СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ КИСЛОТНОСТИ Российский патент 2011 года по МПК G01N33/48 

Предполагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к биохимии, и может быть использовано для оценки состояния обменных процессов в клетке при лечении и контроле эффективности проводимых лечебных мероприятий у больных с соматическими и психическими заболеваниями.

Известно, что любой патологический процесс начинается с повреждения одного из звеньев внутриклеточного состояния - внутриклеточной кислотности (ph), показатель которой имеет большое значение в регуляции жизнедеятельности и функциональной активности клетки. Общность строения плазматических мембран различных органов позволяет считать, что изменения, происходящие в эритроцитарной мембране, отражают изменения в мембранах клеток других тканей (Лопухин Ю.М., Арчаков А.И., Владимиров Ю.А., Коган Э.М. Холестериноз. - М.: Медицина, 1983 г., С.28-40).

Известен способ прямого определения ph в клетке, включающий выделение клеточного материала, введение в клетку соединения, проявляющего ph-зависимую флуоресценцию, и измерение флуоресценции при 520 нм (Slavir j-FEBS Lett. - 1983 г. VOL.156. p.227-230).

К недостаткам данного способа следует отнести многостадийную и трудоемкую пробоподготовку, включающую использование эксклюзивных реактивов и оборудования, что приводит к высокой стоимости исследования.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ определения 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ) - основного продукта метаболизма эритроцитов. Известно, что продукция 2,3-ДФГ находится в зависимости от ph среды эритроцита. Ацидоз ингибирует гликолиз и продукция 2,3-ДФГ уменьшается, сдвиг в щелочную сторону активирует синтез 2,3-ДФГ (Рябов Г.А. Гипоксия критических состояний. - М.: Медицина, 1988 г., с.74-77).

Известный способ включает взятие пробы крови, выделение эритроцитов, получение взвеси эритроцитов и регистрацию их спектров на ЯМР-спектрометре DRX-500 с последующей обработкой спектров при использовании специальной компьютерной программы XMIN-NMR, Version 3.1 (М.В.Кручинина, С.А.Курилович, И.В.Поруликова, И.И.Шакиров, журнал «Клиническая и экспериментальная гастроэнтерология», приложение Гепатология, - 2003. - №2 - с.28-33).

К недостаткам известного способа, как и аналогичного, следует отнести длительность выполнения (1,5-2 часа) и высокую стоимость анализа, т.к. используется дорогостоящие оборудование, что препятствует его применению в широкой медицинской практике. Кроме этого, как отмечает автор известного способа, не во всех случаях можно ориентироваться на определение только этого показателя (2,3-ДФГ), так как он может быть изменен в связи с нарушением активности ферментов гликолиза (Рябов Г.А. Гипоксия критических состояний. - М.: Медицина, 1988 г., с.74-77).

Задачей заявленного технического решения являются разработка способа определения внутриклеточной кислотности.

Техническим результатом предлагаемого способа является его упрощение, сокращение времени определения и повышение точности определения ацидоза в эритроцитах, за счет идентификации клеточных компонентов, нарушающих обменные процессы в клетке и влияющих на сдвиг внутриклеточной среды в кислую сторону.

Технический результат достигается тем, что способ определения ацидоза в эритроцитах включает взятие пробы крови, отделение эритроцитов, снятие их спектральных характеристик, по которым устанавливают наличие ацидоза.

Отличия предлагаемого способа заключаются в том, что отделение эритроцитов проводят отмыванием физиологическим раствором и трехкратным центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 минут, каждая. Полученную суспензию эритроцитов, физиологический раствор и 15%-ный раствор трихлоруксусной кислоты, взятые в соотношении 1:1:1, перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 минут. После чего супернатант эритроцитов вносят в дистиллированную воду в соотношении 1:9 и спектрофотометрируют при длинах волн 230 нм (λ₂₃₀) и 280 нм (λ₂₈₀).

По величине отношения λ₂₃₀ к λ₂₈₀ более 3,5 внутриклеточную среду устанавливают кислой.

Проведенный сопоставительный анализ с прототипом показал, что предлагаемый способ отличается от известного вышеперечисленными приемами и, следовательно, соответствует критерию изобретения «новизна».

Из проведенного анализа патентной и специальной литературы установлено, что предполагаемый способ имеет признаки, отличающие его не только от прототипа, но и других технических решений в данной и смежных областях медицины. В доступной литературе авторами предлагаемого технического решения не выявлено способа определения внутриклеточной кислотности вышеприведенными приемами.

Клинические исследования авторов заявляемого способа свидетельствуют о том, что использование предлагаемого технического решения позволяет упростить и сократить время определения, повышение точности определения ацидоза в эритроцитах. Соединения, приводящие к нарушению обменных процессов в клетке и сдвигу внутриклеточной среды в кислую сторону, идентифицированы авторами предлагаемого способа химическими методами (ТСХ, ВЭЖХ, реакционная бумажная хромотография), которые позволили установить преобладающее содержание высоко реакционноспособных гидроперекисей органических кислот, перекисных соединений липидов, окисленных нуклеотидов и соединений с эпоксидными фрагментами.

Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «изобретательский уровень».

Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине, а именно в биохимии и физиологии. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке примерами и, следовательно, предлагаемое решение соответствует критерию изобретения «промышленная применимость».

Заявляемый способ осуществляют следующим образом

Утром (натощак) у пациента кровь из локтевой вены забирают в пробирку, содержащую 3.8% раствор цитрата натрия. Плазму от форменных элементов крови отделяют центрифугированием. Эритроциты отмывают физиологическим раствором с трехкратным центрифугированием по 5 мин каждое при 3000 об/мин. Затем берут 0,5 мл суспензии эритроцитов, добавляют 0,5 мл физиологического раствора и 0,5 мл трихлоруксусной кислоты, т.е. ингредиенты берут в соотношении 1:1:1. После перемешивания центрифугируют при 3000 об/мин, в течение 30 минут. В 4,5 мл дистиллированной воды вносят 0,5 мл супернатанта эритроцитов (соотношение 9:1) и снимают спектрограмму на спектрофотометре при длинах волн 230 (λ₂₃₀) и 280 нм (λ₂₈₀). Результат выражают в единицах оптической плотности (у.е.). Вычислением отношения величины оптической плотности λ₂₃₀ к λ₂₈₀ и получают показатель ацидоза в эритроцитах. При величине отношения более 3,5 внутриклеточную среду устанавливают кислой. Время выполнения анализа составляет 50-60 мин.

Предложенный способ поясняется примерами конкретного выполнения.

Пример №1. Больной П., история болезни №36113. Диагноз: Болезнь Крона. УФ-спектры: λ₂₃₀=1,372 у.е.; λ₂₈₀=0,177 у.е.

λ₂₃₀/λ₂₈₀=1,372/0,177=7,75. Величина отношения, равная 7,75, свидетельствует об изменении внутриклеточной среды в кислую сторону.

Пример №2. Больная С., история болезни №28430. Диагноз: Язвенный колит, впервые выявленный.

УФ-спектры: λ₂₃₀=0,289 у.е.; λ₂₈₀=0,046 у.е.

λ₂₃₀/λ₂₈₀=0,289/0,046=6,28

Величина отношения λ₂₃₀ к λ₂₈₀=6,28. Полученный показатель свидетельствует об избыточном накоплении кислых продуктов в эритроците.

Пример №3. Практически здоровый человек (волонтер).

УФ-спектры: λ₂₃₀=0,250 у.е.; λ₂₈₀=0,093 у.е.

λ₂₃₀/λ₂₈₀=0,250/0,093=2,68

Величина отношения λ₂₃₀ к λ₂₈₀=2,68. Показатель ацидоза указывает на сбалансированность обменных процессов в эритроците.

Было обследовано 46 человек, из них 24 - больные с воспалительными заболеваниями толстой кишки (ВЗК) и 22 - добровольцы (волонтеры), практически здоровые. Полученные данные представлены в таблице.

Таблица Спектральные характеристики супернатантов эритроцитов Обследуемые Оптическая плотность при 230 нм (у.е) Оптическая плотность при 280 нм (у.е) Показатель ацидоза (λ₂₃₀/λ₂₈₀) больные ВЗК
n=24 1,75±0,42 0,24±0,0028 7,29±0,89
p<0,001 доноры
n=22 0,149±0,003 0,048±0,001 3,104±0,4

Авторами заявляемого способа установлено достоверное увеличение показателя ацидоза у больных ВЗК, что свидетельствует о нарушении метаболических процессов в эритроцитах. Выраженные изменения обменных процессов в клетке обусловлены образованием высокоактивных продуктов промежуточного обмена, изменивших внутриклеточную ph в кислую сторону.

Таким образом, заявляемый способ позволяет установить показатель ацидоза (внутриклеточной кислотности) в эритроцитах и, тем самым, дает возможность осуществлять контроль за эффективностью проводимого лечения. Способ не сложен в исполнении, для его осуществления не требуется дорогостоящего оборудования. Время проведения исследования по сравнению со способом-прототипом сокращено в 2 раза.

Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии, и касается способа определения внутриклеточной кислотности. Сущность способа заключается в том, что проводят взятие пробы крови, эритроциты отделяют отмыванием физиологическим раствором и трехкратным центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 минут каждая. Суспензию эритроцитов, физиологический раствор и 15%-ный раствор трихлоруксусной кислоты, взятых в соотношении 1:1:1, перемешивают и центрифугируют в течение 30 минут при 3000 об/мин. Супернатант эритроцитов вносят в дистиллированную воду в соотношении 1:9 и спектрофотометрируют при длинах волн 230 нм и 280 нм, определяют величины оптической плотности. По величине отношения оптической плотности при длине волны 230 нм к оптической плотности при 280 нм более 3,5 устанавливают внутриклеточную среду кислой. Способ позволяет определить сдвиг внутриклеточной среды в кислую сторону (ацидоз), в 2 раза сократить время исследования. 1 табл.

Способ определения внутриклеточной кислотности, включающий взятие пробы крови, отделение эритроцитов и снятие их спектральных характеристик, отличающийся тем, что отделение эритроцитов проводят отмыванием физиологическим раствором и трехкратным центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин каждая, затем суспензию эритроцитов, физиологический раствор и 15%-ный раствор трихлоруксусной кислоты, взятых в соотношении 1:1:1, перемешивают и центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин, после чего супернатант эритроцитов вносят в дистиллированную воду в соотношении 1:9 и спектрофотометрируют при длинах волн 230 нм и 280 нм, определяют величины оптической плотности, и по величине соотношения оптической плотности при длине волны 230 нм к оптической плотности при 280 нм более 3,5 устанавливают внутриклеточную среду кислой.