Штамм актиномицета Streptomyces parvulus ВКПМ Ас-2177, обладающий способностью к солюбилизации фосфора Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к производству биопрепаратов, улучшающих минеральное питание растений в условиях дефицита подвижного фосфора в почвах.

Доступность фосфора для растений является одним из ключевых параметров, определяющих первичную продуктивность растительных экосистем [George T.S., Hinsinger P., Turner B.L. Phosphorus in soils and plants - facing phosphorus scarcity // Plant and Soil. 2016. V. 401. Р. 1-6. doi:10.1007/s11104-016-2846-9]. В настоящее время многие пахотные почвы, на фоне ограниченного внесения минеральных удобрений, испытывают дефицит доступного для растений фосфора [Сычёв В.Г., Лунёв М.И., Павлихина А.В. Современное состояние и динамика плодородия пахотных почв России // Плодородие. 2012. № 4. С. 5-8.]. Зачастую это вызвано закреплением экзогенных фосфорных соединений в почве в труднодоступные для растений формы (фосфаты железа и алюминия) [Васбиева М.Т., Завьялова Н.Е. Фосфатный режим дерново-подзолистой почвы естественных и агрофитоценозов // Бюллетень Почвенного института имени В.В. Докучаева. 2021. Вып. 107. С. 92-115. doi:10.19047/0136-1694-2021-107-92-115]. Для повышения уровня фосфорного питания растений и снижения потребности в минеральных удобрениях актуально использовать солюбилизирующие фосфор микроорганизмы [Быковская А.Н., Сидоренко М.Л., Слепцова Н.А., Клыков А.Г., Бережная В.В., Колесникова Д.А. Применение агрономически ценных бактерий для повышения почвенного плодородия и урожайности ярового ячменя (Hordeum vulgare L.) // Вестник ДВО РАН. 2020. № 1 (209). 75-81]. Способность микроорганизмов к переводу нерастворимых соединений фосфора в растворимую форму обусловлена различными механизмами, в том числе продукцией минеральных и органических кислот, секрецией сидерофора, хелатированием, продукцией фосфатаз [Fallah A.R. Solubilization Mechanisms of Insoluble Phosphates by Phosphate Solubilizing Microorganisms // Journal of Sol Biology. 2022. V. 10. No. 1. P. 93-110. doi:10.22092/SBJ.2022.342964.195]. Фосфатсолюбилизирующая способность обнаружена у микроорганизмов различных таксономических групп.

Примером микроскопических грибов, использующихся для увеличения доступного фосфата для растений, являются штаммы Penicillium bilaiae [Майкл Фродайма, Дэвид Гриншилдс, Шелаг Стеклер, Кари Прист, Каресса Колдуэлл. Микробные штаммы, композиции и способы увеличения доступного фосфата для растений // Патент на изобретение RU 2668832 C2. Заявка: 2015122890, 15.11.2013. Дата публикации: 02.10.2018].

Известны патенты, в которых для увеличения подвижных форм фосфора в почве предлагаются бактериальные виды. В частности, штамм бактерий Pantoea agglomerans Ф19 (ВКПМ В-13869), обладающий фосфатсолюбилизирующей, фитопротекторной и ростостимулирующей активностью [Сидоренко М.Л., Шкрыль Ю. Н. Штамм бактерий Pantoea agglomerans Ф19 для повышения урожайности зерновых культур // Патент на изобретение RU 2757123 C1. Заявка: 2021110660, 16.04.2021. Дата публикации: 11.10.2021]. Описан штамм бактерий Paenibacillus sp. ИБ-1 (ВКМ В-2823D), обладающий антагонистической активностью в отношении фитопатогенных грибов, а также нитрогеназной активностью и возможностью перевода почвенных фосфатов в растворимые формы [ЗАО НПП «Биомедхим», ФГБУН ИБ УНЦ РАН. Штамм бактерий Paenibacillus sp. для получения биопрепарата против заболеваний пшеницы, вызываемых фитопатогенными грибами // Патент на изобретение RU 2539738 C1. Заявка: 2013138912/10, 20.08.2013. Дата публикации: 27.01.2015]. Способность к солюбилизации фосфора описана для мутированных бактериальных штаммов Bradyrhizobium japonicum [Кан Яовэй, Тран Анх, Симонес Шон. Способ обработки семени растения // Патент на изобретение RU 2646138 C1. Заявка: 2016120277, 17.12.2012. Дата публикации: 01.03.2018]. Известен штамм Bacillus mucilaginosus Вас-10 (ВКПМ В-10209), обладающий повышенными фосфор и калий мобилизирующими свойствами [Пластинин С.А., Никульшин В.А., Здорнов А.В. Штамм бактерий Bacillus mucilaginosus Bac 1208, обладающий повышенными фосфор и калий мобилизующими свойствами и удобрение на его основе // Патент на изобретение RU 2408722 C1. Заявка: 2009124058/10, 24.06.2009. Дата публикации: 10.01.2011].

К бактериям, которые обладают фосфатсолюбилизирующей активностью, относят также актиномицеты рода Streptomyces [Chouyia F.E., Romano I., Fechtali T., Fagnano M., Fiorentino N., Visconti D., Idbella M., Ventorino V., Pepe O. P-Solubilizing Streptomyces roseocinereus MS1B15 With Multiple Plant Growth-Promoting Traits Enhance Barley Development and Regulate Rhizosphere Microbial Population // Front Plant Sci. 2020. V. 11:1137. doi: 10.3389/fpls.2020.01137.]. Известен штамм Streptomyces Cellulosae WH9 (CGMCC № 2167), который совместно со штаммами Bacillus subtilis WH2 (CGMCC № 0395.2), Bacillus licheniformis WH4 (CGMCC № 0395.4), Aspergillus versicolor WH13 (CGMCC № 2171), входит в состав микробного фосфатного удобрения. Представленный в патенте микробный консорциум обладает способностью к трансформации фосфора, заключенного в состав измельченной фосфатной породы [Хо Биу, Хуан Эн-хсиун, Хо Тин Квок, Хо Тин Вин. Микроорганизмы, микробные фосфатные удобрения и способы изготовления микробных фосфатных удобрений // Патент на изобретение RU 2443776 C1. Заявка: 2010126160/10, 06.11.2008. Дата публикации: 27.02.2012]. Описанный в изобретении штамм Streptomyces Cellulosae WH9 (CGMCC № 2167) является наиболее близким к предлагаемому штамму по таксономическому признаку. Недостатком данного штамма является действие в составе консорциума микроорганизмов.

Задача изобретения - получение нового штамма актиномицета Streptomyces parvulus LA2, обладающего способностью к солюбилизации фосфора и совместимого с биологическими фунгицидами.

Поставленная задача решается тем, что предложен штамм актиномицета Streptomyces parvulus LA2, который способен высвобождать фосфаты-ионы из нерастворимых и малорастворимых в воде фосфатов. Новый штамм выделен из почвы, устойчив к биологическим фунгицидам.

Штамм актиномицета Streptomyces parvulus LA2 депонирован в Национальном биоресурсном центре - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика под номером Ас-2177, как продуцент актиномицина.

Предлагаемый штамм Streptomyces parvulus LA2 отличается от штамма прототипа Streptomyces Cellulosae WH9 совместимостью с биологическими фунгицидами - глиокладином (Trichoderma harzianum), фитоспорином (Bacillus subtilis), для него установлена фосфатсолюбилизирующая активность в условиях in vitro.

Идентификацию штамма Streptomyces parvulus LA2 проводили согласно определителям Гаузе и др., 1983; Bergey's Manual, 1994, а также с использованием молекулярно-генетических методов по последовательности нуклеотидов 16S рРНК, амплификацией видоспецифичного фрагмента, характерного для Streptomyces parvulus в Национальном биоресурсном центре - Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика (г. Москва).

Изучение морфологии репродуктивных структур штамма проводили на световом микроскопе «Микромед 1» при увеличении ×100. На фиг. 1 видно, что штамм формирует извитые цепочки спор.

Культурально-морфологические и физиолого-биохимические признаки

Streptomyces parvulus LA2 является аэробом, оптимальная температура для роста составляет 22 ÷ 27°С. На плотных питательных средах штамм образует плотные колонии, на большинстве диагностических сред с умеренно обильным или скудным воздушным мицелием (ВМ). Вид ВМ зависит от среды культивирования штамма. ВМ на минеральном агаре 1 и среде ISP 3 скудный, мучнистый, белого цвета; субстратный мицелий (СМ) бесцветный на минеральном 1, на среде ISP 3 - желтоватый. Растворимые пигменты (РП) отсутствуют. На глицерин-нитратном агаре ВМ обильный, светло-серый; СМ - рыжеватый, РП отсутствуют. На органическом агаре 2 ВМ обильный, светло-серый; СМ - от тёмно-жёлтого до коричневого; РП отсутствуют. Меланоидные пигменты (МП) на среде ISP 6 отсутствуют. На среде ISP 5 ВМ обильный, от белого до светло-серого; СМ оранжевый. На среде ISP 6 ВМ обильный, сероватый; СМ оранжевый.

Согласно таксономической идентификации наиболее близким к исследуемому штамму является вид Streptomyces parvulus.

Streptomyces parvulus LA2 утилизирует инозит, мальтозу и глюкозу. Слабо усваивает сахарозу, рамнозу, в меньшей степени - маннит и арабинозу, способен к синтезу экзоцеллюлаз. Штамм LA2 устойчив к амоксициллину (20 мкг), левомицетину (30 мкг), цефазолину (30 мкг), нистатину (80 Ед), чувствителен к тетрациклину (30 мг), бацитрацину (10 Ед), канамицину (30 мкг), рифампицину (5 мкг), эритромицину (15 мкг). На фиг. 2 видны зоны ингибирования роста штамма вокруг дисков с рифампицином, бацитрацином (изображение 1) и тетрациклином (изображение 2).

Рекомендуемый способ хранения

Для поддержания и сохранения штамма в лабораторных условиях необходим периодический пересев на свежую агаризированную среду (органический агар 2) в пробирках. Частота пересева штамма составляет не более 3-х месяцев. В пересеваемой культуре нужно выделять несколько колоний, для избегания вероятности селекции мутантов. После пересева штамм необходимо культивировать в термостате в течение 7 - 14 суток при 25 - 27°С.

Более подробно сущность описываемого изобретения рассказывается в приведенных ниже примерах.

Пример 1. Оценка наличия фосфатсолюбилизирующей активности Streptomyces parvulus LA2 на плотных питательных средах

Способность Streptomyces parvulus LA2 к солюбилизации минеральных фосфатов исследовали в условиях in vitro на плотных питательных средах без красителя и с красителем.

В первом случае использовали среду Пикановской, содержащую в качестве единственного источника фосфора нерастворимый в воде фосфат в виде средней соли кальция Ca₃(PO₄)₂ - 5 г/л. В состав среды также входила глюкоза - 10; (NH₄)₂SO₄ - 0,5; NaCl - 0,2; MgSO₄⋅7H₂O - 0,1; KCl - 0,2; дрожжевой экстракт - 0,5; MnSO₄⋅H₂O - 0,002; FeSO₄⋅7H₂O - 0,002; агар - 20 г/л. Среду автоклавировали, в асептических условиях разливали в чашки Петри. Питательная среда была мутной из-за наличия нерастворимого в воде фосфата кальция. Штрихом засевали штамм, инкубировали посев при 28°С в термостате в течение 10-ти суток. Штаммы, обладающие фосфатсолюбилизирующей способностью должны создавать прозрачную гало-зону в мутной среде, окружающей колонию. Наличие зоны просветления осадка фосфата кальция вокруг колоний Streptomyces parvulus LA2 показано на фиг. 3 (изображение 3), свидетельствует о наличии у штамма способности солюбилизировать минеральную форму фосфатов.

Исследование фосфатосолюбилизирующей способности штамма с использованием красителя проводили на питательной среде состава: (NH₄)₂SO₄ - 0,5; MgSO₄⋅7H₂O - 0,05; MgCl₂⋅2H₂O - 0,1; FeCl₃⋅6H₂O - 0,01; CaCl₂⋅4H₂O - 0,1; пептон - 1,0; дрожжевой экстракт - 1,0; глюкоза - 5,0; агар - 15 г/л; почвенная вытяжка - 250,0 мл; 0,5%-ный раствор бромтимолового синего - 5,0 мл/л). Среда для анализа содержала фосфоритную муку (11,4% в пересчёте на P). Фосфоритную муку автоклавировали отдельно от питательной среды, добавляли к среде из расчета 4,0 г/л. Среду с соблюдением правил асептики разливали в чашки Петри. Полоской засевали штамм, посев инкубировали при 28°С в термостате в течение 14-ти суток. Бромтимоловый синий изменяет окраску среды в зависимости от pH: в диапазоне значений от 5,8 до 7,6 - оттенки зелёного, в кислой среде - цвет желтый. Таким образом, штаммы, обладающие фосфатсолюбилизирующей способностью должны создавать окрашенную в желтый цвет зону, окружающую бактериальную колонию. На фигуре 3, изображение 4 продемонстрировано наличие желтой окраски вокруг колоний Streptomyces parvulus L2 относительно питательной среды, имеющей зеленоватую окраску.

Пример 2. Количественная оценка фосфатсолюбилизирующей способности Streptomyces parvulus LA2 в жидкой среде

В рамках количественной оценки фосфатсолюбилизирующей способности Streptomyces parvulus LA2 проводили исследование способности высвобождать фосфаты-ионы из нерастворимых и малорастворимых в воде фосфатов (фосфат кальция, фосфоритная мука). Для исследования использовали питательную среду следующего состава: крахмал - 20; MgSO₄⋅7Н₂О - 0,5; KNO₃ - 1,0; NaCl - 0,5; FeSO₄⋅7Н₂О - 0,01; агар-агар - 20 г/л; pH=7,2-7,4). Вариант 1 исключал добавление солей фосфора в состав питательной среды. Его использовали в качестве холостого опыта. Контролем служил вариант 2 - в состав питательной среды добавляли водорастворимую кислую соль калия состава KH₂PO₄. В питательную среду вариантов 3 и 4 вводили фосфат кальция и фосфоритную муку соответственно. Среду объемом 50 мл разливали в конические колбы на 250 мл, стерилизовали в автоклаве. Штамм для инокуляции предварительно выращивали на плотной питательной среде, сверлом вырезали блочки газона, помещали в жидкую среду. Культивирование штамма осуществляли при температуре 20 ± 2°С при периодическом 8/16 ч перемешивании (130 об/мин). По истечению времени суспензию центрифугировали при 2000 оборотах в течение 5 минут. Надосадочную жидкость использовали для анализа фосфатов спектрофотометрическим методом. Эксперимент проводился в трехкратной повторности.

В результате анализа была установлена способность к высвобождению фосфат-ионов из трудно растворимых в воде соединений фосфора. В вариантах опыта с фосфатом кальция и фосфоритной мукой, регистрировали увеличение концентрации фосфат-ионов в среде культивирования штамма, свидетельствующее о солюбилизации фосфатов. В контроле отмечали небольшое снижение концентрации фосфат-ионов, вы виду их включения в метаболизм штамма (см. таблицу).

Пример 3. Совместимость Streptomyces parvulus LA2 с фунгицидами

Совместимость Streptomyces parvulus LA2 с фунгицидами оценивали с целью определения перспективы их совместного применения. По наличию / отсутствию зон ингибирования роста Streptomyces parvulus LA2 фунгицидом судили об их совместимости. Для исследования использовали глиокладин (Trichoderma harzianum), фитоспорин-М (Bacillus subtilis), фитолавин (комплекс стрептотрициновых антибиотиков).

На поверхность агаризированной минеральной среды 1 (крахмал - 20; K₂HPO₄ - 0,5; MgSO₄⋅7Н₂О - 0,5; KNO₃ - 1,0; NaCl - 0,5; FeSO₄⋅7Н₂О - 0,01; агар-агар - 20 г/л; pH=7,2-7,4) штрихом засевали Streptomyces parvulus LA2. Сверлом диаметром 12 мм вырезали 3 лунки. В лунки заливали 0,1 мл раствора фунгицидов, приготовленных согласно инструкции (на 100 мл стерильной дистиллированной воды - 1 таб. глиокладина; 0,2 мл фитолавина; 0,15 г фитоспорина). Чашки инкубировали при 28°С в термостате в течение 10-ти суток.

Фиксировали наличие зон ингибирования роста Streptomyces parvulus LA2 фитолавином, что позволило сделать вывод об их несовместимости, изображение 5 на фиг. 4. Отсутствие зон ингибирования в случае биологических фунгицидов (глиокладин, фитоспорин), что свидетельствовало об их совместимости - изображения 6 и 7 на фиг. 4.

Таблица. Результаты исследования фосфатсолюбилизирующей способности Streptomyces parvulus LA2 в жидкой среде Вариант опыта Концентрация PO₄^3-, мг/л До инокуляции После инокуляции Контроль 3255,2 ± 33,2 2555,6 ± 71,6 Фосфат кальция 62,9 ± 3,3 394,3 ± 14,6 Фосфоритная мука 9,8 ± 1,9 79,2 ± 2,6

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, в частности к производству биопрепаратов, улучшающих минеральное питание растений в условиях дефицита подвижного фосфора в почвах. Предлагается штамм актиномицета Streptomyces parvulus ВКПМ Ас-2177, обладающий способностью к солюбилизации фосфора. Штамм Streptomyces parvulus LA2 выделен из почвы, депонирован в Национальном биоресурсном центре – Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» – ГосНИИгенетика под номером Ас-2177. Штамм способен высвобождать фосфаты-ионы из нерастворимых и малорастворимых в воде фосфатов, совместим с биологическими фунгицидами – глиокладином (Trichoderma harzianum) и фитоспорином (Bacillus subtilis). 4 ил., 1 табл.

Штамм актиномицета Streptomyces parvulus LA2 ВКПМ Ас-2177, обладающий способностью к солюбилизации фосфора.