СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЯ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ Российский патент 2007 года по МПК G01N33/48 G01N33/52 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к биохимии, и может быть использовано для оценки состояния эритроцитарного звена при лечении и контроле эффективности проводимого лечения у больных соматическими заболеваниями.

Известно, что развитие многих патологических состояний (ишемия, воспаление, атеросклероз, ИБС, сахарный диабет, гипертония, онкология) сопровождается интенсификацией свободно-радикальных процессов. Появление свободных радикалов обусловлено взаимодействием продуктов окисления липидов, белков, нуклеиновых кислот с мембранами клеток, при этом наиболее уязвимыми являются мембраны эритроцитов (Эндакова Э.А. Теоретические аспекты процессов свободно-радикального окисления и антиоксидантной защиты в организме. Дальневосточный мед. Науч-практ. Ж. Здоровье. Мед. Экология. Наука. Владивосток, 2005, №1/21/, с.5-10).

Известны различные способы определения состояния мембран эритроцитов. Так, известен способ определения осмотической стойкости эритроцитов путем количественного определения степени гемолиза эритроцитов в забуференных гипертонических растворах хлорида натрия (Унифицированный метод Л.И.Идельсона. Лабораторные методы исследования в клинике. Под ред. В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987, с.119).

К недостаткам данного способа следует отнести низкую чувствительность, невоспроизводимость и длительность исследования, связанную с установлением условий начального и 100%-ного гемолиза.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ установления нарушений в мембранах эритроцитов путем определения содержания первичных и вторичных продуктов перекисного окисления липидов по поглощению липидным экстрактом монохроматического светового потока в УФ-области 220, 232, 278 нм (Волчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г. // Вопр. мед. химии. - 1989. - №1. - С.127-131).

Основные приемы известного способа заключаются в следующем. Выделенные эритроциты обрабатывают смесью растворителей гептан:изопропанол в соотношении 1:1. Центрифугируют 25 мин при 3000 об/мин. Полученный экстракт повторно обрабатывают гептан-изопропанольной смесью, в соотношении 3:7. Добавляют раствор соляной кислоты, тщательно встряхивают и оставляют на 30 мин. Затем осторожно декантируют верхний гептановый слой. К оставшейся водно-изопропанольной фазе добавляют поваренную соль. Гептановую и изопропанольную сфектрофотометрируют отдельно при длинах волн 220, 232 и 278 нм.

К недостаткам данного способа следует отнести низкую точность определения повреждения мембраны эритроцита, так как по известному способу получают информацию о нарушении метаболических процессов только в одном классе соединений - продуктах перекисного окисления липидов (ПОЛ). В используемых для спектрофотометрии интервалах длин волн, укладываются и другие классы соединений.

К недостаткам известного способа следует отнести и многостадийность исследования, что также снижает точность и воспроизводимость анализа, длительность которого составляет около 2-х часов.

Кроме этого, известный способ предусматривает использование дорогостоящих спектрально-чистых реактивов, таких как гептан и изопропиловый спирт.

Задачей заявляемого технического решения является разработка экспресс-способа определения состояния мембран эритроцитов.

Техническим результатом предлагаемого способа является обеспечение точности идентификации продуктов метаболического пула мембран эритроцитов, обеспечение воспроизводимости определения, упрощение и сокращение времени проведения анализа.

Технический результат достигается тем, что способ определения состояния эритроцитов включает взятие пробы крови, выделение эритроцитов, получение супернатанта и регистрацию его спектральных характеристик, по которым устанавливают наличие или отсутствие повреждений мембран эритроцитов.

Отличительными приемами заявляемого способа являются: обработка выделенных эритроцитов ацетонитрилом; центрифугирование при 3000 об/мин в течение 30 минут; регистрация спектральных характеристик супернатанта в диапазоне длин волн 210-300 нм; определение величины суммарной оптической плотности; установление повреждений мембран эритроцитов по увеличению в сравнении с контролем в 1,5-2 раза суммарной оптической плотности.

Авторами заявляемого способа экспериментальным путем установлено, что обработка выделенных эритроцитов ацетонитрилом обеспечила возможность идентификации продуктов метаболического пула мембран эритроцитов. Это подтверждают результаты высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ). Идентифицированы соединения с пептидной группой, адениловые нуклеотиды и продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ), производные индола и имидозола, которым на спектрогамме адекватны пики в областях поглощения: 210-220 нм, 230-260 нм и 270-300 нм, соответственно. В то время как в способе-прототипе о повреждении мембран эритроцитов судят только по группе выявленных продуктов ПОЛ.

В то же время использование ацетонитрила позволило авторам заявляемого способа сократить количество операций по обработке пробы и, тем самым, обеспечить воспроизводимость и упрощение способа, в 2 раза сократить время проведения анализа, сделать его более экономичным, за счет уменьшения его стоимости по сравнению со способом-прототипом.

Регистрация спектральных характеристик супернатанта в диапазоне длин волн 210-300 нм позволяет достоверно установить состояние мембран эритроцитов, т.к. указанные области спектра позволяют учитывать максимальную оптическую активность большинства соединений обмена веществ. Так при λ 210-220 нм фиксируют соединения с пептидной группой, при λ 230-260 - адениловые нуклеотиды и продукты ПОЛ, при λ 270-300 - производные индола и имидазола, увеличение содержания которых, по сравнению с контролем, свидетельствует о повреждении мембран эритроцитов.

В прототипе получают информацию только о продуктах перекисного окисления липидов, которые фиксируют в областях 220, 232 и 278 нм, а в предлагаемом способе - регистрация спектра в УФ-области λ 210-300 нм - это позволяет оценить комплекс продуктов метаболизма в супернатанте эритроцитов.

Авторами заявляемого способа предложено в качестве оценочного критерия состояния мембран эритроцитов использовать величину суммарной оптической плотности идентифицированных продуктов метаболизма.

Авторам заявляемого способа не известно и в доступной литературе не найдено использование величины суммарной оптической плотности для определения состояния мембран эритроцитов.

Все эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения «новизна».

Сравнение заявляемого технического решения не только с прототипом, но и другими техническими решениями в биохимии не позволило выявить в них признаки, отличающие заявленное решение не только от способа-прототипа, но и от других аналогичных технических решений.

Нами не найдена информация, в которой бы говорилось об определении нарушений мембран эритроцитов приемами заявляемого способа.

Предлагаемый способ позволяет получить усматриваемый заявителем технический результат - обеспечение точности идентификации продуктов метаболического пула мембран эритроцитов, обеспечение воспроизводимости определения, упрощение и сокращение времени проведения анализа.

Это позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «изобретательский уровень».

Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине, а именно в биохимии. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами, следовательно, предлагаемое решение соответствует критерию изобретения «промышленная применимость».

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

Забор крови проводят утром, натощак, из локтевой вены в пробирку, содержащую 3,8% раствор цитрата натрия. Соотношение крови и цитрата 1:9. Плазму крови центрифугируют, отделяют жидкую часть от форменных элементов крови. Забирают 1-2 мл взвеси форменных элементов, трижды отмывают охлажденным физиологическим раствором. В центрифужную пробирку забирают 1 мл эритроцитов, добавляют 1 мл ацетонитрила (марки «ОСЧ»), перемешивают и центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин для осаждения высокомолекулярных соединений. Забирают 0,5 мл надосадочной жидкости (супернатант эритроцитов), разводят 4,5 мл дистиллированной воды, перемешивают и спектрофотометрируют в диапазоне длин волн 210-300 нм против контроля - приготовленного аналогичным образом ацетонитрила, в который вместо эритроцитов добавляют 1 мл дистиллированной воды.

Расчет суммарного содержания оптической плотности эритроцитов проводят по формуле:

=Е₂₁₀+Е₂₂₀+Е₂₃₀+Е₂₄₀+Е₂₅₀+Е₂₆₀+Е₂₇₀+Е₂₈₀+Е₂₉₀+Е₃₀₀, где:

-^{сумма оптической плотности в условных единицах (у.е.),}

E₂₁₀ - величина оптической плотности при λ 210 нм,

Е₂₂₀ - величина оптической плотности при λ 220 нм,

Е₂₃₀ - величина оптической плотности при λ 230 нм,

Е₂₄₀ - величина оптической плотности при λ 240 нм,

Е₂₅₀ - величина оптической плотности при λ 250 нм,

Е₂₆₀ - величина оптической плотности при λ 260 нм,

Е₂₇₀ - величина оптической плотности при λ 270 нм,

Е₂₈₀ - величина оптической плотности при λ 280 нм,

Е₂₉₀ - величина оптической плотности при λ 290 нм,

Е₃₀₀ - величина оптической плотности при λ 300 нм.

Кроме этого рассчитывается сумма оптической плотности пиков соединений с пептидной группой при 210-220 нм, адениловые нуклеотиды и продукты ПОЛ при λ 230-260 нм, производные индола и имидазола при λ 270-300 нм.

=Е₂₁₀+Е₂₂₀,

- сумма величин оптической плотности при λ 210 и 220 нм (в у.е.),

=Е₂₃₀+Е₂₄₀+Е₂₅₀+Е₂₆₀,

- сумма величин оптической плотности при λ 230, 240, 250 и 260 нм (в у.е.),

=Е₂₇₀+Е₂₈₀+Е₂₉₀+Е₃₀₀,

- сумма величин оптической плотности при λ 270, 280, 290 и 300 нм (в у.е.).

Авторами предлагаемого способа установлено, что суммарное содержание оптической плотности супернатанта эритроцитов в интервале длин волн 210-300 нм >1,77 условных единиц (у.е.), в интервале длин волн 210-220 нм >1,2 условных единиц (у.е.), в интервале длин волн 230-260 нм >0,33 условных единиц (у.е.), в интервале длин волн 270-300 нм >0,19 условных единиц (у.е.) свидетельствует о нарушении мембран эритроцитов.

Сущность предложенного способа поясняется фигурами 1 и 2, на которых представлены спектрограммы больного и донора, соответственно, где 1 - пик соединений с пептидной группой при 210-220 нм, 2 - адениловые нуклеотиды и продукты ПОЛ при λ 230-260 нм, 3 - производные индола и имидазола при λ 270-300 нм.

Общее время анализа составляет 40 минут.

Предложенный способ поясняется примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Больной К., диагноз: ишемическая болезнь сердца, III функциональный класс, стенокардия напряжения и покоя. При поступлении в стационар суммарная величина оптической плотности супернатанта эритроцитов в интервале длин волн 210-300 нм составляла 4,039 у.е.; при 210-220 нм - 1,67 у.е.; при 230-260 нм - 1,76; при 270-300 нм 0,606 у.е. Суммарная оптическая плотность превышала таковой показатель у доноров в 2,2 раза; при 210-220 нм в 1,39 раза; при 230-260 нм - в 4,6 раза; при 270-300 нм в 3,18 раза.

Использование предлагаемого способа выявило увеличение оптической плотности в диапазоне 210-300 нм, особенно значительным оно было в области 230-260 нм и 270-300 нм. Следовательно, предлагаемый способ позволил быстро получить количественную спектральную характеристику супернатанта эритроцитов, указывающую на повреждение мембран эритроцитов.

Время, затраченное на проведение указанного анализа, составило 40 минут.

Пример 2.

Больная Д., диагноз: рак восходящего отдела толстой кишки. При поступлении в стационар суммарная величина оптической плотности супернатанта эритроцитов в интервале длин волн 210-300 нм составляла 4,47 у.е., что в 2,5 раза выше уровня доноров. При 210-220 нм величина оптической плотности была 1,86, т.е. в 1,86 раза выше чем у доноров. В диапазоне 230-260 нм показатель оптической плотности равнялся 1,95 у.е. Увеличение по сравнению с донором в 5,13 раза. Показатель оптической плотности при 270-300 нм превосходил донорский уровень в 3,4 раза, составляя 0,648 у.е. Время, затраченное на проведение указанного анализа, составило 40 минут.

Таким образом, предлагаемый способ позволил через 40-50 минут после забора крови получить данные о нарушениях мембран эритроцитов.

Пример 3.

Больной Б.Д., диагноз: распространенный гнойный перитонит. При поступлении в стационар суммарная величина оптической плотности супернатанта эритроцитов в области 210-300 нм равнялась 3,98 у.е.; в интервале 210-220 нм - 1,45 у.е.; 230-260 нм - 1,54 у.е.; 270-300 нм - 0,983 у.е. Эти показатели превосходили аналогичные у доноров, в 2,2 раза; в 1,2 раза; в 4,0 раза и в 5 раз, соответственно. Время, затраченное на проведение указанного анализа, составило 40 минут.

Проведение анализа по заявленному способу показало значительное увеличение, как суммарной оптической плотности, так и в выбранных точках спектральной кривой. Это свидетельствовало об увеличении сорбционной способности мембран эритроцитов вследствие их повреждения.

Таким образом, предлагаемый способ позволил через 40 мин после забора крови получить данные о нарушениях мембран эритроцитов.

После проведения 2-х сеансов плазмафереза с ультрафиолетовым облучением крови состояние больного улучшилось, изменились и спектральные характеристики супернатанта эритроцитов. Суммарное содержание оптической плотности снизилось в 7,3 раза. Снизилось пики в областях 210-220 нм в 14,9 раза; 230-260 нм - в 7,9 раза; 270-300 - в 3,2 раза, т.е. предложенным способом установлены явные позитивные изменения в состоянии мембран эритроцитов.

Всего было обследовано 35 больных ИБС, 31 больной с раком толстой кишки, 6 больных с распространенным гнойным перитонитом. У всех больных состояние мембран эритроцитов оценивали одновременно как по заявляемому способу, так и по способу прототипу.

В результате заявляемым способом были обнаружены изменения спектральных характеристик супернатантов эритроцитов, указывающие на повреждение мембран, у всех обследованных больных. Только у 25 больных, обследованных по способу прототипу, были определены достоверные изменения продуктов перекисного окисления липидов в эритроцитах при поступлении на стационарное лечение.

Таким образом, заявляемый способ позволяет установить повреждение мембран эритроцитов, осуществлять контроль за ходом и эффективностью проводимого лечения, сократить время проведения анализа по сравнению с известным техническим решением в 2-2,5 раза. Немаловажным обстоятельством является и то, что способ основан на использовании дешевых и доступных реагентов.

Изобретение относится к медицине, в частности к биохимии. Для осуществления способа берут пробы крови, выделяют эритроциты, обрабатывают их ацетонитрилом, центрифугируют, регистрируют спектральные характеристики супернатанта в диапазоне длин волн 210-300 нм и определяют величины суммарной оптической плотности. Изменение величины суммарной оптической плотности по сравнению с аналогичными показателями доноров в 1,5 раза и более свидетельствует о повреждении мембран эритроцитов. Использование способа позволяет повысить точность идентификации продуктов метаболического пула мембран эритроцитов. 2 ил.

Способ определения состояния мембран эритроцитов, включающий взятие пробы крови, выделение, обработку эритроцитов и последующую регистрацию спектральных характеристик супернатанта, по которым устанавливают наличие или отсутствие повреждений мембран эритроцитов, отличающийся тем, что к выделенным эритроцитам добавляют ацетонитрил в соотношении 1:1, перемешивают и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин, регистрацию спектральных характеристик супернатанта проводят в диапазоне длин волн 210-300 нм через каждые 10 нм, после чего определяют величину суммарной оптической плотности, при увеличении которой в 1,5 раза и более по сравнению с аналогичными показателями доноров устанавливают повреждение мембран эритроцитов.