СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО СИБИРЕЯЗВЕННОГО АЛЛЕРГЕНА Российский патент 2011 года по МПК C12P1/04 C12N1/20 A61K39/07 C12R1/07 

Изобретение относится к технологии производства диагностического препарата, необходимого для здравоохранения и ветеринарии при оценке напряженности противосибиреязвенного иммунитета и диагностики инфекции у лиц, привлекаемых к работам с возбудителем сибирской язвы.

Аналогами изобретения являются сухой диагностический сибиреязвенный аллерген, созданный ФГУ «48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства Обороны Российской Федерации» /1/, и жидкий препарат антраксин, разработанный Молдавским ИЭМГ /2/.

Цель изобретения: на аппаратурно-технологической линии производства сибиреязвенных вакцин /3/ разработать способ получения диагностического сибиреязвенного аллергена, не уступающего по своим основным свойствам аналогам, и в количестве, необходимом для практического использования.

Поставленная цель достигалась выделением диагностического сибиреязвенного аллергена непосредственно из концентрированной суспензии вегетативных клеток вакцинного штамма Bacillus anthracis СТИ-1, исключая стадию получения высушенных ацетоном клеток, которая предусматривала обработку концентрированной суспензии вегетативных клеток десятикратным объемом охлажденного ацетона с последующим их высушиванием при комнатной температуре в течение 26 часов /1/. Известно, что ацетон относится к токсичным, пожаро- и взрывоопасным веществам, к работе с которыми предъявляются повышенные требования /4/.

Сущность изобретения

1. Приготовление посевной культуры производственного штамма Bacillus anthracis СТИ-1 осуществляют из маточной культуры эталонного вакцинного штамма, полученного из ГИСК им. Л.А.Тарасевича. Процесс получения посевной культуры включает приготовление вегетативной культуры в жидкой питательной среде (ЖПС), получение споровой культуры на плотной питательной среде (ППС), ее смыв, разведение и розлив в ампулы.

2. Приготовление ЖПС на основе 1% соляно-кислотного гидролизата рыбной муки. ЖПС состоит из следующих компонентов: 1% соляно-кислотный гидролизат рыбной муки, кукурузный экстракт и вода очищенная. После фильтрации ЖПС содержит амминного азота от 0,39 до 0,41 г/дм³ и имеет pH от 7,8 до 8,0.

3. Приготовление вегетативной культуры штамма Bacillus anthracis СТИ-1 в реакторе БИОР-0,1. Процесс представляет собой прием и стерилизацию ЖПС в реакторе, введение добавок (растворы глюкозы, хлористого кальция и сернокислого марганца), пеногасителя и посевной культуры из расчета от 300 до 500 тысяч спор на 1 см³ среды. ЖПС после введения добавок должна отвечать следующим требованиям:

содержание общего азота, г/дм³ - от 1,2 до 1,6;

содержание амминного азота, г/дм³ - от 0,3 до 0,5;

содержание редуцирующих веществ, г/дм³ - от 3,9 до 4,1;

содержание хлоридов (в пересчете на NaCl), г/дм³ - от 1,6 до 3,0;

pH - от 7,5 до 7,9.

Выращивание вегетативных клеток в реакторе БИОР-0,1 осуществляют при температуре от 32 до 33°C и давлении в полости реактора от 0,02 до 0,03 МПа с постоянной подачей стерильного воздуха на аэрацию через кольцевой барбатер с расходом от 13,8 до 14,2 дм³/мин и перемешиванием с частотой вращения мешалки 8,3 с^-1 (500 об/мин). Процесс культивирования проводят в течение 13-14 часов.

4. Приготовление отмытой от ЖПС концентрированной суспензии вегетативных клеток осуществляют на сепараторе АСГ-3МБ с использованием двойной отмывки клеток очищенной водой при подаче в межтарелочное пространство барабана сепаратора нативной вегетативной культуры со скоростью от 30 до 40 дм³/ч.

5. Для получения белковой аллергеной фракции применяют метод щелочного гидролиза. Гидролиз осуществляют 1% раствором гидроокиси калия из расчета 100 см³ щелочи на (12±1) г концентрированной суспензии вегетативных клеток в течение 25-29 часов при температуре от 20 до 24°C с периодическим перемешиванием через 3-4 часа в течение 5 мин. Полученный гидролизат фракционируют на высокоскоростной рефрижераторной центрифуге при скорости вращения ротора 12000 об/мин и температуре от 3 до 5°C. Выделение белковой аллергеной фракции осуществляют фракционированием надосадочной жидкости 50% раствором уксусной кислоты из расчета 1 объем кислоты на 4 объема жидкости и выдерживают в течение 4-6 часов при температуре от 3 до 5°С. Осаждение белковой аллергеной фракции проводят с использованием центрифугирования. Полученную белковую аллергеную фракцию растворяют в стерильном 0,9% водном растворе хлорида натрия, диализируют в гильзах из вискозной трубки и лиофилизируют.

Исключение на данном этапе выделения аллергена стадии получения ацетонвысушенных клеток /1/ позволило сократить продолжительность технологического процесса на 26 ч, снизить его трудоемкость и повысить безопасность.

6. Для получения готовой жидкой формы диагностического сибиреязвенного аллергена лиофилизированную белковую аллергеную фракцию растворяют в боратном буферном растворе с pH от 7,2 до 7,4 из расчета 20 мкг белка в 0,1 см³ (концентрацию белка определяют по методу Лоури), раствор автоклавируют при температуре от 108 до 112°C в течение 18-22 мин. Полученный раствор для удаления посторонней микрофлоры и отделения термолабильных белков фильтруют через мембраны «Владипор» с диаметром пор 0,22 мкм. Стерильный раствор - жидкую форму диагностического сибиреязвенного аллергена - разливают по 1,0 мл в ампулы и запаивают.

7. Для получения сухой формы диагностического сибиреязвенного аллергена стерильный раствор разливают по 1,0 мл в ампулы и лиофильно высушивают на установках LZ-45.27 или АКСС. Температурный режим высушивания регулируют подводом тепла к материалу от минус 32°C до плюс 28°C. Общая продолжительность процесса сублимационного высушивания составляет от 20 до 24 часов.

8. Оценку специфической активности жидкой и сухой форм полученного препарата проводили на однократно иммунизированных сибиреязвенной вакциной СТИ-1 морских свинках по индексу интенсивности реакции (таблица 1) /5/. Препаратом сравнения являлся сухой сибиреязвенный диагностический аллерген, приготовленный из высушенных ацетоном клеток /1/.

Таблица 1 Аллергическая проба на морских свинках, вакцинированных живой вакциной СТИ-1 Условия получения аллергена Аллерген, форма Средний диаметр гиперимии, мм Количество положительных реакций, % Индекс интенсивности реакций, % Аллерген, полученный предлагаемым способом Сухая 17,1±1,7 100 41,9 Жидкая 17,0±1,7 100 42,7 Аллерген, выделенный из биомассы, высушенной ацетоном Сухая 17,0±1,7 100 41,8

В результате проведенных исследований было установлено, что полученный по предлагаемому нами способу препарат в диагностической дозе 20 мкг белка в 0,1 см³ позволяет проводить оценку противосибиреязвенного иммунитета у вакцинированных животных. При этом положительные реакции наблюдались во всех опытах. По индексу интенсивности реакции и проценту положительных проб все препараты не отличались между собой.

9. С помощью препарата, полученного предлагаемым способом, была оценена возможность диагностики сибиреязвенной инфекции (таблица 2).

Для этого морских свинок подкожно инфицировали спорами штамма 71/12 второй вакцины Ценковского в дозах 100 и 1000 спор.

Таблица 2 Диагностика сибиреязвенной инфекции Инфицирующая доза, спор Условия получения аллергена Аллерген, форма Средний диаметр гиперемии, мм Положительная реакция, % Индекс интенсивности реакции, % 100 Аллерген, полученный предлагаемым способом Жидкая 9,6±0,8 75,0 23,5 Сухая 9,5±0,8 62,5 21,9 Аллерген, выделенный из биомассы, высушенной ацетоном Сухая 9,4±0,8 62,5 21,5 1000 Аллерген, полученный предлагаемым способом Жидкая 7,1±0,7 62,5 18,8 Сухая 7,2±0,7 62,5 18,8 Аллерген, выделенный из биомассы, высушенной ацетоном Сухая 7,2±0,7 62,5 18,8

На пятые сутки после инфицирования у лабораторных животных в 62,5-75,0% случаев была выявлена положительная кожно-аллергическая реакция с индексом интенсивности от 18,8 до 23,4% как для препарата, полученного предлагаемым способом, так и для аллергена, выделенного из биомассы, высушенной ацетоном.

10. В результате проведенных опытов с использованием близкородственных микроорганизмов (Bacillus cereus 720, Bacillus megaterium 3 и 5, Bacillus subtilis 7 и 447) доказана высокая специфичность сибиреязвенного аллергена, полученного предлагаемым способом. Во всех случаях постановки кожно-аллергической пробы положительные реакции не наблюдались (таблица 3).

Таблица 3 Специфичность сибиреязвенного сухого и жидкого аллергена Наименование штамма Аллерген, полученный предлагаемым способом, форма Средний диаметр гиперемии, мм Положительная реакция, % Индекс интенсивности реакции, % Bacillus cereus 720 Жидкая 0 0 0 Сухая 0 0 0 Bacillus megaterium 3 Жидкая 0 0 0 Сухая 0 0 0 Bacillus megaterium 5 Жидкая 0 0 0 Сухая 0 0 0 Bacillus subtilis 7 Жидкая 0 0 0 Сухая 0 0 0 Bacillus sublilis 447 Жидкая 0 0 0 Сухая 0 0 0 Контроль Bacillus anthracis СТИ-1 Жидкая 17,1 100 41,9 Сухая 17,0 100 42,7 Интактные животные Жидкая 0 0 0 Сухая 0 0 0

11. При изучении сохраняемости жидкой и сухой форм сибиреязвенного аллергена, полученного предлагаемым способом, была доказана стабильность основных свойств препарата в течение трех лет при температуре хранения от 2 до 10°С и одного месяца до его использования при температуре от 25 до 30°С. Активность аллергена находилась на уровне свежеприготовленного (таблица 4).

Таблица 4 Сохраняемость основных свойств сибиреязвенного аллергена Срок хранения, год Аллерген, полученный предлагаемым способом, форма Физико-химические свойства Специфическая активность pH остаточная влажность, % концентрация белка, мкг/см³ средний диаметр гиперемии, мм положительная реакция, % Исходный Жидкая 7,2±0,1 - 205,6±2,3 15,6±1,6 100 Сухая 7,3±0,1 3,4±0,5 204,6±2,2 15,7±1,6 100 1 Жидкая 7,2±0,1 - 205,8±2,5 15,0±1,5 100 Сухая 7,3±0,1 3,4±0,5 203,8±2,1 16,2±1,7 100 2 Жидкая 7,2±0,1 - 204,4±2,1 14,2±1,5 100 Сухая 7,2±0,1 3,4±0,5 203,7±2,2 15,9±1,6 100 3 Жидкая 7,2±0,1 - 204,5±2,1 14,7±1,5 100 Сухая 7,1±0,1 3,4±0,5 203,5±2,0 16,5±1,6 100

12. При получении сибиреязвенного аллергена разработанным способом использовались существующие мощности производства сибиреязвенных вакцин, что позволило существенно сократить материально-финансовые затраты на его производство.

По результатам выполненных экспериментальных работ была составлена нормативная документация на производство и контроль качества сибиреязвенного аллергена, в соответствии с которой на аппаратурно-технологической линии производства сибиреязвенных вакцин были наработаны серии препарата. При этом установлено, что за один производственный цикл продолжительностью 14-16 суток можно получить не менее 70 тысяч диагностических доз аллергена.

Предлагаемый способ получения диагностического сибиреязвенного аллергена позволяет осуществлять его производство в необходимом количестве, тем самым эффективно решать проблему оценки напряженности иммунитета и диагностики сибиреязвенной инфекции у лиц, привлекаемых к работам с возбудителем сибирской язвы. Внедрение препарата в практику предотвратит возможные заболевания среди вакцинированного персонала, не имеющего достаточно напряженного противосибиреязвенного иммунитета.

Диагностический сибиреязвенный аллерген в жидкой и сухой формах, полученный из вегетативных клеток вакцинного штамма Bacillus anthracis СТИ-1 без их предварительного высушивания ацетоном, по основным показателям качества не уступает ранее запатентованному препарату /1/.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Васильев Н.Т., Логинов М.С., Васильев П.Г., Фролов В.И., Саяпина Л.В., Забокрицкий А.Н., Садовой Н.В., Садовая Е.А., Столяров В.М., Ильиных А.В., Фофанов П.Е. Патент на изобретение «Сухой диагностический сибиреязвенный аллерген», №2314348 от 10.01.2008 г.

2. Шляхов Э.Н., Шварц С.А. Авторское свидетельство СССР №219753, кл. А 39-35, 1968 г.

3. Промышленный регламент №08461522-04-07. Вакцина сибиреязвенная живая лиофилизат для приготовления суспензии для подкожного введения и накожного скарификационого нанесения. Регистрационный номер ГИСК им. Л.А.Таресевича ПР №1898-07.

4. Вредные вещества в промышленности. Органические вещества. Справочник для химиков, инженеров и врачей. Издательство «Химия», Ленинградское отделение, 1971.

5. Шляхов Э.Н. Сибиреязвенный аллерген антраксин (принципы конструирования, методы получения, экспериментальное изучение, применение в эпидемиологической практике). Автореферат дисс. докт. М., 1965.

Способ по изобретению предусматривает выделение диагностического сибиреязвенного аллергена непосредственно из концентрированной суспензии вегетативных клеток вакцинного штамма Вас.anthracis СТИ-1. Штамм выращивают на питательной среде на основе соляно-кислотного гидролизата рыбной муки методом глубинного культивирования. Полученную бактериальную массу отмывают на сепараторе, получают концентрированную суспензию вегетативных клеток. Аллергенную белковую фракцию извлекают щелочным гидролизом и фракционируют полученный гидролизат. Из надосадочной жидкости выделенной фракции выделяют белковую аллергенную фракцию путем фракционирования раствором уксусной кислоты, далее полученный осадок, содержащий целевой продукт, растворяют, диализируют и получают очищенный сибиреязвенный белковый аллерген. Препарат получают в жидкой и лиофилизированной формах. Способ по изобретению позволяет повысить безопасность производства препарата и сократить продолжительность технологического процесса, сохраняя при этом основные свойства препарата: активность при длительном хранении, эффективность при оценке напряженности противосибиреязвенного иммунитета и при диагностике инфекции. 3 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ получения диагностического сибиреязвенного аллергена в жидкой и сухой формах, предусматривающий приготовление посевной культуры производственного штамма Bacillus anthracis СТИ-1, приготовление жидкой питательной среды на основе солянокислотного гидролизата рыбной муки, получение бактериальной массы вегетативных клеток методом глубинного культивирования, отмывание на сепараторе и получение концентрированной суспензии вегетативных клеток, извлечение белковой аллергенной фракции методом щелочного гидролиза, фракционирование полученного гидролизата, выделение из него белковой аллергенной фракции путем фракционирования надосадочной жидкости раствором уксусной кислоты, растворение полученного осадка в стерильном 0,9% водном растворе хлорида натрия с последующим диализом жидкой субстанции аллергена в гильзах из вискозной трубки и ее лиофилизацией, при этом для получения жидкой формы диагностического сибиреязвенного аллергена лиофилизированную белковую аллергенную фракцию растворяют в боратном буферном растворе, автоклавируют, фильтруют через мембраны «Владипор», стерильный раствор разливают в ампулы и запаивают, а для получения сухой формы - стерильный раствор в ампулах лиофильно высушивают.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что выращивание вегетативных клеток штамма Bacillus anthracis СТИ-1 осуществляют с использованием жидкой питательной среды на основе 1% солянокислотного гидролизата рыбной муки и кукурузного экстракта, содержащей общего азота от 1,2 до 1,6 г/дм³, аминного азота от 0,3 до 0,5 г/дм³, редуцирующих веществ от 3,9 до 4,1 г/дм³, хлоридов от 1,6 до 3,0 г/дм³ и имеющей рН от 7,5 до 7,9.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что приготовление отмытой концентрированной суспензии вегетативных клеток осуществляют на сепараторе АСГ-3МБ с использованием двойной отмывки клеток очищенной водой при подаче в межтарелочное пространство барабана сепаратора нативной вегетативной культуры со скоростью от 30 до 40 дм³/ч.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что выделение белковой аллергенной фракции осуществляют непосредственно из отмытой концентрированной суспензии вегетативных клеток вакцинного штамма Bacillus anthracis СТИ-1 методом щелочного гидролиза 1%-ным раствором гидроокиси калия из расчета 100 см³ щелочи на (12±1) г клеток в течение 25-29 ч при температуре от 20 до 24°С с периодическим перемешиванием через 3-4 ч в течение 5 мин и последующим фракционированием надосадочной жидкости после добавления 50%-ного раствора уксусной кислоты из расчета 1 объема кислоты на 4 объема гидролизата.