СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ Российский патент 2002 года по МПК A61K39/40 A61K39/07 G01N33/53 G01N33/531 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается получения сывороток, позволяющих дифференцировать Bacillus anthracis от близкородственных микроорганизмов.

Известная антигенная схожесть B.anthracis с близкородственными микроорганизмами, такими как B.cereus, B.megaterium, В.thuringiensis, B.mycoides B. subtilis, затрудняет получение видоспецифических препаратов для диагностики сибирской язвы.

В настоящее время пригодные для идентификации диагностические препараты получают в большинстве случаев путем многократной адсорбции сибиреязвенных сывороток близкородственными микроорганизмами (авторское свидетельство (19) SU (II) 1637325 A1. Р.Н. Низамов, Д.Ш. Ахмеров, Р.Х. Шиганова и И.Н. Садыков. Способ получения флуоресцирующих антител для диагностики сибирской язвы; Афанасьев Е.Н. Научно-методические аспекты экспресс-диагностики возбудителей особо опасных зоонозных инфекций. Докторская диссертация, Ставрополь, 2000), что усложняет и удорожает разработку диагностических препаратов.

Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является "Identification of Bacillus anthracis by polyclonal antibodies against extracted vegetative cell antigens" A.P. Phillips, I.W. Ezzel; I. of Applied Bacteriology, 1989, 66, 419-432. Для получения сывороток эти авторы использовали легко экстрагируемые из клеток B. anthracis белковые антигены. Однако сыворотки против этих антигенов не позволяли в полной мере дифференцировать штаммы возбудителей сибирской язвы от близкородственных микроорганизмов даже с использованием моноклональных антител.

Недостатком метода выделения этих антигенов является использование детергентов, прогревания препарата, что усложняет и удорожает получение антигена и не гарантирует нативности выделенных антигенов.

Целью изобретения является получение сыворотки с использованием нативного сибиреязвенного антигена, позволяющей дифференцировать возбудителя сибирской язвы от близкородственных микроорганизмов.

Поставленная цель достигается тем, что антиген выделяют гельхроматографией на сверхтонком сефакриле S-300 (Upsala, Sweden) культурального фильтрата B. anthracis СТИ-I, который выращивают в синтетической питательной среде при 37^oС, с шуттелированием. Клетки B. anthracis отделяют фильтрованием, компоненты стерильного культурального фильтрата концентрируют на ультрафильтрах НLР-10 и PM-10 (фирма Amicon, Sweden) в 150 раз, до содержания белка 8-10 мг/мл.

Для получения сывороток кроликов иммунизируют антигеном с м.м. более 150 кДа (1 пик), который элюируется в свободном объеме с регистрацией при λ=280 нм. Животным внутрикожно вдоль позвоночника и внутримышечно в паховые области вводят возрастающие дозы антигена от 250 мкг до 750 мкг с гидроокисью алюминия.

Активность сывороток оценивают в реакции иммунодиффузии в геле с культуральным фильтратом (разведение 1: 4). Животных обескровливают при титре сыворотки 1:8-1:16.

Специфичность сывороток проверяют в реакции иммунодиффузии в геле с выросшими в течение 18 часов на питательном агаре возбудителями сибирской язвы и близкородственными микроорганизмами.

О принадлежности микроорганизма к возбудителю сибирской язвы судят по зоне преципитата, образовавшейся между выросшей культурой и лункой с сывороткой.

Примеры конкретного выполнения, подтверждающие осуществление предлагаемого способа.

Пример 1. Получение бесклеточного культурального фильтрата.

B.anthracis СТИ-I выращивали в 500 мл колбах с 200 мл жидкой питательной среды в течение 21 часа, с шуттелированием 72 об/мин. Стерилизовали культуральную среду после выращивания в ней B. anthracis фильтрованием через фильтр ДР-045 (фирма "Amicon"). Проверяли на стерильность посевом в жидкие и на плотные питательные среды, затем концентрировали на установке ДС-2 с волоконным фильтратом HLP-10 и РМ-10 в 150 раз. Содержание белка в концентрированном культуральном фильтрате обычно составляло 6-10 мг/мл белка.

Пример 2. Выделение гельхроматографией антигенных компонентов B. anthracis СТИ.

Фракционирование компонентов культурального фильтрата В.anthraсis СТИ осуществляли в колонке 2х70 см со сверхтонким сефакрилом S-300, который уравновешивали 0,3 М раствором NаСl с 0,025 М трис-НСl буфером рН 8,4, при скорости элюции 25 мл/ч. Выход фракций регистрировали при 280 нм с помощью спектрофотометра "Uvicord SII (ЛКБ, Sweden). Выход фракций регистрировали в виде четырех отдельных пиков (фиг.1). Фракции концентрировали на РМ-10 до исходного объема использованного культурального фильтрата.

Пример 3. Получение сывороток к антигенам отдельных фракций.

Кроликов породы "Шиншилла" весом 2,5-3 кг иммунизировали возрастающими дозами фракций - от 250 до 750 мкг белка на животное, которые вводили с гидроокистью алюминия (Alu Gel фирма "Serwa") через 2 недели, внутрикожно вдоль позвоночника и внутримышечно в обе паховые области.

Активность сывороток проверяли в реакции иммунодиффузии в геле с культуральным фильтратом. Животных обескровливали при титре сывороток 1:8-1:16.

Пример 4. Определение специфичности сывороток, полученных к отдельным антигенам В. anthracis СТИ.

Штаммы В. anthracis и близкородственных микроорганизмов засевали в виде газонов на питательный агар. После 18-часовой инкубации при 37^oС против газонов выросших культур в агаре пробивали лунки (диаметром 6 мм), в которые вносили исследуемые сыворотки, чашки оставляли при комнатной температуре. Через 18-24 часа между выросшими культурами и лунками с сывороткой образовывались зоны преципитатов.

После образования преципитатов культуры обеззараживали парами формалина, смывали, чашки фотографировали (фиг. 2).

На фиг. 2 (а, б, в) в центре - сыворотки соответственно к фракциям 1, 2 и коммерческий сибиреязвенный глобулин (С7 К946, Тбилисский НИИ вакцин, и сывороток).

Штаммы: 1 - B. anthracis CTU (tox⁺, cap^-)
2 - B. anthracis 81/1 (tox⁺, cap^-)
3 - B. anthracis 81/1 (tox^-, cap^-)
4 - B. anthracis 81/1 (tox⁺, cap⁺)
5 - B. anthracis 619/42 (tох⁺, сар⁺)
6 - B. anthracis 591/2 (tox⁺, cap⁺)
7 - B. anthracis Davies (tox^-, cap⁺)
8 - B. cereus NP 569
9 - B. cereus АТСС 6464
10 - B. megaterium 216
11 - B. thuringiensis V. thuringiensis "Pasteur"
12 - B. thuringiensis V. tburingiensis "Galleria"
13 - B. subtilis 407
14 - B. subtilis BD 430
Из фиг. 2 видно, что сыворотка к антигену фракции 1 культурального сибиреязвенного фильтрата образует зону преципитата только с антигенами В. anthracis как содержащими плазмиды вирулентности (px01, px02), так и с антигенами бесплазмидных сибиреязвенных штаммов.

В отличие от сыворотки к фракции 1 сыворотки к фракции 2 (а также к фракциям 3 и 4 - данные не приведены) и коммерческий сибиреязвенный глобулин образуют зоны преципитатов как с антигенами сибиреязвенных штаммов, так и с антигенами близкородственных микроорганизмов.

Таким образом, сыворотка к высокомолекулярному антигенному комплексу B. anthracis в отличие от сывороток к другим внеклеточным антигенам B. anthracis и коммерческого сибиреязвенного глобулина является высокоспецифичной и может быть использована для идентификации штаммов B. anthracis как содержащих плазмиды вирулентности, так и бесплазмидных штаммов.

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается получения сибиреязвенных сывороток, позволяющих дифференцировать Bacillus anthracis от близкородственных микроорганизмов. Бесклеточный культуральный фильтрат B. anthracis СТИ концентрируют на ультрафильтрах HLP-10 и РМ-10 в 150 раз, до содержания белка в фильтрате 8-10 мг/мл, затем выделение антигенных компонентов осуществляют гельхроматографией на сверхтонком сефакриле S-300, уравновешенном 0,3 М раствором NaCl с 0,025 М трис-HCL буфером рН 8,4, с регистрацией выхода фракций при λ = 280 нм, для получения высокоспецифичной сыворотки используют антиген с м.м. более 150 кДа, что соответствует первому пику выхода фракций. Полученная по способу сыворотка к антигену реагирует в реакции иммунодиффузии в геле только с антигенами различных вариантов возбудителя сибирской язвы, что позволяет идентифицировать возбудитель сибирской язвы от близкородственных по антигенным свойствам бацилл. 2 ил.

Способ получения сыворотки для идентификации возбудителя сибирской язвы, отличающийся тем, что животных иммунизируют возрастающими дозами антигена с м. м. более 150 кДа, содержащегося в первом пике, полученном путем гельхроматографии на сверхтонком сефакриле S-300, уравновешенном 0,3 М раствором NaCl с 0,025 М трис-HCL буфером рН 8,4, с регистрацией выхода фракций при λ= 280 нм при разделении бесклеточного культурального фильтрата B.anthracis СТИ, сконцентрированного на ультрафильтрах HLP 10 и РМ 10 до содержания белка 8-10 мг/мл.