БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ СПОР И ВЕГЕТАТИВНЫХ КЛЕТОК Bacillus anthracis Российский патент 2011 года по МПК A61L2/18 A61L101/52 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к дезинфицирующим средствам для уничтожения спор и вегетативных клеток Bacillus anthracis.

К средствам дезинфекции при сибирской язве, рекомендованным к применению в чрезвычайных ситуациях [1], относятся галогены и их производные (хлорная известь, гипохлорит кальция, ДП-2 и др.), окислители (пергидроль, перфторид калия и др.), альдегиды (формальдегид, глутаровый альдегид и др.). Также широко применяются щелочи, фенолы, спирты, газы (окись этилена, бромид метилена и др.).

Наиболее часто для дезинфекции применяется перекись водорода, препараты хлора (хлорная известь, хлорамин), надуксусная кислота, газы - диоксид хлора и окись этилена.

Большинство из разрешенных к применению химических дезинфицирующих средств токсичны, аллергенны, вызывают раздражение кожи и слизистых, раздражают верхние дыхательные пути (препараты хлора, альдегиды). Помимо этого, дезинфицирующие средства, обладающие спороцидной активностью, имеют короткий срок хранения (гипохлориты, альдегиды), низкую стабильность (препараты хлора, надуксусная кислота), обладают высокой коррозионной активностью (хлорсодержащие препараты), взрывоопасны и пожароопасны (надуксусная кислота). Также при применении химических дезинфицирующих средств требуется многократная отмывка помещений и приборов после проведения дезинфекции.

В 50-х годах XX века предпринимались попытки оздоровления зараженной почвы от Bacillus anthracis путем посева тех или иных культурных растений [2], однако, обнадеживающих данных по «освобождению» почв от возбудителя сибирской язвы получено не было.

Сведений о биологических препаратах, предназначенных для нейтрализации спор Bacillus anthracis, нами в литературе не обнаружено.

Задачей заявляемого технического решения является расширение номенклатуры дезинфицирующих средств, используемых при сибирской язве путем создания биологического препарата для нейтрализации спор и вегетативных клеток Bacillus anthracis на базе комплекса бактериофагов.

Поставленная задача решается тем, что предложен препарат для нейтрализации спор и вегетативных клеток Bacillus anthracis, представляющий собой водный раствор, содержащий в качестве действующего начала смесь бактериофагов Bacillus anthracis OZR-1, Bacillus anthracis Ф-2, Bacillus anthracis ФАУТ при соотношении активностей (БОЕ/см³) Bacillus anthracis OZR-1: Bacillus anthracis Ф-2: Bacillus anthracis ФАУТ=1:(0,2-1):(0,1-1) и активатор прорастания спор L-аланин.

Существенным признаком изобретения является использование смеси трех новых фагов, каждый из которых обладает литической активностью к прорастающим спорам и вегетативным клеткам Bacillus anthracis и действие которых при совместном использовании дополняет друг друга. Однако, так как бактериофаги не действуют на покоящиеся споры Bacillus anthracis, препарат дополнительно содержит активатор прорастания спор, в данном случае - L-аланин, который способствует переходу покоящихся спор в стадию активации и последующего прорастания в вегетативные клетки.

Препарат получают смешением в водной среде L-аланина с комплексом бактериофагов, выращенных по отдельности и смешанных в заданных соотношениях.

Концентрация компонентов, необходимая для обработки в том или ином случае, зависит от обсемененности обрабатываемой поверхности, но предпочтительно, препарат используют в виде водного раствора, содержащего смесь бактериофагов в концентрации 10¹⁰-10¹² БОЕ/л и активатор прорастания спор в концентрации 0.05-0.15 моль/л. Данные концентрации рассчитаны исходя из максимальной дозы заражения спорами (10⁶ спор/см²), но могут быть использованы и при меньшей обсемененности, так как при отсутствии объекта дезинфекции бактериофаги самоликвидируются и даже при избыточной концентрации препарата после проведения дезинфекции не требуется дополнительная очистка.

Как правило, для удобства использования смешение отдельно хранящихся L-аланина и комплекса бактериофагов осуществляют в растворе непосредственно перед применением. В качестве растворителя чаще всего используют физиологический раствор (0,9% раствор NaCl), однако, могут быть использованы также буферные растворы, например фосфатный буфер, фосфатно-цитратный, трис-буфер и др.

Для лучшего хранения и удобства использования комплекс бактериофагов дополнительно может содержать стабилизаторы и консерванты, в качестве которых могут быть использованы любые обычно применяемые для этих целей химические соединения, например сахароза, желатин и хинозол.

Для получения препарата используют следующие штаммы бактериофагов. Бактериофаг Bacillus anthracis OZR-1, депонирован 15.01.2007 г. в коллекции микроорганизмов ОАО "Институт инженерной иммунологии" (Россия, 142380, Московская область, Чеховский район, пос.Любучаны), регистрационный номер номер Jn-08.

Штамм бактериофага OZR-1 получен из лизогенной культуры Bacillus cereus штамм №ИИИ-32 методом индукции профага воздействием ультрафиолетового облучения с помощью облучателя Viber Lourmat при длине волны 260 нм в течение 105 секунд по методу Lwoff А. [3].

Морфологические признаки

Головка 51-53 нм, хвостовой отросток 20-40 нм.

На газоне чувствительных бактериальных культур Bacillus anthracis фаг OZR-1 образует круглые, прозрачные пятна лизиса 2 мм в диаметре. Центр прозрачный, край четкий, вторичный рост отсутствует.

Тип нуклеиновой кислоты штамма фага - ДНК

Физико-химические свойства.

Фаг не инактивируется при нагревании суспензии в течение 30 мин при 56°С. Пределы допустимых значений рН, при которых литическая активность фага не изменяется, составляют 6,4-8,7. Устойчив к облучению ультрафиолетом в течение 5 мин при длине волны 260 нм.

Литический спектр бактериального вируса.

Для оценки круга штаммов-хозяев фага была использована коллекция вакцинных штаммов Bacillus anthracis и близкородственных микроорганизмов, всего 32 штамма: В. anthracis СТИ-1, В. anthracis Sterne 34F2, В. anthracis 2-я вакцина Ценковского, пять штаммов В. thuringiensis, 3 штамма В. brevis, 3 штамма В. subtilis, 11 штаммов В. cereus, В. antracoides №217, В. megaterium №1412.

Бактериофаг OZR-1 лизирует вакцинные сибиреязвенные штаммы Bacillus anthracis СТИ-1, Bacillus anthracis Ценковского II, Bacillus anthracis Sterne 34F2. Диапазон специфичности - лизирует Bacillus anthracis.

Бактериальный штамм для поддержания и размножения бактериофага - вакцинный штамм Bacillus anthracis СТИ-1 (депонирован 01.10.1993 г. в коллекции микроорганизмов ОАО "Институт инженерной иммунологии" (Россия, 142380, Московская область, Чеховский район, пос. Любучаны), регистрационный номер 1/10-93).

Оптимальные условия размножения

Штамм фага размножается на чувствительной культуре Bacillus anthracis СТИ-1 в жидкой и на плотной питательных средах, включающих 1,5% панкреатического перевара мяса (ГРМ-бульон [4]), при температуре 35±0,5°С, вызывая при этом просветление среды после 4-6-часовой инкубации, а на простом питательном агаре [5] образуя негативные прозрачные колонии правильной формы после 16-18-часовой инкубации

Способ размножения: при воспроизведении фага в клетке-хозяине продолжительность латентного периода составляет 30-35 мин, урожайность - 200-220 частиц на одну клетку.

Условия хранения

Бактериофаг Bacillus anthracis OZR-1 сохраняет литические свойства в течение 3 лет хранения при температуре (4-6)°С в лиофилизированном состоянии в герметически закрытой ампуле.

Бактериофаг Bacillus anthracis Ф-2 депонирован 05.02.2007 г. в коллекции микроорганизмов ОАО "Институт инженерной иммунологии" (Россия, 142380, Московская область, Чеховский район, пос. Любучаны), регистрационный номер номер Jn-09.

Штамм бактериофага Ф-2 получен из сточных вод г.Пущино.

Морфологические признаки

Головка икосаэдрической формы 82-94 нм, сокращающийся хвостовой отросток 158-162 нм. На газоне чувствительных бактериальных культур Bacillus anthracis фаг Ф-2 образует круглые, прозрачные пятна лизиса диаметром 2-3 мм. Центр прозрачный, край четкий, вторичный рост отсутствует.

Тип нуклеиновой кислоты штамма фага - ДНК.

Физико-химические свойства

Фаг не инактивируется при нагревании суспензии в течение 30 мин при 56°С. Пределы значений рН, при которых литическая активность фага не изменяется, составляют 6,0-8,5. Устойчив к облучению ультрафиолетом в течение 10 мин при длине волны 260 нм.

Литический спектр бактериального вируса

Для оценки круга штаммов-хозяев фага была использована коллекция вакцинных штаммов Bacillus anthracis и близкородственных микроорганизмов, всего 32 штамма: В. anthracis СТИ-1, В. anthracis Sterne 34F2, В. anthracis 2-я вакцина Ценковского, пять штаммов В. thuringiensis, 3 штамма В. brevis, 3 штамма В. subtilis, 11 штаммов В. cereus, В. antracoides №217, В. megaterium №1412.

Бактериофаг Ф-2 лизирует сибиреязвенные штаммы: Bacillus anthracis СТИ-1, Bacillus anthracis Sterne 34F2, Bacillus anthracis 2-я вакцина Ценковского. Диапазон специфичности - лизирует Bacillus anthracis.

Бактериальный штамм для поддержания и размножения бактериофага - вакцинный штамм Bacillus anthracis СТИ-1.

Оптимальные условия размножения

Штамм фага размножается на чувствительной к нему культуре Bacillus anthracis СТИ-1 в жидкой и на плотной питательных средах, включающих 1,5% панкреатического перевара мяса (ГРМ-бульон), при температуре 37±0,5°С, вызывая при этом просветление среды после 6-8 часовой инкубации, а на плотной питательной среде образуя негативные прозрачные колонии правильной формы после 16-18-часовой инкубации.

Способ размножения: при воспроизведении фага в клетке-хозяине (штамм СТИ-1) продолжительность латентного периода составляет 40-50 мин, урожайность - 130-160 частиц на одну клетку.

Условия хранения

Бактериофаг Ф-2 сохраняет литические свойства в лиофильно высушенном состоянии в герметически закрытой ампуле при температуре хранении 4-6°С в течение 3 лет.

Периодичность пересевов 3 года.

Бактериофаг Bacillus anthracis ФАУТ депонирован 19.02.2007 г. в коллекции микроорганизмов ОАО "Институт инженерной иммунологии" (Россия, 142380, Московская область, Чеховский район, пос. Любучаны), регистрационный номер Jn-10.

Штамм бактериофага Bacillus anthracis ФАУТ получен из лизогенной культуры Bacillus cereus штамм №ИИИ-47 методом индукции профага воздействием ультрафиолетового облучения с помощью облучателя Viber Lourmat при длине волны 260 нм в течение 70 с по методу Lwoff А.

Морфологические признаки

Головка икосаэдрической формы 80-82 нм, хвостовой отросток 270-280 нм.

На газоне чувствительных бактериальных культур Bacillus anthracis фаг ФАУТ образует круглые, прозрачные пятна лизиса 2 мм в диаметре. Центр прозрачный, край четкий, вторичный рост отсутствует.

Тип нуклеиновой кислоты штамма фага - ДНК.

Физико-химические свойства.

Фаг не инактивируется при нагревании суспензии в течение 30 мин при 56°С. Пределы значений рН, при которых литическая активность фага не изменяется, составляют 6,0-8,0. Устойчив к облучению ультрафиолетом в течение 10 мин при длине волны 260 нм.

Литический спектр бактериального вируса

Для оценки круга штаммов-хозяев фага была использована коллекция вакцинных штаммов В. anthracis и близкородственных микроорганизмов, всего 32 штамма: В. anthracis СТИ-1, В. anthracis Sterne 34F2, В. anthracis 2-я вакцина Ценковского, пять штаммов В. thuringiensis, 3 штамма В. brevis, 3 штамма В. subtilis, 11 штаммов В.cereus, В.antracoides №217, В.megaterium №1412.

Бактериофаг Bacillus anthracis ФАУТ лизирует сибиреязвенные штаммы: Bacillus anthracis СТИ-1, Bacillus anthracis Sterne 34F2, Bacillus anthracis 2-я вакцина Ценковского.

Диапазон специфичности: лизирует Bacillus anthracis.

Бактериальный штамм для поддержания и размножения бактериофага вакцинный штамм Bacillus anthrtacis СТИ-1.

Оптимальные условия размножения

Штамм фага размножается на чувствительной культуре Bacillus anthracis СТИ-1 в жидкой и на плотной питательных средах, включающих 1,5% панкреатического перевара мяса (ГРМ-бульон), при температуре 33±0,5°С, вызывая при этом просветление среды после 6-8-часовой инкубации, а на простом питательном агаре образуя негативные прозрачные колонии правильной формы после 16-18-часовой инкубации.

Способ размножения: при воспроизведении фага в клетке-хозяине продолжительность латентного периода составляет 48-60 мин, урожайность - 140-160 частиц на одну клетку.

Условия хранения

Бактериофаг Bacillus anthracis ФАУТ в лиофилизированном состоянии в герметически закрытой ампуле сохраняет литические свойства в течение 3 лет хранения при температуре 4-6°С. Периодичность пересевов 3 года.

Пример №1. Культивирование фага Bacillus anthracis OZR-1

В колбу объемом 500 см³ с 50 см³ питательной среды (ГРМ-бульон) вносят 1 см³ споровой суспензии Bacillus anthracis СТИ-1, прогретой при 85°С в течение 5 мин, с концентрацией 1,0-10⁹ кл/см³ и подращивают 7 часов при температуре 37°С, затем добавляют бактериофаг из расчета множественности инфекции 1:50. После этого продолжают инкубировать при 37±0,5°С в течение 6 ч до почти полного просветления фаголизата. Полученный фаголизат осветляют центрифугированием, затем супернатант фильтруют через стерилизующие фильтры с диаметром пор 1,2 мкм, 0,45 мкм и 0,22 мкм. В стерильном препарате фага определяют концентрацию (БОЕ/см³) по методу Грациа [6]. Титр штамма бактериофага 2,0×10⁸ БОЕ/см³.

Пример №2. Культивирование фага Bacillus anthracis Ф-2

В колбу объемом 500 см³ с 50 см³ питательной среды (ГРМ-бульон) вносят 0,1 см³ споровой культуры (4,0-10 спор/см³) Bacillus anthracis СТИ-1, прогретой при 85°С 5 мин, и подращивают 6 ч при температуре 37°С, затем добавляют бактериофаг из расчета фаг/клетка: 1:10. После этого продолжают инкубировать при 37±0,5°С в течение 6 ч до почти полного просветления фаголизата. Полученный фаголизат осветляют центрифугированием, затем супернатант фильтруют через стерилизующие фильтры с диаметром пор 1,2 мкм, 0,45 мкм и 0,22 мкм. В стерильном препарате фага определяют концентрацию (БОЕ/см³) по методу Грациа. Титр штамма бактериофага 9,1×10⁸ БОЕ/см³.

Пример №3 Культивирование фага Bacillus anthracis ФАУТ

В колбу объемом 500 см³ с 50 см³ питательной среды (ГРМ-бульон) вносят 1 см³ споровой суспензии Bacillus anthracis СТИ-1, прогретой при 85°С 5 мин, концентрации 1,0·10⁹ кл./см³ и подращивают 5 ч при температуре 37°С, затем добавляют бактериофаг из расчета множественности инфекции: 1:20. После этого продолжают инкубировать при 33±0,5°С в течение 7 ч до почти полного просветления фаголизата. Полученный фаголизат осветляют центрифугированием, затем супернатант фильтруют через стерилизующие фильтры с диаметром пор 1,2 мкм, 0,45 мкм и 0,22 мкм. В стерильном препарате фага определяют концентрацию БОЕ по методу Грациа. Титр штамма бактериофага 8×10⁸ БОЕ/см³.

Пример №4. Получение комплекса бактериофагов

Для приготовления комплекса бактериофагов берут сконцентрированные препараты каждого бактериофага со специфической активностью не менее 10¹¹ БОЕ/см³.

Концентрирование суспензий фагов осуществляют на установке системы Pellicon 3 Micro Millipore.

После концентрирования титры штаммов по Грациа составили:

фага Bacillus anthracis OZR-1 - 7,0×10¹¹ БОЕ/см³,

фага Bacillus anthracis Ф-2 - 4,0×10¹¹ БОЕ/см³,

фага Bacillus anthracis ФАУТ - 5,0×10¹¹ БОЕ/см³.

Для приготовления комплекса смешивают сконцентрированные суспензии каждого бактериофага в количестве по 25 см³. Соотношение активностей в комплексе составляет Bacillus anthracis OZR-1: Bacillus anthracis Ф-2: Bacillus anthracis ФАУТ=1:0,6:0,7.

При непрерывном перемешивании в смесь вводят стабилизаторы и консервант: сахарозу (30 г), желатин (7,5 г), хинозол (0,045 г). Полученный жидкий комплекс бактериофагов разливают по 0,2 см³ в ампулы объемом 2 см³, лиофильно высушивают в ампулах, ампулы заполняют инертным газом (в данном случае аргоном) и запаивают.

Пример №5. Получение препарата и его применение

Одну ампулу комплекса бактериофагов по примеру 4 разводят в 1 л физиологического раствора и добавляют L-аланин (AppliChem, Германия) в количестве 8,909 г, (100 мМ).

Получают препарат, содержащий смесь бактериофагов в концентрации 10¹¹ БОЕ/л и активатор прорастания спор в концентрации 0.1 моль/л.

Участки лабораторного помещения (пол, стены, столы), а также поверхностные участки имеющегося оборудования (спектрофотометр СФ-56М, ФЭК 56М, центрифуга Т-23), обсемененные спорами Bacillus anthracis СТИ-1 в концентрации от 10³ до 10⁶ спор/см² обрабатывают препаратом из пульверизатора (NiTO MiniSpray). Общая площадь обрабатываемой поверхности составляет примерно 10 м².

Обработку проводят двукратно с интервалом 120 мин.

Через 2 часа после повторной обработки смывы с обработанной контаминированной поверхности высевают на плотную питательную среду и подсчитывают количество колоний. При первоначальной обсемененности поверхности, равной 10⁶ спор/см², после двукратной обработки остается 1-2 живые споры/см², что соответствует международным требованиям к дезинфектантам [7].

Если доза заражения помещения меньше и составляет, например, 10-100 спор/см², то для получения хорошего результата одну ампулу препарата и 13, 36 г активатора достаточно развести в 100 л физиологического раствора (получают смесь бактериофагов в концентрации 10⁹ БОЕ/л, при концентрации активатора 0,0015 моль/л), что позволит обработать 500 м² зараженной поверхности.

В силу своей природы, предложенный препарат обладает пролонгированным действием, так как его концентрация не уменьшается, а увеличивается в 150-200 раз каждые 35-50 мин в геометрической прогрессии за счет размножения бактериофагов в прорастающих спорах и вегетативных клетках Bacillus anthracis. Действие препарата начинает проявляться через 20-30 мин с момента начальной обработки и действует до полного уничтожения спор, поскольку действие фагов проявляется до тех пор, пока присутствует возбудитель инфекции. При этом, как уже было сказано, при отсутствии объекта дезинфекции бактериофаги самоликвидируются и, следовательно, после проведения дезинфекции не требуется, в отличие от химических средств, дополнительной очистки.

Безопасность предложенного препарата обеспечивается тем, что специфические бактериофаги не взаимодействуют с другими микроорганизмами и клетками макроорганизмов, поэтому, попадая в окружающую среду, они не оказывают негативного воздействия.

Проведенная проверка показала, что препарат экологически безопасен, не токсичен, не вызывает местного раздражения кожи и слизистых, не вызывает аллергических реакций, не действует на эукариотические клетки. В соответствии с ГОСТ 12.1.007-76 препарат является безвредным.

Список литературы

1. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)»

2. Ветеринария, 1951, №3, с.33-35.

3. Мейнелл Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология. М., 1967.

4. ТУ 9398-021-78095326-2006.

5. ТУ 9398-020-78095326-2006.

6. М.А.Адамс. Бактериофагия. М., 1961.

7. Современные средства и методы дезинфекции, применяемые при работе с патогенами. Материалы международного семинара (под ред. Г.Н. Лепешкина). - Киров: ООО НПЦ ЭМ «РАЦЕМ», 2006. 291 с.

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой дезинфицирующий препарат для нейтрализации спор и вегетативных клеток Bacillus anthracis, представляющий собой водный раствор, содержащий смесь бактериофагов Bacillus anthracis OZR-1, Bacillus anthracis Ф-2, Bacillus anthracis ФАУТ при соотношении активностей (БОЕ/см³) Bacillus anthracis OZR-1: Bacillus anthracis Ф-2: Bacillus anthracis ФАУТ=1:(0,2-1):(0,1-1) и активатор прорастания спор L-аланин. Изобретение обеспечивает пролонгированное дезенфицирующее действие и является безопасным. 1 з.п. ф-лы.

1. Дезинфицирующий препарат для нейтрализации спор и вегетативных клеток Bacillus anthracis, представляющий собой водный раствор, содержащий смесь бактериофагов Bacillus anthracis OZR-1, Bacillus anthracis Ф-2, Bacillus anthracis ФАУТ при соотношении активностей (БОЕ/см³) Bacillus anthracis OZR-1: Bacillus anthracis Ф-2: Bacillus anthracis ФАУТ=1:(0,2-1):(0,1-1) и активатор прорастания спор L-аланин.

2. Препарат по п.1, отличающийся тем, что он представляет собой водный раствор, содержащий смесь бактериофагов в концентрации 10¹⁰-10¹² БОЕ/л и активатор прорастания спор в концентрации 0,05-0,15 моль/л.