СПЕЦИАЛИЗИРОВАННАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК АМНИОТИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ И ФИБРОБЛАСТОВ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2011 года по МПК C12N5/07 

Область применения

Изобретение относится главным образом к области медицинской диагностики, экспериментальной медицины и клеточной биологии. Изобретение может быть использовано для цитогенетического анализа клеток амниотической жидкости, а также культивирования клеток мезенхимального происхождения в лабораторных целях.

Уровень техники

Широкое внедрение методов пренатальной диагностики генетических заболеваний является актуальной задачей профилактического направления современной медицины. Раннее обнаружение наследственных патологий у плода обеспечивает прогнозируемые результаты ведения беременности, оценки генетических рисков, открывает возможности их предотвращения и купирования у новорожденных [1].

Проведение большинства процедур цитогенетической и генетической диагностики предполагает получение необходимого по количеству и качеству клеточного материала эмбриона/плода или структур трофобласта. Например, для рутинного цитогенетического анализа или FISH-гибридизации метафазных хромосом требуется репрезентативная выборка пролиферирующих клеток. С этой целью проводят культивирование полученного инвазивными методами клеточного материала в специальных средах, обеспечивающих активное размножение фетальных клеток in vitro [1, 2].

Известно, что в практике пренатальной диагностики (помимо хорионбиопсии и кордоцентеза) наиболее безопасным по способу получения способом получения фетального клеточного материала в период 12-23 недели беременности является получение клеток амниотической жидкости [1, 3].

Осажденные путем центрифугирования амниоциты подвергают размножению в присутствии стимуляторов клеточного роста в составе специальных сред, блокируют митоз на стадии метафазы и проводят кариологический/молекулярно-цитогенетический анализ in situ или в суспензионной культуре [3, 4].

Основной проблемой технологии работе культурой клеток амниотической жидкости является создание адекватной системы культивирования первичных флотирующих клеток, имеющих различные источники происхождения из тканей плода (уретральные, кожные, кишечные, миелоидные и др.) [5]. Следует отметить, что флотирующие в амниотической жидкости клетки часто ограничены по показателям жизнеспособности и клонального роста в культуре, что является непременным условием получения качественного материала для анализа. Только 10-40% всех клеток сохраняют жизнеспособность и обладают пролиферативным потенциалом для образования колоний размером до 500 клеток в течение 7-9 дней при культивировании в специальных средах [6]. На мировом биофармацевтическом рынке представлен ряд питательных сред для обеспечения процедуры эффективного культивирования клеток плодных тканей для проведения процедур пренатальной генетической диагностики [4]. Вместе с тем, лишь незначительное количество предлагаемых продуктов являются действительно эффективными и получившими признание в практике перинатологии. Качественный и количественный состав этих продуктов представляют коммерческую тайну и не раскрываются в открытой печати.

Из уровня техники известен отечественный патент RU 2236457 «СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ «ЛИМФОКАР» ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРЕФИРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ», описывающий разработку питательной среды «Лимфокар» для культивирования лимфоцитов периферической крови человека с целью проведения цитогенетического анализа. Очевидно, что разработанная среда может применяться также для размножения лимфоцитов пуповинной крови при проведении пренатальной диагностики. В то же время, процедура кордоцентеза требует специальной квалификации персонала, имеет повышенные риски связанные с контаминацией, травматической кровопотерей и преждевременным выкидышем.

С настоящим изобретением имеет соотношение патент US 5,879,937 «Cytokine-induced proliferation of amniotic t-cells», описывающий способ получения пролиферирующих Т-лимфоцитов при культивировании клеток амниотической жидкости в среде, содержащей комплекс цитокинов: IL-2, IL-4 и IL-7. Метод позволяет проводить цитогенетический анализ и процедуру HLA-типирования плода на предмет трансплантационной совместимости. Вместе с тем, предлагаемый метод имеет ограниченное применение, в связи с дороговизной используемых реагентов, сложностью и нестабильностью процедуры селективного культивирования незрелых форм лимфоцитов. Близким по содержанию к настоящему изобретению можно отнести патент EP 2000/907644 «PHARMACEUTIC, DIETETIC AND COSMETIC COMPOSITIONS BASED ON THIOCTIC ACID AND CYSTEINE», который описывает оптимизацию среды для культивирования клеток амниотической жидкости - «Amniomed» (EuroClone, Италия) при помощи введения композиции аминокислот с антиоксидантными свойствами (тиооктиевой и цистеина). Авторы показали от 30 до 50% увеличение количества колоний пролиферирующих клеток и высокую скорость пролиферации амниоцитов. В то же время, базовая рецептура тестированных сред остается закрытой для компонентного анализа состава.

Российские аналоги сред для культивирования клеток амниотической жидкости на отечественном рынке биофармпрепаратов до сих пор представлены не были, что определяет необходимость закупок соответствующих продуктов от западных производителей и их высокую стоимость.

Целью изобретения является разработка метода культивирования клеток амниотической жидкости в среде отечественного производства «Амниокар» и определения ростовых свойств этой среды в отношении клеток мезенхимального происхождения на примере вторичной культуры фибробластов человека.

Технический результат: способ культивирования клеток амниотической жидкости в среде «Амниокар» позволяет осуществлять методы пренатальной диагностики генетических заболеваний с использованием клеток амниотической жидкости и проводить эффективное культивирование фибробластов человека in vitro.

Осуществление изобретения

Заявленный технический результат достигается за счет того, что инкубирование клеток амниотической жидкости производят в специализированной среде «Амниокар», обеспечивающей эффективное прикрепление и пролиферацию клеточного материала в составе монослоя. Способ культивирования клеток амниотической жидкости и фибробластов человека в специализированной среде, обеспечивающей эффективное прикрепление и пролиферацию клеточного материала в составе монослоя, отличающийся тем, что инкубирование клеток проводят в вентилируемых культуральных флаконах в атмосфере 5% CO₂ и выдерживают в течение 7-11 суток. Кроме того, полную смену среды при необходимости проводят через 72 часа после начала инкубации. Специализированная среда «Амниокар» для культивирования клеток амниотической жидкости и других клеток мезенхимального происхождения, включающая глюкозу, органические и неорганические соли, аминокислоты, отличающаяся тем, что содержит модифицированную основу и стимуляторы клеточного роста, обеспечивающие эффективное размножение пролиферативно малоактивных клеток. Вентилируемые культуральные флаконы (CO₂-инкубаторы - термостатируемые камеры) необходимы для создания газовой атмосферы, соответствующей выдыхаемому воздуху (5%-CO₂). Данный процент углекислоты в газовой фазе обеспечивает поддержание буферной емкости и физиологических значений pH (7.0-7.5) для большинства питательных сред, содержащих бикарбонатный буфер в качестве основного регулятора кислотности.

Суть изобретения состоит в разработке метода эффективного культивирования in vitro клеток первичных амниоцитов и фибробластов человека с использованием специальной среды «Амниокар», разработанной Заявителем.

Показано, что использование среды «Амниокар» позволяет увеличить уровень пролиферативной активности клеток вторичной культуры фибробластоподобных и эпителиоподобных амниоцитов по сравнению с классической средой DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) в 4 и 3 раза соответственно. Установлено, что среда «Амниокар» позволяет обеспечить количество митозов на уровне анализируемых метафаз в диапазоне от 2.5 до 6.0% при культивировании клеток первичных амниоцитов. Данный показатель в 6 раз превышает соответствующий уровень метафаз при использовании среды DMEM с 10% ЭТС и в 2.4 раза выше соответствующего показателя для классической среды Ченга, содержащей специфические стимуляторы роста амниоцитов в культуре in vitro [7]. Продемонстрирована высокая эффективность среды «Амниокар» в процессе культивирования фибробластов кожи человека. Урожай клеток, полученный при использовании данной среды в 4-6 раз превышает количество фибробластов выращенных на классической среде DMEM с 10% ЭТС. Таким образом, среда «Амниокар» может эффективно применяться для культивирования клеток амниотической жидкости в процессе пренатальной генетической диагностики и для быстрого накопления биомассы фибробластов при культивировании in vitro.

Использование оптимизированного состава базовых компонентов в составе среды «Амниокар»

Известно, что первая эффективная среда для культивирования клеток амниотической жидкости, предложенная Ченгом [7], содержала в качестве основы хорошо зарекомендовавшую себя композицию сред DMEM и F12 в соотношении 1:1. В то же время специфика культивирования амниоцитов с учетом особых требований к поддержанию буферных и антиоксидантных свойств, равно как и обеспечение легкоусваиваемыми питательными веществами и витаминами, требует оптимизации базового состава питательной среды.

Заявителями предложен базовый состав компонентов среды «Амниокар», обеспечивающей быстрый рост культур пролиферативно малоактивных клеток (в т.ч. клеток амниотической жидкости и фибробластов).

Качественный и количественный состав компонентов основы среды «Амниокар», представлен в таблице 1.

Культивирование фибробластоподобных и эпителиоидных клеток вторичных амниоцитов в среде «Амниокар»

Клетки амниотической жидкости представляют множество гетерогенных по происхождению и культуральных свойств популяций амниоцитов [5, 6]. Поэтому проведение сравнительного анализа пролиферативной активности клеток не поддается достоверной оценке при использовании ограниченных по объему образцов амниотической жидкости. Селектированные и размноженные в результате 2 пассажей на коммерческой среде «Amniomax-C100» (Invitrogen) [4] моноклональные клетки амниотической жидкости фибробластоподобной и эпителиоподобной морфологии были использованы для осуществления объективной оценки эффективности культивирования в среде «Амниокар».

Пример 1

Испытуемые среды:

1. «Амниокар» - среда для культивирования клеток амниотической жидкости - разработка гр. биотехнологии МГНЦ РАМН (ООО НПП «ПанЭко»)

2. Контрольная среда: DMЕМ+10% ЭТС.

Условия эксперимента

50 тыс. клеток вторичных культур фибробластоподобных амниоцитов (Амн-P) и эпителиоидных амниоцитов (Амн-K) инокулировали в 5 мл испытуемых сред и инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение 7 суток в вентилируемых культуральных флаконах SPL, 25 см². Смену среды проводили через 4 суток после начала инкубации. По окончании инкубации проводили снятие выросших культур с поверхности пластика и определение количественных показателей клеточного роста (ИП, T2).

Индекс пролиферации (ИП): ИП=C2/C1,

где C1 - общее количество клеток или концентрация посевного материала (кл/мл), C2 - общий урожай клеток по окончании времени инкубации - t или его концентрация (кл/мл).

Время удвоения опытных и контрольных культур вычисляли по формуле T2=t×ln2/ln (ИП) [8],

где T2 - время удвоения (час), t - общее время инкубации культуры (час), ИП - индекс пролиферации.

Полученные данные для культур двух морфологических типов представлены в таблицах 2 и 3.

Таким образом, проведенный анализ показывает достоверное положительное влияние композиции среды «Амниокар» на пролиферацию клеток основных морфологических типов вторичных культур амниоцитов.

Культивирование клеток первичной культуры амниоцитов в среде «Амниокар» Целевую проверку эффективности культивирования клеток амниотической жидкости в среде «Амниокар» осуществляли с использованием первичного клеточного материала полученного из образцов амниотической жидкости при помощи ″flask″-метода культивирования [3].

Пример 2

Испытуемые среды:

1. «Амниокар» - среда для культивирования клеток амниотической жидкости - разработка гр. биотехнологии МГНЦ РАМН (ООО НПП «ПанЭко»).

2. Среда Ченга [5].

3. Контрольная среда: DMEM+10% ЭТС.

Условия эксперимента

Образец амниотической жидкости (17 нед. беременности) объемом 30 мл разделяли на 3 аликвоты по 10 мл в пластиковые конические пробирки и подвергали центрифугированию (200g, 10 мин). По 100 тыс. клеток первичной культуры амниоцитов, в объеме 1 мл суспензии супернатанта инокулировали в 5 мл каждой испытуемой среды и инкубировали Flask-методом при 37°C, 5% СO₂ в течение 11 суток в вентилируемых культуральных флаконах SPL, 25 см². Полную смену среды проводили через 72 часа после начала инкубации. По окончании инкубации проводили обработку культур колхицином (1 мкг/мл, в течение 1 часа) с последующим снятием клеток раствором Трипсин/ЭДТА (0,05%) с поверхности пластика. Определяли количественные показатели клеточного роста путем прямого подсчета плотности суспензий клеток в культурах при помощи камеры Горяева. Для определения показателя митотического индекса полученные суспензии клеток осаждали центрифугированием (200g, 10 мин). Затем клетки обрабатывали гипотоническим раствором, фиксировали и готовили препараты метафазных хромосом по общепринятой методике с окрашиванием по Гимза [3]. Показатель митотического индекса (МИ) определяли как отношение количества метафазных пластин, приходящееся на общее количество в 1000 ядерных элементов, выраженное в процентах:

МИ=N_МП/1000×100%

Эффективность процесса культивирования в среде «Амниокар» оценивали по показателям пролиферативной активности, митотического индекса и качества микроскопической картины пластинок метафазных хромосом.

Морфология и клеточный состав основных типов колоний амниоцитов, развивающихся в среде «Амниокар» представлены на фиг.1, где А - Колония клеток эпителиального типа (активно пролиферирующие); Б - Колония клеток эпителиального типа (медленно пролиферирующие); В - Колония клеток фибробластоподобного типа 1 (активно пролиферирующие); Г - Колония клеток фибробластоподобного типа 2 (умеренно пролиферирующие).

Данные сравнительного анализа пролиферативной активности амниоцитов в средах тестируемых вариантов представлены в Таблице 4.

Микроскопическая картина группы метафазных пластин амниоцитов, пролиферирующих в среде «Амниокар», представлены на фиг.2.

Данные сравнительного анализа митотического индекса для тестируемых вариантов сред представлены в Таблице 5.

Таким образом, среда «Амниокар» демонстрирует наилучшие характеристики среди испытанных вариантов сред и соответствует требованиям, предъявляемым к средам, обеспечивающим высокий уровень пролиферативной активности гетерогенной популяции клеток.

Культивирование клеток фибробластов кожи и легкого в среде «Амниокар»

Фибробласты представляют собой основной клеточный и образующий элемент соединительной ткани мезенхимального происхождения. Клетки фибробластов достаточно легко изолируются из кожи человека и могут быть использованы как для проведения научно-исследовательских работ, так и для осуществления целого ряда биохимических и генетических тестов в клиническо-диагностических целях [9].

Пример 3

Испытуемые среды:

1. «Амниокар» - среда для культивирования клеток амниотической жидкости - разработка гр. биотехнологии МГНЦ РАМН (ООО НПП «ПанЭко»).

2. Контрольная среда: DMEM+10% ЭТС.

По 50 тыс. клеток вторичных культур фибробластов кожи взрослого человека HSF (15 пассаж) и альвеолярных фибробластов эмбриона человека A-Fh (5 пассаж) инокулировали в 5 мл испытуемых сред и инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение 7 суток в вентилируемых культуральных флаконах SPL, 25 см². По окончании инкубации проводили снятие выросших культур с поверхности пластика и определение количественных показателей клеточного роста (ИП, Т2: см. Пример 1). Полученные данные для культур двух морфологических типов представлены в Таблицах 6 и 7. Представленные данные свидетельствуют о повышении уровня пролиферативных свойств фибробластов культур обоих типов в среде «Амниокар» в 4-5 раз по сравнению с классической средой DMEM+10% ЭТС.

Воспроизводимость результатов тестирования позволяет использовать культуры вторичных фибробластов в качестве тест-объекта для тестирования качества сред, используемых для культивирования амниоцитов. При этом, в качестве количественного критерия пролиферативных свойств среды может выступать показатель относительного индекса пролиферации (ОИП):

ОИП=N_М/N_DMEM,

где N_M - количество клеток, снятых с флакона с тестируемой средой;

N_DMEM - количество клеток, снятых с флакона с контрольной средой DMEM+10% ЭТС.

Показатель ОИП для среды «Амниокар» в серии из 10 независимых экспериментов варьировал от 4.5±0.3 для культуры клеток A-Fh до 5.1±0.4 для культуры клеток HSF. Таким образом, представленные в Примере 3 данные свидетельствуют о:

1) пригодности среды «Амниокар» для эффективной пролиферации фибробластов;

2) возможности использования культуры фибробластов в качестве тест-объекта при тестировании сред для культивирования клеток амниотической жидкости.

Источники информации

1. B.C.Баранов. Соросовский образовательный журнал, №10, 32-36, 998.

2. В.В.Честков. Медицинская генетика, т.4, №1, 20-22, 2005.

3. B.C.Баранов, Т.В.Кузнецова. Цитогенетика эмбрионального развития человека, Изд. Н-Л, СПб, 2007.

4. S.Kuligowski et al, Focus, Vol.21, №2, 35-37, 1999.

5. A-R.Prusa, M.Hengstschlager, Med. Sci. Monitor, Vol.8, №11, RA253-257, 2002.

6. C.M.Gosden, Br. Med. Bull., Vol.39, 348-354, 1983.

7. Z.H.Chang et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.79, 4795-4799, 1982.

8. M.K. Jr. Patterson, Measurement of growth and viability of cells in culture. In: W.B.Jakoby, I.H.Pastin, eds., Methods in Enzymology, New York: Academic Press Inc., Vol.58, 141-152, 1979.

9. B. Fowler et al, Pediatric Research, Vol.41, №1, 145-151, 1997.

Способ культивирования клеток амниотической жидкости и фибробластов человека в специализированной среде и специализированная среда «амниокар» для его осуществления

Таблица 2 Сравнительный анализ пролиферативных свойств фибробластоподобных амниоцитов на тестируемых средах Испытуемая среда Общий урожай клеток (тыс.) ИП/Т2 % Контроля «Амниокар» 2956 43.4/31.0 394 Контроль: DMEM+10% ЭТС 750 15.0/43.0 100

Таблица 3 Сравнительный анализ пролиферативных свойств эпителиоподобных амниоцитов на тестируемых средах Испытуемая среда Общий урожай клеток (тыс.) ИП/Т2 % Контроля «Амниокар» 1688 33.8/33.1 303 Контроль: DMEM+10% ЭТС 558 11.2/48.3 100

Таблица 4 Сравнительный анализ пролиферативных свойств первичных амниоцитов на тестируемых средах Испытуемая среда Общий урожай клеток (тыс.) % Контроля «Амниокар» 387 516 Среда Ченга 268 357 Контроль: DMEM+10% ЭТС 75 100

Таблица 5 Сравнительный анализ митотического индекса первичных амниоцитов на тестируемых средах Испытуемая среда МИ (%) «Амниокар» 5.3 Среда Ченга 2.2 Контроль: DMEM+10% ЭТС 0.88

Таблица 6 Сравнительный анализ пролиферативных свойств фибробластов кожи HSF на тестируемых средах Испытуемая среда Общий урожай клеток (тыс.) ИП/Т2 % Контроля «Амниокар» 960 19.2/39.4 485 Контроль: DMEM+10% ЭТС 198 3.96/84.6 100

Таблица 7 Сравнительный анализ пролиферативных свойств альвеолярных фибробластов эмбриона A-Fh на тестируемых средах Испытуемая среда Общий урожай клеток (тыс.) ИП/Т2 % Контроля «Амниокар» 1450 29.0/34.6 469 Контроль: DMEM+10% ЭТС 309 6.2/64.0 100

Изобретение относится к области клеточной биологии. Изобретение может быть использовано для цитогенетического анализа клеток амниотической жидкости, а также культивирования фибробластов и других клеток мезенхимального происхождения в лабораторных целях. Культивирование клеток амниотической жидкости и фибробластов человека производят в специализированной среде, имеющей модифицированную основу. Основа среды для культивирования клеток включает органические и неорганические соли, аминокислоты, витамины, нуклеозиды. Изобретение обеспечивает эффективное размножение пролиферативно малоактивных клеток in vitro. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 7 табл.

1. Основа среды для культивирования клеток амниотической жидкости и фибробластов человека, содержащая, мг/л:
Неорганические соли   NaCl 6200 КСl 400 MgSO₄ 73,00 Na₂HPO₄ 150,00 NaH₂PO₄ 54,00 NaHCO₃ 2960,0 Ca(NO₃)₂·4H₂O 50,00 CaCl₂ 100 FeSO₄·7H₂O 0,04 CuSO₄·5H₂O 0,001 ZnSO₄·7H₂O 0,20 Углеводы   Д-глюкоза 4000 Органические кислоты и   соли   Гипоксантин Na 2,00 Липоевая кислота 0,2 Пируват натрия 110 Ацетат натрия·3Н₂О 2,00 Путресцин 2НСl 0,03 Аминоспирты   2-аминоэтанол 0,80 Аминокислоты   L-Аланин 10,00 L-Аргинин НСl 137 L-Глицин 30 L-Гистидин 25,00 L-Изолейцин 88,00 L-Лейцин 88,00 L-Лизин НСl 108 L-Метионин 25,00 L-Фенилаланин 55,00 L-Серин 35,00 L-Треонин 65,00 L-Триптофан 16,00 L-Валин 69,00 L-Аспарагин 16,00 L-Аспарагиновая кислота 6,00 L-Глутаминовая к-та 7,00 L-Гидроксипролин 5,00 L-Пролин 9,00 L-Орнитин 0,40 L-Таурин 0,30 L-цистин 45,30 L-Тирозин 59,00 Пептиды   L-Аланил-глутамин 330,0 Глютатион 0,80 Витамины   Аскорбиновая кислота 3,00 D-Ca-пантотенат 3,00 Холина хлорид 5,00 i-Инозитол 20,00 Ниацинамид 4,00 Пиридоксал НСl 1,00 Пиридоксин НСl 2,50 Рибофлавин 0,30 Тиамин НСl 3,00 П-аминобензойная к-та 0,25 B₁₂ 0,30 Фолиевая к-та 3,00 Биотин 0,10 α-токоферол фосфат Na₂ 0,002 Менадион бисульфат Na₂ 0,030 Эргокальцийферол 0,020 Витамин А ацетат 0,020 Нуклеозиды   Рибонуклеозиды   Аденозин 5,00 Цитидин 5,00 Гуанозин 5,00 Тимидин 0,45 Уридин 5,00 Дезоксирибонуклеозиды   2'-Дезоксиаденозин 5,00 2'-Дезоксиаденозин·Н₂O 5,40 2'-Дезоксицитидин НСl 5,50 2'-Дезоксигуанозин 5,00 2'-Дезоксигуанозин·Н₂O 5,40 5-Метилцитозин 0,0045 2'-Дезокситимидин 5,00

2. Способ культивирования клеток амниотической жидкости и фибробластов человека в специализированной среде, имеющей основу по п.1, характеризующийся тем, что инкубирование клеток проводят в вентилируемых культуральных флаконах в атмосфере 5% CO₂ и выдерживают в течение 7-11 сут с осуществлением полной смены среды через 72 ч после начала инкубации.