ШТАММ БАКТЕРИОФАГА Bacillus anthracis R/D, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СИБИРЕЯЗВЕННОЙ ИНФЕКЦИИ, ЖИДКИЙ ПРЕПАРАТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СИБИРЕЯЗВЕННОЙ ИНФЕКЦИИ И ПРЕПАРАТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ СИБИРЕЯЗВЕННОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 2009 года по МПК C12N7/00 A61K35/76 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии, а именно к выделению нового видоспецифического вирулентного штамма сибиреязвенного бактериофага для получения диагностического препарата.

Выделенные ранее сибиреязвенные бактериофаги Гамма, К-ВИЭВ, ВА-9 лизируют некоторые штаммы близкородственных бацилл, что является отрицательным фактором в диагностике сибиреязвенной инфекции [1, 2, 3]. Сибиреязвенные бактериофаги, активные к Bacillus anthracis и не лизирующие близкородственные бациллы, в настоящее время не известны (объект изобретения на штамм прототипа не имеет). Поэтому поиск и выделение сибиреязвенного фага, лизирующего сибиреязвенные штаммы и неактивного к близкородственным бациллам, является актуальным исследованием.

Известны способы идентификации возбудителя сибиреязвенной инфекции, основанные на выявлении фенотипических признаков вида: антигенная структура, биохимические свойства [4].

Недостатки этих способов связаны с нестабильностью фенотипических свойств микроорганизмов, что требует при идентификации вида изучения комплекса фенотипических признаков, и окончательный результат возможен на четвертые-седьмые сутки.

Разработаны генотипические способы идентификации сибиреязвенной инфекции [5]. Для генотипических способов диагностики необходимы трудоемкие и длительные по времени (30 дней) исследования по клонированию геномов, использованию ДНК-зондов, клонированию ДНК-плазмид. В связи с этим актуальными остаются исследования, направленные на поиск диагностических средств сибиреязвенной инфекции.

Идентификация возбудителя с помощью фага является важным критерием для диагностики различных инфекций [6]. Фаги, специфически лизирующие определенный вид микроорганизмов, применяют в практике как диагностические. Преимущества фагодиагностики заключается в том, что она на несколько суток опережает биохимические, серологические, генетические способы диагностики, не требует выделения чистой культуры бактерий, технически проста и доступна. Для целей фагодиагностики необходимы фаги, равно активные на всех представителях вида бактерий. Этим требованиям удовлетворяют высоковирулентные расы фагов, которые выделяются из сточных вод или клинических материалов.

Препараты на основе бактериофагов для диагностики сибиреязвенной инфекции в литературе не описаны.

Задача изобретения - получение нового штамма видоспецифического бактериофага для идентификации бактерий Bacillus anthracis, не лизирующего близкородственные бациллы, и препарата на его основе для диагностики сибиреязвенной инфекции.

Поставленная задача решается тем, что предложен новый штамм бактериофага Bacillus anthracis R/D-Ph-6, используемый для получения препарата для диагностики сибиреязвенной инфекции, жидкий препарат, содержащий суспензию частиц видоспецифического бактериофага Bacillus anthracis R/D-Ph-6 с литической активностью 10¹⁰ БОЕ/см³ и стабилизирующую добавку при следующем содержании компонентов, мас.%:

суспензия частиц бактериофага Bacillus   anthracis R/D-Ph-6   с литической активностью 10¹⁰ БОЕ/см³ - 10,0-20,0 1%-ный раствор хинозола - 0,5-1,0 физиологический раствор - остальное,

и сухой препарат в качестве стабилизирующей добавки содержит сахарозу, желатин, хинозол при следующем содержании компонентов (мас.%):

сахароза - 35,0-40,0 желатин - 6,0-10,0 хинозол - 0,03-0,06 сухая масса частиц бактериофага Bacillus   anthracis R/D-Ph-6   с литической активностью 10¹⁰ БОЕ/см³ - остальное.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является новый штамм бактериофага Bacillus anthracis, авторское название R/D, выделенный из сточных вод, обладающий высокой литической активностью в отношении сибиреязвенных штаммов, не лизирующий близкородственные бациллы, и жидкая и сухая форма препарата для диагностики сибиреязвенной инфекции на основе штамма бактериофага Bacillus anthracis R/D. Кроме того, препарат дополнительно содержит желатин, сахарозу и хинозол.

Желатин (белок), обладающий амфотерными свойствами, которые являются стабилизатором для биологически активных компонентов биопрепарата. Желатин разрешен к использованию в фармацевтической промышленности. Сахароза обладает стабилизирующими и защитными свойствами в процессе сушки и хранения биологически активных веществ.

Хинозол - мелкокристалический порошок лимонно-желтого цвета, является антибиотиком, обладающим антибактериальной и противогрибковой активностью, малотоксичен.

Штамм бактериофага Bacillus anthracis R/D хранится в официальной коллекции музея микроорганизмов - депозитарии России при ФГУН ГНЦ ПМБ (Федеральное государственное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии) под номером Ph-6.

Бактериофаг Bacillus anthracis R/D-Ph-6 характеризуется следующими свойствами: имеет икосаэдрическую головку диаметром 55 нм, не имеет хвостового отростка и принадлежит к морфотипу С [7]. На отдельных снимках виден рудимент хвостового отростка (см. чертеж).

В литературе не описаны сибиреязвенные фаги аналогичной морфологии. Тип нуклеиновой кислоты - ДНК.

Физико-химические свойства.

Бактериофаг Bacillus anthracis R/D-Ph-6 не инактивируется при температуре 55°С в течение 45 минут. Литическая активность фага не изменяется в пределах рН 5,7-8,0. Фаг устойчив к антибиотику хинозолу.

Морфология негативных колоний. На газоне культуры Bacillus anthracis СТИ-1 фаг формирует крупные прозрачные негативные колонии диаметром 2-3 мм. Одиночный цикл размножения характеризуется продолжительностью минимального латентного периода, равного 50-60 мин. Урожайность варьирует от 70-150 фаговых частиц на одну инфицированную клетку. Адсорбционная способность фага: при температуре 37°С за 10 минут адсорбируется 98% фага. Спектр литического действия: лизирует 99% изученных сибиреязвенных штаммов и не проявляет литической активности к 160 штаммам близкородственных бацилл: В.cereus, В.mycoides, В.subtilis, В.anthracoides, В.mesentericus, В.brevis, В.megaterium, В.thuringiensis. Бактериофаг Bacillus anthracis R/D-Ph-6 стабильно сохраняет литическую активность при длительном хранении (3 года). Осмотический шок инактивирует 35% фаговых частиц.

Способ размножения. Размножается на клетках Bacillus anthracis на плотной питательной среде ГРМ-агаре (по ФС42-3377-97, ТУ-9398-020-78095-326-2006) и в жидкой питательной среде ГРМ-бульоне (по ФС 42-3278-97, ТУ-9398-021-78095-326-2006).

Способ хранения. Суспензия фага R/D-Ph-6 хранится в жидком виде 2 года и лиофильном (сухом) виде при температуре (+4°С - +8°С) в течение 3-х лет.

Для практического использования на основе бактериофага R/D-Ph-6 созданы жидкая и сухая препаративные формы.

Возможность практического использования изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Выделение сибиреязвенного бактериофага R/D-Ph-6.

Для выделения нового бактериофага использовали схему изолирования чистых линий фагов из природных источников, разработанную Д.В. Поповым [8].

Исследовали литическую активность полученных образцов фагов к 10 штаммам сибиреязвенных культур и 20 штаммам близкородственных бацилл. В результате исследований выявлен бактериофаг, лизирующий сибиреязвенные штаммы и не проявляющий литической активности к близкородственным бациллам. Бактериофагу присвоено наименование - R/D-Ph-6.

Пример 2. Репродукция бактериофага Bacillus anthracis R/D-Ph-6.

Споровую культуру вакцинного сибиреязвенного штамма вносят в бульон Хоттингера из расчета 1,0·10⁹ спор на 100 см³ питательной среды с рН7,2 с добавлением 2,0 г/м³ экстрата дрожжей и 0,33 г/м³ кальция хлористого, инкубацию проводят в течение 4-х часов с аэрацией при 37°С, затем вносят бактериофаг (5,0 см³ из концентрации 1,0·10⁹ БОЕ/см³) и продолжают инкубацию при 34°С в течение 24 часов до полного лизиса бактериальной популяции. Полученный фаголизат центрифугируют 20 минут при 8000 об/мин и фильтруют через мембранные фильтры "Millipore" с диаметром пор 1,2 mM, 0,45 mM, 0,22 mM. Титр фага R/D-Ph-6 по Грациа составил 1,0·10¹⁰ БОЕ/см³.

Пример 3. Проверка спектра литической активности бактериофага Bacillus anthracis R/D-Ph-6 методом спот-тестирования.

На плотную питательную среду (ГРМ-агар) наносят 0,1 см³ (из концентрации 1,0·10⁷ кл./см³) 18-часовой исследуемой бульонной культуры Bacillus anthracis, растирают шпателем и наносят в центр 1 каплю (из концентрации 1,0·10⁷-1,0·10⁸ БОЕ/см³) суспензии бактериофага R/D-Ph-6. Посев инкубируют в течение 18 часов при 37°С. В случае если исследуемая культура относится к Bacillus anthracis, на бактериальном газоне наблюдается четкая зона специфического лизиса. Наличие лизиса является диагностическим признаком для идентификации культуры.

Пример 4. Приготовление жидкой формы препарата на основе штамма бактериофага Bacillus anthracis R/D-Ph-6.

Споровую культуру вакцинного сибиреязвенного штамма вносят в бульон Хоттингера из расчета 1,0·10⁹ спор на 100 см³ питательной среды с рН7,2 с добавлением 2,0 г/м³ экстрата дрожжей и 0,33 г/м³ кальция хлористого, инкубацию проводят в течение четырех часов с аэрацией при 37°С, затем вносят бактериофаг (5,0 см³ из концентрации 1,0·10⁹ БОЕ/см³) и продолжают инкубацию при 34°С в течение 24 часов до полного лизиса бактериальной популяции. Полученный фаголизат центрифугируют 20 минут при 8000 об/мин и фильтруют через мембранные фильтры "Millipore" с диаметром пор 1,2 mM, 0,45 mM, 0,22 mM. Титр фага R/D-Ph-6 по Грациа составил 1·10¹⁰ БОЕ/см³. К полученной суспензии бактериофага Bacillus anthracis R/D-Ph-6 добавляют 0,05 см³ 1%-ного раствора хинозола в физиологическом растворе и получают жидкую форму препарата следующего состава (мас.%):

суспензия бактериофага Bacillus   anthracis R/D-Ph-6   с литической активностью 10¹⁰ БОЕ/ мл - 10,0 хинозол 1% -ный раствор - 0,05 физиологический раствор - остальное.

Пример 5. Приготовление жидкой формы препарата на основе бактериофага Bacillus anthracis R/D-Ph-6.

К суспензии бактериофага Bacillus anthracis R/D-Ph-6, полученной как в примере 4, добавляют 0,06 см³ 1%-ного раствора хинозола и получают жидкую форму препарата следующего состава, мас.%:

суспензия бактериофага Bacillus   anthracis R/D-Ph-6   с литической активностью 10¹⁰ БОЕ/мл - 20,0 хинозол 1%-ный раствор - 0,06 физиологический раствор - остальное.

Пример 6. Получение сухой формы препарата бактериофага Bacillus anthracis R/DP-Ph-6.

Споровую культуру вакцинного сибиреязвенного штамма вносят в бульон Хоттингера из расчета 1,0·10⁹ спор на 100 см³ питательной среды с рН7,2 с добавлением 2,0 г/м³ экстрата дрожжей и 0,33 г/м³ кальция хлористого, инкубацию проводят в течение 4-х часов с аэрацией при 37°С, затем вносят бактериофаг (5,0 см³ из концентрации 1,0·10⁹ БОЕ/см³) и продолжают инкубацию при 34°С в течение 24 часов до полного лизиса бактериальной популяции. Полученный фаголизат центрифугируют 20 минут при 8000 об/мин и фильтруют через мембранные фильтры "Millipore" с диаметром пор 1,2 mM, 0,45 mM, 0,22 mM. Титр фага R/D-Ph-6 по Грациа составил 1·10¹⁰ БОЕ/см³. К полученной суспензии бактериофага Bacillus anthracis R/D-Ph-6 со специфической активностью не менее 10¹⁰ БОЕ/см³, при непрерывном перемешивании одновременно вводят сахарозу (35,0 мас.%), желатин (6,0 мас.%), хинозол (0,03 мас.%). Полученный жидкий препарат разливают в ампулы по 0,5 см³ в каждую и замораживают при температуре -60°С. Процесс сушки препарата производят лиофилизацией в течение 18 часов. После окончания сушки ампулы заполняют инертным газом (аргоном) и запаивают.

Конечное содержание компонентов в сухом препарате, мас.%:

Сахароза - 35,0

желатин - 6,0

хинозол - 0,03

сухая масса бактериофага R/D- Ph-6 - остальное до 100%.

Пример 7. Получение сухой формы препарата бактериофага Bacillus anthracis R/D-Ph-6.

Суспензию бактериофага R/D-Ph-6 получают, как в примере 6. К суспензии бактериофага со специфической активностью не менее 10¹⁰ БОЕ/см³ при непрерывном перемешивании одновременно вводят сахарозу (40,0 мас.%), желатин (10,0 мас.%), хинозол (0,06 мас.%). Полученный жидкий препарат разливают в ампулы по 0,5 см³ в каждую и замораживают при температуре -60°С. Процесс сушки препарата производят лиофилизацией в течение 18 часов. После окончания сушки ампулы заполняют инертным газом (аргоном) и запаивают.

Конечное содержание компонентов в сухом препарате, мас.%:

сахароза - 40,0

желатин - 10,0

хинозол - 0,06

сухая масса бактериофага - остальное до 100%.

Пример 8. Проверка литической активности полученных препаратов.

Исследовали литическую активность жидкой и сухой формы диагностического препарата в процессе хранения.

Результаты исследований приведены в таблице 1.

Таблица 1 Данные по литической активности заявленных форм препарата на основе бактериофага Bacillus anthracis R/D-Ph-6 Показатель Температура хранения, °С Форма препарата Жидкая, БОЕ/ см³ Сухая, БОЕ/г Литическая активность фага после приготовления препарата +(4-8) 1,8·10¹⁰ 1,8·10¹⁰ после одного года хранения препарата +(4-8) 4,5·10⁹ 1,2·10¹⁰ после 3-летнего хранения препарата +(4-8) 4,0·10⁹ 9,0·10⁹

Из данных, представленных в таблице 1, следует, что бактериофаг хорошо сохраняет литическую активность после 3-летнего хранения как в жидкой, так и в сухой форме препарата.

Пример 9. Проверка диагностических свойств препарата.

Исследовали литическую активность препарата сухой и жидкой формы в отношении сибиреязвенных штаммов и близкородственных бацилл по методике, изложенной в примере 3. Определили литическую активность фага (исходная концентрация 1,0·10¹⁰ БОЕ/см³), разведенного 1:100000, в сухом и жидком препарате на плотной питательной среде (ГРМ-агар) к 60 сибиреязвенным штаммам.

Все исследованные сибиреязвенные штаммы лизировались без вторичного роста как сухой, так и жидкой формой диагностического препарата. Активности фага в жидкой и сухой форме диагностического препарата (концентрация фага 1,0·10⁹ БОЕ/см³, г) к 160 штаммам различных близкородственных бацилл не выявлено. Показана высокая литическая активность фага R/D-Ph-6 в диагностическом препарате в отношении сибиреязвенных штаммов. Это подтверждает заявленное назначение препарата для идентификации сибиреязвенного возбудителя.

Препарат позволяет сократить сроки лабораторной диагностики на 1-5 суток за счет сокращения этапа биологического исследования - "пестрый ряд". Достигается также экономический эффект за счет исключения использования дорогостоящих агглютинирующих сывороток.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование в микробиологии позволит организовать производство диагностического сибиреязвенного препарата, применение которого в медицине, ветеринарии обеспечит быструю идентификацию сибиреязвенного возбудителя для эффективного проведения лечебных и противоэпидемических мероприятий. Избирательный спектр литического действия бактериофага R/D-Ph-6 в препарате позволяет идентифицировать сибиреязвенные штаммы за 1-2 суток.

Список литературы

1. Антонов Б.И. Временное наставление по применению сибиреязвенного бактериофага "К" ВИЭВ для определения возбудителя сибирской язвы: Утверждено Главным управлением ветеринарии Минсельхоза СССР 15 июня 1967 г. / Б.И.Антонов, В.В.Борисова, П.М.Волкова // Справочник "Бактериальные инфекции". - М.: Агропромиздат, 1986. - С.17-27.

2. Ипатенко Н.Г. Испытание сибиреязвенных бактериофагов "К" ВИЭВ и Гамма МВА / Н.Г.Ипатенко, А.А.Маничев // Ветеринария. - 1989. - №2. - С.59-60.

3. Русалев B.C. Фагочувствительность аэробных спорообразующих бактерий // Ветеринария. - 1990. - №8. - С.29-31.

4. Матвеева К.И. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней / К.И.Матвеева, М.И.Соколова. - М., 1964. - 683 с.

5. Патент РФ №2037520, МПК C12N 1/00, опубл. 19.06.1995.

6. Патент РФ №2021369, МПК C12N 7/00, опубл. 15.10.1994.

7. Ackermann H.-W. Viruses of prokaryotes. Vol.II. Natural groups of bacteriophages / H.-W.Ackermann, M.S.Dubow - CRC Press. Boco Raton, 1987. - 242 p.

8. Попов Д.В. Разработка фагового препарата для лечения хронического гнойного среднего отита: дис. канд. мед. наук / Оболенск, 2003. - 113 с. - с.52.

Группа изобретений относится к области медицинской вирусологии и микробиологии. Штамм бактериофага Bacillus anthracis R/D, депонированный в коллекции музея микроорганизмов ГНЦПМ ПМБ под регистрационным номером Ph-6, используется для получения препарата для диагностики сибиреязвенной инфекции. Жидкий препарат для диагностики сибиреязвенной инфекции содержит суспензию частиц бактериофага Bacillus anthracis R/D-Ph-6 с литической активностью 10¹⁰ БОЕ/см³, хинозол 1%-ный раствор, при следующем содержании компонентов мас.%: суспензия бактериофага с литической активностью 10¹⁰ БОЕ/мл³ - 10,0-20,0, хинозол 1%-ный раствор - 0,5-1,0, физиологический раствор - остальное. Сухая форма препарата для диагностики сибиреязвенной инфекции содержит сухую массу частиц бактериофага Bacillus anthracis R/D-Ph-6 с литической активностью 10¹⁰ БОЕ/см³, сахарозу, желатин и хинозол при следующем содержании компонентов мас.%: сахароза - 35,0-40,0, желатин - 6,0-10,0, хинозол - 0,03-0,06, сухая масса частиц бактериофага с литической активностью 10¹⁰ БОЕ/см³ - остальное. Группа изобретений позволяет осуществить быструю идентификацию сибиреязвенного возбудителя для эффективного проведения лечебных и противоэпидемических мероприятий. 3 н.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.

1. Штамм бактериофага Bacillus anthracis R/D, депонированный в коллекции музея микроорганизмов ФГУН ГНЦ ПМБ под регистрационным номером Ph-6, используемый для получения препарата для диагностики сибиреязвенной инфекции.

2. Жидкий препарат для диагностики сибиреязвенной инфекции, содержащий суспензию частиц бактериофага Bacillus anthracis R/D-Ph-6 с литической активностью 10¹⁰ БОЕ/см³, хинозол 1%-ный раствор при следующем содержании компонентов, мас.%:
суспензия бактериофага   с литической активностью 10¹⁰ БОЕ/см³ 10,0-20,0 хинозол 1%-ный раствор 0,5-1,0 физиологический раствор остальное

3. Препарат для диагностики сибиреязвенной инфекции, содержащий сухую массу частиц бактериофага Bacillus anthracis R/D-Ph-6 с литической активностью 10¹⁰ БОЕ/см³, сахарозу, желатин и хинозол при следующем содержании компонентов, мас.%:
сахароза 35,0-40,0 желатин 6,0-10,0 хинозол 0,03-0,06 сухая масса частиц бактериофага   с литической активностью 10¹⁰ БОЕ/см³ остальное