Штамм бактериофага Bacillus anthracis Ф112PRE, используемый для специфической индикации возбудителя сибирской язвы Российский патент 2019 года по МПК C12N7/00 C12Q1/02 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии, а именно к выделению нового видоспецифического вирулентного штамма сибиреязвенного бактериофага для получения диагностического препарата. Штамм бактериофага Bacillus anthracis Ф112РRЕ, депонированный в коллекции музея микроорганизмов филиала федерального государственного бюджетного учреждения «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации (г. Екатеринбург), используется для получения препарата для индикации возбудителя сибиреязвенной инфекции и позволяет осуществить быструю идентафикацию микроба В. anthracis для эффективного проведения лечебных и противоэпидемических мероприятий.

Аналогами изобретения являются выделенные ранее сибиреязвенные бактериофаги Гамма А-26 и Fah-ВНИИВВиМ, которые, наряду с выраженной литической активностью по отношению к сибиреязвенному микробу, лизируют и некоторые штаммы близкородственных бацилл, что не позволяет достоверно проводить специфическую индикацию возбудителя сибирской язвы. Таким образом, в настоящее время в Российской Федерации и за рубежом отсутствуют видоспецифичные сибиреязвенные бактериофаги с широким спектром литической активности в отношении штаммов разных подвидов В. anthracis, но не лизирующие другие виды микроорганизмов, для специфической индикации возбудителя сибирской язвы. Поэтому поиск и выделение высоковирулентного сибиреязвенного бактериофага, лизирующего сибиреязвенные штаммы и неактивного к близкородственным бациллам, является актуальной задачей [1, 2, 3, 9, 10].

Известны способы идентификации возбудителя сибиреязвенной инфекции, основанные на выявлении фенотипических признаков вида В. anthracis [6, 7].

Недостатки этих способов связаны с нестабильностью фенотипических свойств микроорганизмов, что требует при идентификации вида изучения комплекса фенотипических признаков, и окончательный результат возможен через четыре-семь дней с начала проведения анализа.

Разработаны генотипические способы идентификации возбудителя сибиреязвенной инфекции, при использовании которых необходимы трудоемкие и длительные по времени исследования по клонированию геномов, использованию ДНК-зондов, клонированию ДНК-плазмид [5, 6]. В связи с этим актуальными остаются исследования, направленные на поиск альтернативных средств идентификации возбудителя сибиреязвенной инфекции.

Идентификация возбудителя с помощью фага является важным критерием для диагностики различных инфекций. Фаги, специфически лизирующие определенный вид микроорганизмов, применяют в практике как диагностические. Преимущество фагодиагностики заключается в том, что она на несколько суток опережает биохимические, серологические, генетические способы диагностики, не требует выделения чистой культуры бактерий, технически проста и доступна [4, 5, 6].

Следует отметить, что микробиологическая диагностика сибирской язвы так же основана на использовании методов специфической индикации, к которым, в том числе, относится тест на фаголизабельность [8].

Цель изобретения - поиск и выделение видоспецифического сибиреязвенного бактериофага, обладающего высокой видовой специфичностью к сибиреязвенному микробу, не лизирующего близкородственные бациллы и сохраняющего длительное время свои основные свойства.

Поставленная цель достигается тем, что предложен новый штамм сибиреязвенного бактериофага, позволяющий гарантированно дифференцировать штаммы В. anthracis от близкородственных микроорганизмов и сохраняющего свои свойства не менее 4-х лет.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является новый штамм бактериофага В. anthracis, авторское название Ф112РRЕ, обладающий высокой литической активностью в отношении сибиреязвенных штаммов, не лизирующий близкородственные бациллы.

Сущность изобретения состоит в получении селекционным путем нового штамма бактериофага при изучении естественной изменчивости исходной культуры - видоспецифического бактериофага ФПГ, выделенного из лизогенного штамма подвида ВА II В. anthracis [2].

Штамм бактериофага В. anthracis Ф112РRЕ хранится в специализированной коллекции музея микроорганизмов филиала федерального государственного бюджетного учреждения «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации (г.Екатеринбург).

Бактериофаг В. anthracis Ф112РRЕ характеризуется следующими свойствами: является крупным бактериальным вирусом с икосаэдрической головкой и сокращающимся хвостовым отростком. По классификации А.С.Тихоненко, фаг принадлежит морфотипу А1 (семейство Myoviridae). Расстояние между противоположными апикальными вершинами изометричной головки составляет 119-120 нм. Длина хвостового отростка - 196-197 нм. В отростке можно выделить ряд структурных элементов. Посредством шейки с размерами 12×8 нм хвост соединяется с головкой. Длина чехла в интактном состоянии составляет 184-185 нм, в сокращенном виде - 83-85 нм. Фаг не имеет воротничка. Аппарат адсорбции фага включают базальную пластинку и фибриллы. Тип нуклеиновой кислоты - ДНК. Бактериофаг В. anthracis Ф112РRЕ инактивируется при температуре 50°C в течение 30 минут. Литическая активность фага не изменяется в пределах рН 5,7-8,0. Фаг устойчив к антибиотику хинозолу. Морфология негативных колоний: на газоне роста индикаторного штамма В. anthracis «55-ВНИИВВиМ» культура данного бактериофага образует однородную популяцию негативных прозрачных колоний размером 3-4 мм.

Продолжительность латентного периода: 40 мин.

Урожайность: от 150 до 200 фаговых частиц на одну инфицированную клетку.

Адсорбционная способность фага: при температуре 37°C за 10 минут адсорбируется 84,8% фага на поверхности вегетативных клеток В. anthracis.

Спектр литического действия: лизирует 90,7% из изученных 632 сибиреязвенных штаммов и не проявляет литической активности к штаммам морфологического типа S подвида ВА III В. anthracis (всего 37 штаммов) и близкородственных бацилл (всего 160 штаммов): B.cereus, B.mycoides, B.subtilis, B.mesentericus, B.brevis, B.megaterium, B.thuringiensis. Бактериофаг Bacillus anthracis Ф112РRЕ стабильно сохраняет литическую активность при длительном хранении (4 года). Осмотический шок инактивирует 35% фаговых частиц.

Способ хранения: суспензия фага Ф112РRЕ хранится в лиофильном (сухом) виде при температуре (4±2)°C в течение 4-х лет.

Возможность практического использования изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Выделение сибиреязвенного бактериофага В. anthracis Ф112РRЕ.

Для получения чистых линий проводили пассаж бактериофага ФПГ методом Грациа с использованием индикаторного штамма 71/12 второй вакцины Ценковского, отбирали морфологически однотипные наиболее прозрачные негативные колонии диаметром более 2 мм. Данную операцию проводили шестикратно, получив таким образом морфологически однотипные прозрачные негативные колонии бактериофага диаметром 3-4 мм. При последующих пассажах на указанном индикаторном штамме полученный бактериофаг морфологических свойств не менял.

Пример 2. Репродукция бактериофага В. anthracis Ф112РRЕ

Репродукцию бактериофага проводят на вакцинном штамме В. anthracis «55-ВНИИВВиМ» с использованием плотной питательной среды на основе гидролизата рыбной муки (аминный азот 110-120 мг %, рН 7,2-7,4) и полужидкого 0,7% мясо-пептонного агара. В асептических условиях в пробирки разливают по 0,2 см³ споровой агаровой культуры В. anthracis 55-ВНИИВВиМ из разведения 1,0⋅10⁸ спор⋅см^-3 и 0,5 см³ бактериофага из разведения 1,0⋅10³ частиц⋅см^-3 (из расчета высева на 1 чашку от 400 до 600 фаговых частиц). Затем в пробирки добавляют по 2,5 см предварительно растопленного и охлажденного до температуры (46±1)°C 0,7% мясо-пептонного агара.

Приготовленную таким способом смесь тщательно перемешивают в пробирке, а затем осторожно распределяют вторым слоем по всей поверхности первого слоя 2,5% мясо-пептонного агара. После застывания среды чашки Петри агаром вниз помещают в термостат при температуре (36±1)°C на 18 часов выращивания. По окончании срока инкубации в каждую чашку добавляют по 5 см³ 0,9% раствора натрия хлорида. Для получения фаголизата отмывают фаговые частицы и остатки лизированных клеток вакцинного сибиреязвенного штамма 55-ВНИИВВиМ 0,9% раствором натрия хлорида. Полученный фаголизат центрифугируют 20 минут при 8000 об/мин и фильтруют через мембранные фильтры «Millipore» с диаметром пор 0,45-0.22 мкм. В полученном фильтрате определяют титр бактериофага по Грациа.

Пример 3. Проверка спектра литической активности бактериофага В. anthracis Ф112РRЕ методом спот-тестирования.

Испытание проводят по следующей методике: на плотную питательную среду (МПА-агар) наносят 0,1 см³ (из концентрации 1,0⋅10⁷ кл⋅см^-3) 18-часовой исследуемой бульонной культуры В. anthracis, растирают шпателем и наносят в центр 1 каплю (из концентрации 1,0⋅10⁷-1,0⋅10⁸ БОЕ/см³) фаголизата В. anthracis Ф112РRЕ. Посев инкубируют в течение 18 часов при 37°C. В случае, если исследуемая культура относится к В. anthracis, на бактериальном газоне наблюдается четкая зона специфического лизиса. Наличие лизиса является диагностическим признаком для идентификации культуры.

Пример 4. Проверка диагностических свойств бактериофага В. anthracis Ф112РRЕ.

Исследовали литическую активность бактериофага в отношении сибиреязвенных штаммов и близкородственных бацилл по методике, изложенной в примере 3. Определили литическую активность фага (исходная концентрация 1,0⋅10¹⁰ БОЕ⋅см^-3), разведенного 1:100000, к 632 сибиреязвенным штаммам.

Большинство штаммов (90,7%) В. anthracis лизировались бактериофагом Ф112РRЕ (без вторичного роста - штаммы подвидов BAI и В AIV, со вторичным ростом - штаммы подвидов ВА II и ВА III), при этом активности фага к 160 штаммам различных близкородственных бацилл, 24 и 37 штаммам В. anthracis морфологического типа S, подвидов ВА II и ВА III соответственно, не выявлено. Следует отметить, что последние не лизировались также ни одним из двух других испытанных бактериофагов (Гамма А-26 и Fah-ВНИИВВиМ) Показана высокая литическая активность фага В. anthracis Ф112РRЕ в диагностическом препарате в отношении большинства сибиреязвенных штаммов, выделенных из разных источников внешней среды, больных или погибших животных и людей. Это подтверждает заявленное назначение препарата для идентификации сибиреязвенного возбудителя.

Пример 5. Сравнение чувствительности различных подвидов В. anthracis к сибиреязвенным бактериофагам Ф112PRE, Гамма А-26 и Fah-ВНИИВВиМ.

Проведен анализ чувствительности бактериофага В. anthracis Ф112PRE в сравнении с коммерческими препаратами бактериофагов Гамма А-26 и Fah-ВНИИВВиМ по методике, изложенной в пункте 3. Результаты представлены в таблице 1. Показана более высокая литическая активность фага Ф112РRЕ в отношении сибиреязвенных штаммов, по сравнению с бактериофагами Гамма А-26 и Fah-ВНИИВВиМ.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование в микробиологии позволит организовать производство диагностического сибиреязвенного препарата, применение которого в медицине, ветеринарии обеспечит быструю идентификацию сибиреязвенного возбудителя для своевременного и эффективного проведения лечебных и противоэпидемических мероприятий. Избирательный спектр литического действия бактериофага В. anthracis Ф112РRЕ в препарате позволяет идентифицировать сибиреязвенные штаммы за 18-20 часов.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Васильев, П.Г. Чувствительность штаммов Bacillus anthracis, выделенных из разных источников внешней среды, к видоспецифическим сибиреязвенным бактериофагам / П.Г. Васильев, Ю.И. Иванов, Н.С. Садыков, В.В. Кожухов // Материалы юбилейной науч. конф. посвященной 70-летию НИИ Микробиологии МО РФ. Киров. - 1998. - С. 64.

2. Васильев, П.Г. Спектр литической активности видоспецифического сибиреязвенного бактериофага ФПГ / П.Г. Васильев, Л.И. Маринин, Р.Ш. Зиганшин, Н.В. Литусов, А.В. Сенькин, А.В. Степанов, А.Н. Шевцов, А.В. Маслов // Проблемы медицинской и экологической биотехнологии. В сб.: Тезисы докладов юбилейной научно-практической конференции, посвященной 25-летию ГНЦ ПМ. Оболенск. - 1999. - С. 33.

3. Гаврилов, В.А. Изучение диагностической ценности сибиреязвенных бактериофагов для идентификации штаммов разных подвидов Bacillus anthracis / В.А. Гаврилов, П.Г. Васильев, Н.В. Литусов, Е.В. Пименов, А.К. Галиуллин, А.Ф. Андрус, В.И. Фролов, Р.Ш. Зиганшин, А.Н. Забокрицкий, Н.С. Садков, А.В. Сенькин // Ветеринарная медицина. - 2004. - №4. - С. 13-15.

4. Генов, И. Диагностическая оценка некоторых ускоренных методов дифференциации Bacillus anthracis от других апатогенных спорообразующих бацилл / И. Генов // Вет. мед. науки (Болгария). - 1966. - Т. 3. - №3. - С. 247-253.

5. Завирюха, А.И. Дифференциальная диагностика возбудителя сибирской язвы от ложносибиреязвенных бацилл / А.И. Завирюха, А.П. Иванов // В сб.: Достижения и перспективы борьбы с сибирской язвой в СССР. - 1978. - С. 130-131.

6. Крылова, М.Д. Фаготипирование бактерий / М.Д. Крылова, - М., 1963.

7. Матвеева, К.И. Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней / К.И. Матвеева, М.И. Соколова. - М., 1964. - 683 с.

8. «Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы». Методические указания. МУК 4.2.2413-08.

9. Русалев, B.C. Фагочувствительность аэробных спорообразующих бактерий / B.C. Русалев // Ветеринария. - 1990. - №8. - С. 29-31.

10. Ипатенко, Н.Г. Испытание сибиреязвенных бактериофагов "К" ВИЭВ и Гамма МВА / Н.Г.Ипатенко, А.А.Маничев // Ветеринария. - 1989. - №2. - С. 59-60.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм бактериофага Bacillus anthracis Ф112PRЕ, предназначенный для специфической индикации возбудителя сибирской язвы, депонированный в специализированном музее коллекционных штаммов филиала государственного бюджетного учреждения «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации. Изобретение позволяет создать штамм сибиреязвенного бактериофага, обладающего высокой видовой специфичностью к сибиреязвенному микробу, не лизирующего близкородственные бациллы и сохраняющего длительное время свои основные свойства. 1 табл., 4 пр.

Штамм бактериофага Bacillus anthracis Ф112PRЕ, предназначенный для специфической индикации возбудителя сибирской язвы, депонированный в специализированном музее коллекционных штаммов филиала государственного бюджетного учреждения «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации.