СУХОЙ ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ СИБИРЕЯЗВЕННЫЙ АЛЛЕРГЕН Российский патент 2008 года по МПК C12P21/02 A61K38/00 G01N33/569 C12R1/07 

Изобретение относится к диагностическим иммунобиологическим препаратам, содержащим биологически активные компоненты клеток Bacillus anthracis, и может быть использовано в медицине и ветеринарии.

Аналогом изобретения являлся жидкий коммерческий препарат «антраксин», производителем которого был Молдавский ИЭМГ [1-3]. В Ставропольском НИИПЧИ выпускается в ограниченном количестве только жидкий аллерген. Этот препарат из-за недостаточно высокой чувствительности, низкой сохраняемости и специфичности широкого применения в настоящее время не имеет [4]. Всероссийским научно-исследовательским ветеринарным институтом г.Казань были предприняты попытки получения аллергена из капсульного штамма сибиреязвенного микроба, однако данный препарат из-за своей высокой реактогенности в медицинскую и ветеринарную практику не внедрен [5].

Цель изобретения - создание сухой формы препарата высокоэффективного аллергена для оценки напряженности противосибиреязвенного иммунитета и диагностики сибиреязвенной инфекции, сохраняющего более длительное время свои основные свойства и содержащего в диагностической дозе в два раза меньше белка по сравнению с аналогом.

Поставленная цель достигается выделением из микробных клеток вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 аллергенной фракции, приготовлением на ее основе сухого диагностического препарата сибиреязвенного аллергена, превосходящего по биологической активности аналогичный жидкий препарат Ставропольского НИИПЧИ и сохраняющего свои свойства не менее 3 лет.

Сущность изобретения состоит в получении сухого сибиреязвенного аллергена методом щелочного гидролиза микробных клеток вакцинного штамма СТИ-1 [6]. Бактериальную массу вегетативных клеток получают путем глубинного культивирования в аппарате БИОР-0,1 с жидкой питательной средой на основе солянокислотного гидролизата рыбной муки и кукурузного экстракта с добавлением глюкозы, солей кальция и марганца при температуре от 31°С до 33°С в течение от 8 до 12 ч и скорости вращения мешалки 500 оборотов в минуту. Клеточную массу отмывают физиологическим раствором хлорида натрия и высушивают ацетоном. Выделение аллергенной фракции осуществляют методом щелочного гидролиза, который включает в себе следующие основные стадии: извлечение из ацетонвысушенных клеток щелочерастворимых компонентов, последующее осаждение их уксусной кислотой, растворение полученного осадка в физиологическом растворе хлорида натрия, диализ (жидкая субстанция аллергена), получение сухой субстанции аллергена, приготовление сухой диагностической формы аллергена. Препарат аллергена готовят из сухой субстанции путем растворения необходимой навески в боратном буфере с рН 7,2 с последующим автоклавированием и фильтрацией раствора аллергена через мембранные фильтры для удаления балластных термолабильных белков. Сублимацию препарата осуществляют в установках LZ-45.27 или АКСС. Температурный режим высушивания регулируют подводом тепла к материалу от минус 32°С до плюс 28°С. Общая продолжительность процесса сублимационного высушивания составляет от 20 до 24 ч.

Пример 1. Полученный методом щелочного гидролиза сибиреязвенный аллерген представляет собой термостабильную белковую фракцию микробных клеток вакцинного штамма СТИ-1 (содержание белка от 58% до 74%).

Характеристики препаратов аллергена приведены в таблице 1. Приготовленные серии сибиреязвенного аллергена были безвредны для белых мышей, не содержали посторонней микрофлоры, имели рН 7,2, остаточную влажность не более 5% и содержали в одной диагностической дозе (0,1 мл) 20 мкг белка.

Пример 2. Биологическую активность сухого аллергена оценивали в сравнении с коммерческим антраксином. Для этого использовали четырехкрестовую шкалу и рассчитывали индекс интенсивности реакции, как наиболее информативный показатель кожно-аллергической пробы.

Оценку препаратов проводили на однократно вакцинированных сибиреязвенной вакциной СТИ-1 морских свинках. Для постановки аллергической пробы использовали дозы 20 и 40 мкг белка в объеме 0,1 мл, для антраксина производства Ставропольского НИИПЧИ согласно инструкции по применению - 40 мкг (таблица 2). Интенсивность реакции учитывали через 24 часа после постановки внутрикожной пробы по среднему диаметру гиперимии с инфильтратом.

Как видно из представленных в таблице 2 данных, индекс интенсивности сухого аллергена для дозы 20 мкг почти в два раза больше, чем для коммерческого препарата (40 мкг).

Результаты сравнительных экспериментальных испытаний препаратов приведены в таблице 3. В опытах использовались морские свинки, зараженные культурой штамма 71/12 второй вакцины Ценковского. Отмечено, что предлагаемый аллерген производства ЦВТП БЗ более эффективен, чем коммерческий: так, при постановке кожно-аллергической пробы в дозе 20 мкг индекс интенсивности выше, чем у Ставропольского антраксина при дозе 40 мкг.

Испытания хранившегося аллергена проводили по методике, описанной выше. Условия хранения аллергена были следующими: 1, 2 и 3 года при температуре от 2°С до 10°С и один месяц перед испытаниями при температуре от 25°С до 30°С. Из представленных в таблице 4 данных следует, что активность сухого аллергена после 3 лет хранения (срок наблюдения) находится на уровне свежеприготовленного, что создает удобства для его хранения, транспортировки вне зависимости от времени года.

МАТЕРИАЛЫ, ПОЯСНЯЮЩИЕ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таблица 1 - Характеристика препаратов аллергена, полученных на основеглубинных культур СТИ-1Серии препаратаЖидкая субстанция аллергенаСухая субстанция аллергенаСухая диагностическая форма аллергенарНБелок,
мг/млНуклеиновые кислоты, мг/млВыход с 1 л культуральной жидкости, %Выход по белку, %Белок в дозе, мкгрНОстаточная влажность, %17,22,740,00811,28,5207,24,927,22,460,00616,411,0207,24,337,32,600,00913,712,0207,24,3

Таблица 2 - Аллергическая проба на морских свинках, вакцинированных живой вакциной СТИ-1АллергенДоза, мкг белкаСредний диаметр гиперемии, ммПоложительных реакций, %Индекс интенсивности, %Сибиреязвенный аллерген производства ЦВТП БЗ2017,010043,84016,810043,8Контроль40000Сибиреязвенный аллерген производства Ставропольского НИИПЧИ4014,010025,0Контроль40000Примечание: контроль - интактные животные

Таблица 3 - Аллергическая проба на морских свинках, инфицированных второй вакциной ЦенковскогоАллергенДоза, мкг белкаСредний диаметр гиперемии, ммКоличество положительных реакций, %Индекс интенсивности, %Сибиреязвенный аллерген производства ЦВТП БЗ4020,110051,92019,010047,9Контроль40000Сибиреязвенный аллерген производства Ставропольского НИИПЧИ4011,18128,9Контроль40000Примечание: контроль - интактные животные

Таблица 4 - Физико-химические и биологические свойства аллергена на различные сроки храненияСрок хранения, месрНОстаточная влажность, %Концентрация белка в дозе, мкгСредний диаметр гиперемии, ммКоличество положительных реакций, %Индекс интенсивности реакции, %Исходный7,24,620,017,010043,8материал      67,154,720,116,210040,6127,24,620,116,210040,6187,24,320,016,210040,6247,24,320,015,510037,5367,24,420,116,010040,0

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ

1. Шляхов Э.Н. Сибиреязвенный аллерген антраксин (принципы конструирования, методы получения, экспериментальное изучение, применение в эпидемиологической практике). Автореферат дисс.докт. М., 1965.

2. Шляхов Э.Н., Шварц С.А. Авторское свидетельство СССР №219753, кл. А 39-35, 1968.

3. Шляхов Э.Н., Шварц С.А., Груз Е.В. Иммуноаллергическая диагностика сибирской язвы человека с помощью антраксина // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1970. - №6, - с.79-83.

4. Фармакопейная статья. Аллерген сибиреязвенный жидкий для внутрикожной пробы. ФС 42-3878-99.

5. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В., Харечко А.Т., Васильев П.Г., Садовой Н.В., Кожухов В.В. Сибирская язва: Актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. - М., ВУНМЦ МЗ РФ, 1999.

6. Рунова В.Ф., Гаврилова В.Ю. Получение бактериальных аллергенов методом щелочного экстрагирования и изучение их физико-химических свойств.// Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1970. - №10, - с.72-77.

Изобретение относится к диагностическим иммунобиологическим препаратам, содержащим биологически активные компоненты клеток Bacillus anthracis. Способ предусматривает осуществление глубинного культивирования штамма В.anthracis штамма СТИ-1 в аппарате БИОР-1,0 в жидкой питательной средой на основе солянокислотного гидролизата рыбной муки в течение от 8 до 12 ч с последующей отмывкой, центрифугированием и девитализацией клеток. Далее из полученной бактериальной массы извлекают щелочно-растворимые компоненты. Сухой аллерген после добавления в субстанцию боратного буфера готовят в сублимационной установке LZ-45. Температурный режим высушивания регулируют подводом тепла к материалу от минус 32°С до плюс 28°С. Общая продолжительность процесса лиофилизации составляет от 20 до 24 ч. Полученный сухой аллерген содержит в дозе 20 мкг белка. Сухой сибиреязвенный аллерген в два раза превосходит по биологической активности коммерческий аналог, не изменяет свою активность при длительном хранении и эффективен при оценке напряженности противосибиреязвенного иммунитета и диагностике сибиреязвенной инфекции. 4 табл.

Сухой диагностический сибиреязвенный аллерген, характеризующийся тем, что он представляет собой термостабильную белковую фракцию вегетативных клеток вакцинного штамма Bacillus anthracis СТИ-1 с содержанием белка от 58 до 74%, содержит в диагностической дозе 20 мкг белка, получен методом щелочного гидролиза высушенной ацетоном биомассы вегетативных клеток указанного штамма, выращенных глубинным способом, и высушен сублимационным методом.