), производства Dalian Fusheng Natural Medicine Development Co., Ltd., номер партии 20120403,
20(R)-Гинзенозид Rg3 (содержание: >98%) производится Dalian Fusheng Natural Medicine Development Co., Ltd., номер партии 20120303, по сравнению со стандартным продуктом, предоставляемым Национальным Институтом по контролю лекарственных препаратов и продуктов питания и медикаментами КНР, и при измерении методом ВЭЖХ, содержание соответствует калибровочному значению, а измеренное значение составляет 98,2%,
Производные гинзенозида Rg3 (20(R)-гинзенозид Rg3 8-N-бутират) получены Dalian Fusheng Natural Medicine Development Co., Ltd., и измерены методом нормализации площадей при помощи двух детекторов для ВЭЖХ, а именно, УФ-детектора и испарительного нефелметрического детектора соответственно, с чистотой 99,6%.
Лекарственный препарат положительного контроля: ганцикловир (описание: 250 мг, Lizhu Group Hubei Keyi Pharmaceutical Co., Ltd., номер партии: 020506), клиническая суточная доза 45,5 мг/кг массы тела.
1.3 Стандартный штамм вируса HCMVADl69 и пролиферацию видов вводят в октябре 1999 г. из отдела посевного материала Института Вирусологии Китайской академии превентивной медицины. Вирус растворяли в культуральной среде 1640 и инокулировали в резервную однослойную культуру клеток HEL, спустя 16 ч происходило повреждение данных клеток и их набухание при 37°С, возрастало количество преломляющих частиц в цитоплазме, части клеток округлялись и уменьшалось количество индивидуальных клеток. При увеличении времени инокуляции, размеры повреждения увеличивались, достигая более чем 90% повреждения при культивировании в течение 96 часов. Культуральный супернатант HEL, достигающий +++-++++ в поражении клеток, отбрасывают и слегка промывают 3 раза PB, добавляют воду двойной дистилляции, 3 раза осуществляют замораживание-оттаивание при -20°С, осуществляют энергичное продувание и взбалтывание, осуществляют центрифугирование при 10000 об/мин при 4°С в течение 20 мин, и отбирают супернатант, получая стандартный штамм вируса.
2. Экспериментальный метод
2.1 Распределение по группам и введение
Мыши линии 210 Kunming, равное количество самцов и самок, получали питание в течение 1 недели в условиях эксперимента, и их разделяли на 21 группу случайным образом по полу и массе тела: нормальная контрольная группа, модельная группа, положительная контрольная группа, получавшая лекарственный препарат, группы, получавшие спиртовые экстракты женьшеня в высокой/средней/низкой дозе, группы, получавшие водные экстракты женьшеня в высокой/средней/низкой дозе, группы, получавшие общий гинзенозид из корня женьшеня в высокой/средней/низкой дозе, группы, получавшие гинзенозид типа панаксадиола в высокой/средней/низкой дозе, группы, получавшие гинзенозид rg3 в высокой/средней/низкой дозе, и группы, получавшие производные гинзенозида rg3 в высокой/средней/низкой дозе.
Группа положительного контроля получала ганцикловир (45,5 мг/кг/сутки), трем группам, получавшим спиртовые экстракты женьшеня, давали спиртовые экстракты женьшеня в дозе 0,012 мг/кг/сутки, 0,06 мг/кг/сутки и 0,3 мг/кг/сутки соответственно, трем группам, получавшим водные экстракты женьшеня, давали водные экстракты женьшеня в дозе 0,012 мг/кг/сутки, 0,06 мг/кг/сутки и 0,3 мг/кг/сутки соответственно, трем группам, получавшим общий гинзенозид из корня женьшеня, давали общий гинзенозид из корня женьшеня в дозе 0,012 мг/кг/сутки, 0,06 мг/кг/сутки и 0,3 мг/кг/сутки соответственно, трем группам, получавшим гинзенозид типа панаксадиола, давали гинзенозид типа панаксадиола в дозе 0,012 мг/кг/сутки, 0,06 мг/кг/сутки и 0,3 мг/кг/сутки соответственно, трем группам, получавшим гинзенозид rg3, давали гинзенозид rg3 в дозе 0,012 мг/кг/сутки, 0,06 мг/кг/сутки и 0,3 мг/кг/сутки соответственно, трем группам, получавшим производные гинзенозида rg3, давали производные гинзенозида rg3 в дозе 0,012 мг/кг/сутки, 0,06 мг/кг/сутки и 0,3 мг/кг/сутки соответственно.
Мышам делали инъекцию ЦМВЧ 10-3 (0,1 мл/мышь) в хвостовую вену, нормальной контрольной группе делали инъекцию 0,9%-ного обычного физиологического раствора, 0,1 мл/особь, и начинали внутрижелудочное введение в соответствии с определенной дозой на второй день инфицирования, вводя лекарственный препарат в течение 21 дня.
2.2. Определение массы тела, тимического индекса и селезеночного индекса
Во время эксперимента животных взвешивали, а вилочковую железу и селезенку взвешивали на 21-ый день введения и определяли их индексы (тимический индекс, селезеночный индекс, массу вилочковой железы и селезенки на 10 г массы тела (мг)).
2.3 Определение гемолизиновых антител сыворотки
Через 40 мин после последнего введения, проколоть глазные яблоки для отбора крови, отобрать сыворотку, разбавить сыворотку в 100 раз нормальным физиологическим раствором, равномерно перемешать с 1 мл разбавленной сыворотки, 0,5 мл 5%-ной суспензии эритроцитов цыплят и 0,5 мл 10%-ного комплемента (сыворотки морской свинки), инкубировать в течение 30 мин в инкубаторе при 37°С, установить температуру 0°С в холодильнике на 30 мин, чтобы остановить реакцию. Центрифугировать, отобрать супернатант, а затем измерить оптическую плотность (значение OD) при 540 нм на спектрофотометре.
2.4 Определение содержания IL-2 в сыворотке
Выбрать случайным образом шесть мышей в каждой группе для взятия материала через 40 мин после последнего введения, проколоть глазные яблоки для отбора крови и собрать кровь в пробирку для центрифуги. Осуществить высокоскоростное центрифугирование в течение 5 мин при 3000 об/мин после коагуляции крови, и отобрать сыворотку. Содержание IL-2 в сыворотке определяют согласно инструкции по применению набора ELISA.
3. Результаты эксперимента
3.1 Определения уровня выживаемости и массы мышей, инфицированных ЦМВЧ
Регистрация количества животных, умерших в ходе эксперимента. Результаты теста относительно уровня выживаемости и массы мышей, инфицированных ЦМВЧ, представлены в таблице 1.
Все мыши подвергались действию лекарственных препаратов непрерывно в течение 21 дня в течение всего хода эксперимента. Во время введения у мышей модельной группы в первые 2-4 сутки после подвергания токсическому воздействию происходит пилоэрекция, гемиплегия, атаксия всего тела и снижение массы тела, а также другие инфекционно-токсические симптомы, смерть наступает через 5-7 дней, и лишь 3 мыши выживают до наступления 21 суток, что свидетельствует об эффективности данной модели.
У мышей из групп, получавших спиртовые экстракты женьшеня, водные экстракты женьшеня, общий гинзенозид из корня женьшеня, гинзенозид типа панаксадиола, 20(R)-гинзенозид Rg3 и производные 20(R)-гинзенозида Rg3, проявлялись слабовыраженные симптомы интоксикации, отмечалась меньшая смертность и хорошая прибавка массы, что указывает на то, что данные лекарственные средства обладают определенным ингибирующим эффектом в отношении данных вирусов и способны в различной степени повысить уровень выживаемости мышей. Количество выживших мышей во всех группах соответственно статистически сравнивали с количеством выживших мышей в модельной группе, в результате чего обнаружили значительное различие для групп, получавших высокие дозы, а также некоторый защитный эффект в отношении мышей, инфицированных ЦМВЧ, в группах, получавших среднюю/низкую дозу. Количество выживших мышей, прибавка массы и проявление симптомов для животных, получавших ганцикловир, полностью соответствуют данным параметрам для групп высокой дозы.
Таблица 1. Влияние экстрактов женьшеня и их производных на массу мышей, инфицированных ЦМВЧ (X±S)
рования
лечения
3.2 Влияние на селезеночный и тимический индексы у мышей, инфицированных ЦМВЧ.
Вилочковая железа и селезенка являются важными органами иммунной системы, причем индексы данных органов в некоторой степени отражают силу иммунитета организма. Основные функции вилочковой железы заключаются в выработке T-лимфоцитов и секреции тимозина, и она, главным образом, принимает участие в выработке клеточного иммунитета, а в селезенке содержится большое количество лимфоцитов и макрофагов. Масса вилочковой железы и селезенки связана с их функционированием, а также содержащимся в них количеством иммунных клеток, а размер зависит от степени пролиферации содержащихся в них лимфоцитов. Данные, относящиеся к селезеночным и тимическим индексам, представлены в таблице 2.
Таблица 2. Сравнение влияния экстрактов женьшеня и его производных на селезеночный и тимический индексы мышей, инфицированных ЦМВЧ (X±S)
индекс
Результаты данного эксперимента свидетельствуют о том, что спиртовые экстракты женьшеня, водные экстракты женьшеня, общий гинзенозид женьшеня, гинзенозид типа панаксадиола, гинзенозид rg3 и производные гинзенозида rg3 обладают очевидным эффектом повышения массы иммунных органов у мышей, инфицированных ЦМВЧ, при этом массы во всех экспериментальных группах выше, чем у модельной группы и, в частности, селезеночные индексы и тимические индексы для групп, получавших гинзенозид rg3 и производные гинзенозида rg3, значительно отличались от данных индексов у модельной группы соответственно. Результаты эксперимента позволяют утверждать, что экстракты женьшеня, гинзенозид и его производные способны оказать защитное действие по отношению к вилочковой железе и селезенке мышей, инфицированных ЦМВЧ, обладают иммунным действием, похожим на действие антигенов, способны регенерировать и активировать активность лимфоцитов селезенки и обладают положительным иммунорегулирующим действием. Поэтому экстракты женьшеня и его производные можно использовать для лечения инфекции ЦМВЧ.
3.3 Результаты эксперимента по содержанию IL-2 в сыворотке
IL-2, а именно, интерлейкин-2, называемый также фактором роста Т-клеток (TCGF), представляет собой клеточный фактор, имеющий широкий спектр биологической активности, генерируемый активированными клетками CD4+Th1, и способный активировать пролиферацию Th0 и CTL, являясь, таким образом, важным фактором регулирования и контроля иммунных откликов. Источником IL-2 является множество клеток (в основном, его генерируют активированные Т-клетки), а также клеточные факторы (используемые, главным образом, для содействия росту, пролиферации и дифференциации лимфоцитов), обладающие плейотропным действием, IL-2 оказывает значительное влияние на иммунные отклики и противовирусное действие и прочие эффекты организма, и способен стимулировать пролиферацию Т-клеток, запущенную определенными антигенами или митогенными факторами, активировать Т-клетки и содействовать генерированию клеточных факторов, стимулировать пролиферацию NK-клеток, повышать активность NK-клеток и генерировать клеточные факторы, чтобы вызвать генерирование LAK-клеток, содействовать пролиферации и выработке антител В-клетками, и активировать макрофаги. Экспериментальные данные относительно содержания IL-2 в сыворотке мышей представлены в таблице 3.
Таблица 3. Данные по концентрации IL-2 в сыворотке мышей, инфицированных ЦМВЧ (X±S)
после окончания лечения
(пг/мл)
Из результатов таблицы 3 видно, что в модельной группе самое низкое содержание IL-2, что значительно отличается от нормальной контрольной группы (P <0.01), что свидетельствует об эффективности данной модели. Содержание IL-2 в группе, получавшей спиртовые экстракты женьшеня, водные экстракты женьшеня, общий гинзенозид, гинзенозид типа панаксадиола, гинзенозид rg3 и производные гинзенозида rg3, превышает содержание IL-2 в модельной группе, что указывает на то, что спиртовые экстракты женьшеня, водные экстракты женьшеня, общий гинзенозид, гинзенозид типа панаксадиола, гинзенозид rg3 и производные гинзенозида rg3 повышают уровень IL-2 у мышей, инфицированных ЦМВЧ, а содержание IL-2 в группах, получавших спиртовые экстракты женьшеня, водные экстракты женьшеня, общий гинзенозид, гинзенозид типа панаксадиола, гинзенозид rg3 и производные гинзенозида rg3, превышает содержание IL-2 в положительной контрольной группе, получавшей лекарственный препарат, что указывает на то, что в группах, получавших спиртовые экстракты женьшеня, водные экстракты женьшеня, общий гинзенозид, гинзенозид типа панаксадиола, гинзенозид rg3 и производные гинзенозида rg3, наблюдается больший эффект лечения мышей, инфицированных ЦМВЧ, чем в случае лекарственных препаратов положительного действия.
3.4 Определение гемолизиновых антител в сыворотке
Результаты определения гемолизиновых антител в сыворотке мышей представлены в таблице 4.
Таблица 4. Результаты определения гемолизиновых антител в сыворотке мышей, инфицированных ЦМВЧ (X±S)
после окончания лечения
(значение OD)
Результаты данного эксперимента показывают, что все спиртовые экстракты женьшеня, водные экстракты женьшеня, общий гинзенозид, гинзенозид типа панаксадиола, гинзенозид rg3 и производные гинзенозида rg3 способны повышать уровень гемолизиновых антител в сыворотке мышей, инфицированных ЦМВЧ, что существенно отличается по сравнению с модельной группой. В частности, уровень гемолизиновых антител в сыворотке для групп, получавших водный экстракт женьшеня, общий гинзенозид, гинзенозид типа панаксадиола, гинзенозид rg3 и производное гинзенозида rg3, превышает уровень гемолизиновых антител в сыворотке для положительной контрольной группы, получавшей лекарственный препарат, что позволяет утверждать, что в группах, получавших водный экстракт женьшеня, общий гинзенозид, гинзенозид типа панаксадиола, гинзенозид rg3 и производное гинзенозида rg3, проявлялся больший терапевтический эффект в отношении мышей, инфицированных ЦМВЧ, по сравнению с лекарственным средством положительного действия.
Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к применению гинзенозида rg3 для получения лекарственного препарата для лечения инфекционного заболевания, вызванного ЦМВЧ. Предложено применение гинзенозида rg3, выбранного из 20(R)-гинзенозида rg3 или 20(R)-гинзенозид rg3 8-N-оксибутирата, для получения лекарственного препарата для лечения инфекционного заболевания, вызванного ЦМВЧ. Вышеописанное средство эффективно для лечения инфекционного заболевания, вызванного ЦМВЧ. 2 з.п. ф-лы, 40 табл.
1. Применение гинзенозида rg3, выбранного из 20(R)-гинзенозида rg3 или 20(R)-гинзенозид rg3 8-N-оксибутирата, для получения лекарственного препарата для лечения инфекционного заболевания, вызванного ЦМВЧ.
2. Применение по п. 1, при котором лекарственный препарат дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.
3. Применение по п. 1 или 2, при котором лекарственный препарат находится в форме таблеток, капсул, пилюль, порошка, гранул, сиропов, растворов, инъекций, спреев, аэрозолей, настоев, катаплазмы, резинового пластыря или пластыря.
| CN 103536884 А, 29.01.2014 | |||
| Грузовая бадья | 1936 |
|
SU50054A1 |
| СN 102166238 A, 31.08.2011 | |||
| LI SP et al | |||
| A novelstrategy with standardized reference extract qualification and single compound quantitative evaluation for quality control of Panax notoginseng used as a functional food // J | |||
| Chromatogr | |||
| A | |||
| Многоступенчатая активно-реактивная турбина | 1924 |
|
SU2013A1 |
