СТЕРЕОИЗОМЕРНО ОБОГАЩЕННЫЕ 3-АМИНОКАРБОНИЛЬНЫЕ БИЦИКЛОГЕПТЕНОВЫЕ ПИРИМИДИНДИАМИНЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2011 года по МПК C07D239/48 C07D403/12 C07D413/12 A61K31/506 A61P35/04 

1. Перекрестная ссылка на родственные заявки

Поданной заявке испрашивается приоритет согласно § 119(e) 35-го свода законов США на основании заявки № 60/628199, опубликованной 15 ноября 2004 г., содержание которой включено в описание во всей полноте посредством цитирования.

2. Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к стереоизомерно обогащенным композициям соединений ряда 4N-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-N2-(замещенный фенил)-2,4-пиримидиндиамина, которые проявляют антипролиферативную активность, пролекарствам соединений, интермедиатам и способам синтеза для получения соединений и/или пролекарств, фармацевтическим композициям, содержащим соединения и/или пролекарства, и применению соединений и/или пролекарств в разнообразных контекстах, включая, например, лечение пролиферативных расстройств, таких как опухоли и раки.

3. Уровень техники

Рак представляет собой группу различных заболеваний, характеризуемых неконтролируемым ростом и распространением атипичных клеток. Как правило, все типы раков включают некоторые отклонения от нормы в контроле клеточного роста и деления. Пути, регулирующие клеточное деление и/или клеточное сообщение, видоизменяются в раковых клетках, так что эффекты этих регуляторных механизмов в контролировании и ограничении клеточного роста нарушаются или нивелируются. Через успешное протекание мутации и естественного отбора группа атипичных клеток, как правило, возникающая из отдельной мутантной клетки, накапливает добавочные мутации, которые предоставляют преимущество преимущественного роста по отношению к другим клеткам, и таким образом эволюционируют в клеточный тип, который преобладает в клеточной массе. Этот способ мутации и естественного отбора усиливается генетической неустойчивостью, проявляемой многими типами раковых клеток, неустойчивостью, которая вырастает или из соматических мутаций, или наследования от зародышевой линии. Усиленная способность к мутациям раковых клеток увеличивает вероятность их продвижения в направлении к образованию клеточных злокачественных новообразований. По мере того как раковые клетки далее развиваются, некоторые становятся локально инвазивными и затем метастазируют для колонизации тканей, иных, чем исходная ткань раковой клетки. Это свойство в соответствии с гетерогенностью популяции опухолевой клетки делает рак заболеванием, особенно трудным для лечения и искоренения.

Обычные лечения рака лишают раковые клетки преимущества более высокой пролиферативной способности и их увеличенной чувствительности к повреждению ДНК. Ионизирующая радиация, включая γ-лучи и X-лучи, и цитотоксические агенты, такие как блеомицин, цисплатин, винбластин, циклофосфамид, 5'-фторурацил и метотрексат, основаны на генерализованном повреждении ДНК и дестабилизации хромосомальной структуры, что в конечном счете ведет к разрушению раковых клеток. Эти лечения являются особенно эффективными для тех типов раков, которые имеют дефекты в контрольной точке клеточного цикла, которая ограничивает способность этих клеток восстанавливать поврежденные ДНК до осуществления клеточного деления. Неселективная природа этих лечений, однако, часто приводит к тяжелым и ослабляющим побочным эффектам. Системное применение этих лекарств может приводить к повреждению обычно здоровых органов и тканей и подрывает долговременное здоровье пациента.

Хотя развиваются более селективные химиотерапевтические методы лечения, основанные на знании того, как раковые клетки развиваются, например антиэстрогенное соединение тамоксифен, эффективность всех химиотерапевтических лечений является основой для развития устойчивости к лекарствам. В частности, увеличенная экспрессия клеточных мембраносвязанных переносчиков, таких как MdrI, продуцирует фенотип мультилекарственной устойчивости, характеризуемый увеличенным оттоком лекарств из клетки. Эти типы адаптации раковых клеток сильно ограничивают эффективность определенных классов химиотерапевтических агентов. Поэтому идентификация других химиотерапевтических агентов, особенно активных стереоизомеров и/или стереоизомерных смесей, является критичной для создания терапий, эффективных для атаки гетерогенной природы пролиферативного заболевания и для преодоления любой устойчивости, которая может развиваться в течение курса терапии другими соединениями. Кроме того, применение комбинаций химиотерапевтических агентов, включая различные стереоизомеры и/или стереоизомерные смеси отдельного химиотерапевтического агента, которые могут иметь различные свойства и клеточные мишени, увеличивает эффективность химиотерапии и ограничивает возникновение лекарственной устойчивости.

4. Сущность изобретения

В одном аспекте представлены соединения ряда 4N-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-2N-(замещенный фенил)-2,4-пиримидиндиамина, обогащенные определенными диастереомерами, которые проявляют антипролиферативную активность против разнообразных типов опухолевых клеток. В некоторых вариантах осуществления представлены соединения структурной формулы (I):

включая их пролекарства, соли, гидраты, сольваты и N-оксиды, которые обогащены соответствующим диастереомером структурной формулы (Ia), охарактеризованным как (1R,2R,3S,4S)-диастереомер:

где

каждый R¹ является независимо выбранным из группы, состоящей из атома водорода, низшего алкила, -(CH₂)_n-OH, -OR^a, -O(CH₂)_n-R^a, -O(CH₂)_n-R^b, -C(O)OR^a, атома галогена, -CF₃ и -OCF₃;

каждый R² является независимо выбранным из группы, состоящей из атома водорода, низшего алкила, -OR^a, -O(CH₂)_n-R^a, -O(CH₂)_n-R^b, -NHC(O)R^a, атома галогена, -CF₃, -OCF₃, и

каждый R³ является независимо выбранным из группы, состоящей из атома водорода, низшего алкила, -(CH₂)_n-OH, -OR^a, -O(CH₂)_n-R^a, -O(CH₂)_n-R^b, атома галогена, -CF₃, -OCF₃,

каждый R⁴ является независимо выбранным из группы, состоящей из атома водорода, низшего алкила, арилалкила, -OR^a, -NR^cR^c, -C(O)R^a, -C(O)OR^a и -C(O)NR^cR^c;

R⁵ представляет собой атом водорода, атом галогена, атом фтора, -CN, -NO₂, -C(O)OR^a или -CF₃;

n, каждое независимо, представляет собой целое число от 1 до 3;

каждый R^a является независимо выбранным из группы, состоящей из атома водорода, низшего алкила и низшего циклоалкила;

каждый R^b является независимо выбранным из группы, состоящей из -OR^a, -CF₃, -OCF₃, -NR^cR^c, -C(O)R^a, -C(O)OR^a, -C(O)NR^cR^c и -C(O)NR^aR^d;

каждый R^c является независимо выбранным из группы, состоящей из атома водорода и низшего алкила, или, альтернативно, два R^c заместителя вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют 4-9-членный насыщенный цикл, который необязательно включает 1-2 дополнительные гетероатомные группы, выбранные из O, NR^a, NR^a-C(O)R^a, NR^a-C(O)OR^a и NR^a-C(O)NR^a; и

R^d, каждый независимо, представляет собой низший моногидроксиалкил или низший дигидроксиалкил.

В некоторых вариантах осуществления соединение структурной формулы (I) представляет собой рацемическую смесь (2-экзо-3-экзо) цис-изомеров структурной формулы (IIa):

включая их пролекарства, соли, гидраты, сольваты и N-оксиды, где R¹, R², R³ и R⁵ определены ранее для структурной формулы (I).

В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой стереоизомерно обогащенный диастереомер структурной формулы (Ia), supra, включая его пролекарства, соли, гидраты, сольваты и N-оксиды, которые в основном свободны от его энантиомера и любого другого его диастереомера.

В следующем аспекте представлены пролекарства стереоизомерно обогащенных соединений. Такие пролекарства могут быть активны в форме их пролекарства или могут быть неактивны до тех пор, пока они не конвертированы в физиологических или других условиях применения в активную лекарственную форму. В пролекарствах одна или более функциональных групп стереоизомерно обогащенных соединений включена в скрытую функциональность, которая удаляется из молекулы в условиях применения, обычно путем гидролиза, ферментного расщепления или некоторого другого механизма расщепления, что приводит к функциональным группам. Например, первичные или вторичные аминогруппы могут быть включены в амидную скрытую функциональность, которая удаляется в условиях применения с образованием первичной или вторичной аминогруппы. Так, пролекарства включают специальные типы защитных групп, обозначаемые здесь как "прогруппы", маскирующие одну или более функциональных групп соединений, которые удаляются в условиях применения, что дает активное соединение лекарства. Функциональные группы в стереоизомерно обогащенных соединениях, которые могут быть маскированы в прогруппах путем включения в скрытую функцию, включают, без ограничения, амины (первичный и вторичный), гидроксилы, сульфанилы (тиолы), карбоксилы, карбонилы и т.д. В области техники известно очень большое число прогрупп, пригодных для маскировки таких функциональных групп, которые дают скрытые функции, которые являются расщепляемыми в желательных условиях применения. Все эти прогруппы, индивидуально или в комбинации, могут быть включены в пролекарства. Специфические примеры скрытых функций, которые приводят к первичным или вторичным аминогруппам, которые могут быть включены в пролекарства, включают амиды, карбаматы, имины, мочевины, фосфенилы, фосфорилы и сульфенилы, но не ограничены ими. Специфические примеры скрытых функций, которые приводят к сульфанильным группам, которые могут быть включены в пролекарства, включают простые тиоэфиры, например S-метильные производные (монотио-, дитио-, окситио-, анилинотиоацетали), силильные простые тиоэфиры, сложные тиоэфиры, тиокарбонаты, тиокарбаматы, асимметрические дисульфиды и т.д., но не ограничены ими. Специфические примеры скрытых функций, которые приводят к гидроксильным группам, которые могут быть включены в пролекарства, включают, без ограничения, сульфонаты, сложные эфиры и карбонаты. Специфические примеры скрытых функций, которые приводят к карбоксильным группам, которые могут быть включены в пролекарства, включают, без ограничения, эфиры (включая силильные эфиры, эфиры и тиоэфиры оксамовой кислоты), амиды и гидразиды.

В следующем аспекте представлены композиции, включающие одно или несколько стереоизомерно обогащенных соединений. Композиции, как правило, включают соединение(я) и/или их пролекарства, соли, гидраты, сольваты и/или N-оксиды и соответствующий носитель, наполнитель и/или разбавитель. Конкретная природа носителя, наполнителя и/или разбавителя будет зависеть от желаемого применения композиции и может варьировать от являющегося пригодным или приемлемым для применений in vitro до являющегося пригодным или приемлемым для ветеринарных применений и до являющегося пригодным или приемлемым для применения к людям.

Стереоизомерно обогащенные соединения, описанные здесь, являются мощными ингибиторами пролиферации атипичных клеток, таких как опухолевые клетки, в исследованиях in vitro. Так, в другом аспекте представлены способы ингибирования пролиферации атипичных клеток и, в частности, опухолевых клеток. Способы, как правило, включают контактирование атипичной клетки, такой как опухолевая клетка, с эффективным для ингибирования пролиферации клетки количеством одного или нескольких стереоизомерно обогащенных соединений, описанных здесь, и/или их пролекарств, солей, гидратов, сольватов и/или N-оксидов. Клетки могут быть приведены в контакт с соединением как таковым, или соединение может быть рецептурировано в композиции. Способы могут быть приобретены на практике в среде in vitro или в среде in vivo как терапевтический подход по отношению к лечению или предотвращению пролиферативных расстройств, таких как опухолеобразующие раки.

В следующем аспекте представлены способы лечения пролиферативных расстройств. Способы могут быть применены на практике на животных в ветеринарной среде или на человеке. Способы, как правило, включают назначение животному или человеку эффективного для лечения или профилактики пролиферативного расстройства количества одного или нескольких стереоизомерно обогащенных соединений, описанных здесь, и/или их пролекарств, солей, гидратов, сольватов и/или N-оксидов. Соединение(я) могут быть назначены пациенту сами по себе, или соединение(я) могут быть назначены в форме композиции. Пролиферативные расстройства, которые могут быть излечиваемы согласно способам, включают, без ограничения, опухолеобразующие раки.

Стереоизомерно обогащенные соединения, описанные здесь, представляют собой мощные ингибиторы aurora-киназ. Aurora-киназы представляют собой семейство ферментов, известных как ключевые регуляторы клеточного деления. Повышенные уровни aurora-киназ были найдены в некоторых типах раковых клеток человека, таких как рак груди, колоректальный, почечный рак, рак шейки матки, нейробластомный рак, меланома, лимфома, рак поджелудочной железы, рак простаты и другие солидные опухоли (см., например, Bischott et al., 1998, EMBO J. 17: 3052-3065; Geopfert & Brinkley, 2000, Curr. Top. Dev. Biol. 49: 331-342; Sakakura et al., 2001, Br. J. Cancer 84: 824-831), и было показано, что сверхэкспрессия aurora-киназ приводит к трансформации клетки; процесс, по которому нормальные клетки становятся раковыми. Не связывая себя какой-либо теорией, предполагают, что стереоизомерно обогащенные соединения, описанные здесь, так же как их активные пролекарства, соли, гидраты, сольваты и/или N-оксиды, проявляют их антипролиферативную активность путем ингибирования одной или нескольких aurora-киназ.

Так, в другом аспекте представлены способы ингибирования активности aurora-киназы. Способы, как правило, включают контактирование aurora-киназы с эффективным для ингибирования ее активности количеством одного или нескольких стереоизомерно обогащенных соединений, описанных здесь, и/или их активных пролекарств, солей, гидратов, сольватов и/или N-оксидов. Способы могут быть использованы на практике на средах in vitro с очищенными или частично очищенными ферментами aurora-киназ (например, с экстрактами клеток, экспрессирующих aurora-киназу), в средах in vitro с интактными клетками, экспрессирующими aurora-киназу, или в средах in vivo для ингибирования процесса, опосредованного aurora-киназой (например, клеточный митоз) и/или как терапевтический подход по отношению к лечению или предотвращению заболеваний или расстройств, которые являются опосредованными, по меньшей мере частично, активностью aurora-киназы.

В следующем аспекте представлены способы лечения или профилактики заболеваний или расстройств, опосредованных aurora-киназой. Способы, как правило, включают назначение животному или человеку эффективного для лечения или профилактики заболевания или расстройства, опосредованных aurora-киназой, количества одного или нескольких стереоизомерно обогащенных описанных здесь соединений и/или их активных пролекарств, солей, гидратов, сольватов и/или N-оксидов. Заболевания и расстройства, опосредованные aurora-киназой, включают любое заболевание, расстройство или другое опасное состояние, при котором играет роль член ферментативного семейства aurora-киназ. Специфические примеры таких заболеваний или расстройств, опосредованных aurora-киназой, включают, без ограничения, меланому, лейкемию и солидноопухолевые раки, такие как, например, колоректальный, рак груди, желудка, яичников, шейки матки, меланому, рак почки, простаты, лимфому, нейробластому, рак поджелудочной железы и рак мочевого пузыря.

Другие аспекты включают, без ограничения, интермедиаты и способы, применимые для синтеза стереоизомерно обогащенных соединений и пролекарств, как будет описано более детально ниже.

5. Краткое описание чертежей

Фиг.1-4 демонстрируют ингибирующий эффект бис-хлористоводородной соли (1R,2R,3S,4S)-N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[3-метил-4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]-2,4-пиримидиндиамина (соединение 60a·2HCl) на рост различных типов опухолей в стандартном ксенотрансплантатном лечении и регрессионных моделях.

6. Подробное описание изобретения

6.1. Определения

Применяемые в описании следующие термины имеют следующие значения.

Алкил, сам по себе или как часть другого заместителя, относится к насыщенному или ненасыщенному разветвленному, линейному или циклическому одновалентному углеводородному радикалу, имеющему заданное число атомов углерода (т.е. C₁-C₆ обозначает от одного до шести атомов углерода), который образуется путем удаления одного атома водорода от одного атома углерода незамещенного алкана, алкена или алкина. Типичные алкильные группы включают, без ограничения, метил; этилы, такие как этанил, этенил, этинил; пропилы, такие как пропан-1-ил, пропан-2-ил, циклопропан-1-ил, проп-1-ен-1-ил, проп-1-ен-2-ил, проп-2-ен-1-ил, циклопроп-1-ен-1-ил; циклопроп-2-ен-1-ил, проп-1-ин-1-ил, проп-2-ин-1-ил и т.д.; бутилы, такие как бутан-1-ил, бутан-2-ил, 2-метилпропан-1-ил, 2-метилпропан-2-ил, циклобутан-1-ил, бут-1-ен-1-ил, бут-1-ен-2-ил, 2-метилпроп-1-ен-1-ил, бут-2-ен-1-ил, бут-2-ен-2-ил, бута-1,3-диен-1-ил, бута-1,3-диен-2-ил, циклобут-1-ен-1-ил, циклобут-1-ен-3-ил, циклобута-1,3-диен-1-ил, бут-1-ин-1-ил, бут-1-ин-3-ил, бут-3-ин-1-ил и т.д.; и подобные. Когда присутствуют специфические уровни насыщения, использовали номенклатуру "алкил", "алкенил" и/или "алкинил", как определено ниже. Низший алкил относится к алкильной группе, содержащей от 1 до 6 атомов углерода.

Термин "алканил", сам по себе или как часть другого заместителя, относится к насыщенному разветвленному, линейному или циклическому алкилу, полученному путем удаления одного атома водорода от одного атома углерода незамещенного алкана. Типичные алканильные группы включают, без ограничения, метанил; этанил; пропанилы, такие как пропан-1-ил, пропан-2-ил (изопропил), циклопропан-1-ил и т.д.; бутанилы, такие как бутан-1-ил, бутан-2-ил (втор-бутил), 2-метилпропан-1-ил (изобутил), 2-метилпропан-2-ил (трет-бутил), циклобутан-1-ил и т.д.; и подобные.

Термин "алкенил", сам по себе или как часть другого заместителя, относится к ненасыщенному разветвленному, линейному или циклическому алкилу, имеющему по меньшей мере одну углерод-углеродную двойную связь, полученную путем удаления одного атома водорода от одного атома углерода незамещенного алкена. Группа может быть или в цис-, или транс-конформации вокруг двойной связи(ей). Типичные алкенильные группы включают, без ограничения, этенил; пропенилы, такие как проп-1-ен-1-ил, проп-1-ен-2-ил, проп-2-ен-1-ил, проп-2-ен-2-ил, циклопроп-1-ен-1-ил; циклопроп-2-ен-1-ил; бутенилы, такие как бут-1-ен-1-ил, бут-1-ен-2-ил, 2-метилпроп-1-ен-1-ил, бут-2-ен-1-ил, бут-2-ен-2-ил, бута-1,3-диен-1-ил, бута-1,3-диен-2-ил, циклобут-1-ен-1-ил, циклобут-1-ен-3-ил, циклобута-1,3-диен-1-ил и т.д.; и подобные.

Термин "алкинил", сам по себе или как часть другого заместителя, относится к ненасыщенному разветвленному, линейному или циклическому алкилу, имеющему по меньшей мере одну углерод-углеродную тройную связь, полученную путем удаления одного атома водорода от одного атома углерода незамещенного алкина. Типичные алкинильные группы включают, без ограничения, этинил; пропинилы, такие как проп-1-ин-1-ил, проп-2-ин-1-ил и т.д.; бутинилы, такие как бут-1-ин-1-ил, бут-1-ин-3-ил, бут-3-ин-1-ил и т.д.; и подобные.

Термин "алкилдиил", сам по себе или как часть другого заместителя, относится к насыщенной или ненасыщенной, разветвленной, линейной или циклической двухвалентной углеводородной группе, имеющей заданное число атомов углерода (т.е. C₁-C₆ обозначает от одного до шести атомов углерода), полученной путем удаления одного атома водорода от каждого из двух различных атомов углерода незамещенного алкана, алкена или алкина или путем удаления двух атомов водорода от одного атома углерода незамещенного алкана, алкена или алкина. Два одновалентных радикальных центра или каждая валентность двухвалентного радикального центра могут образовывать связи с теми же или с различными атомами. Типичные алкилдиильные группы включают, без ограничения, метандиил; этилдиилы, такие как этан-1,1-диил, этан-1,2-диил, этен-1,1-диил, этен-1,2-диил; пропилдиилы, такие как пропан-1,1-диил, пропан-1,2-диил, пропан-2,2-диил, пропан-1,3-диил, циклопропан-1,1-диил, циклопропан-1,2-диил, проп-1-ен-1,1-диил, проп-1-ен-1,2-диил, проп-2-ен-1,2-диил, проп-1-ен-1,3-диил, циклопроп-1-ен-1,2-диил, циклопроп-2-ен-1,2-диил, циклопроп-2-ен-1,1-диил, проп-1-ин-1,3-диил и т.д.; бутилдиилы, такие как бутан-1,1-диил, бутан-1,2-диил, бутан-1,3-диил, бутан-1,4-диил, бутан-2,2-диил, 2-метилпропан-1,1-диил, 2-метилпропан-1,2-диил, циклобутан-1,1-диил; циклобутан-1,2-диил, циклобутан-1,3-диил, бут-1-ен-1,1-диил, бут-1-ен-1,2-диил, бут-1-ен-1,3-диил, бут-1-ен-1,4-диил, 2-метилпроп-1-ен-1,1-диил, 2-метанилиден-пропан-1,1-диил, бута-1,3-диен-1,1-диил, бута-1,3-диен-1,2-диил, бута-1,3-диен-1,3-диил, бута-1,3-диен-1,4-диил, циклобут-1-ен-1,2-диил, циклобут-1-ен-1,3-диил, циклобут-2-ен-1,2-диил, циклобута-1,3-диен-1,2-диил, циклобута-1,3-диен-1,3-диил, бут-1-ин-1,3-диил, бут-1-ин-1,4-диил, бута-1,3-диин-1,4-диил и т.д.; и подобных. Когда присутствуют специфические уровни насыщения, использовалась номенклатура алканилдиил, алкенилдиил и/или алкинилдиил. Если строго определено, что две валентности находятся на одном атоме углерода, использовали номенклатуру алкилиден. Низший алкилдиил представляет собой алкилдиильную группу, содержащую 1-6 атомов углерода. В некоторых вариантах осуществления алкилдиильные группы являются насыщенными ациклическими алканилдиильными группами, в которых радикальные центры находятся на концевых углеродах, например метандиил (метано); этан-1,2-диил (этано); пропан-1,3-диил (пропано); бутан-1,4-диил (бутано); и подобными (также обозначаемых как алкилены, определено ниже).

Алкилен, сам по себе или как часть другого заместителя, относится к прямоцепочечной насыщенной или ненасыщенной алкилдиильной группе, имеющей два концевых одновалентных радикальных центра, полученных путем удаления одного атома водорода от каждого из двух концевых атомов углерода прямоцепочечного незамещенного алкана, алкена или алкина. Локализация двойной связи или тройной связи, если она присутствует, в отдельном алкилене указывается в квадратных скобках. Типичные алкиленовые группы включают, без ограничения, метилен (метано); этилены, такие как этано, этено, этино; пропилены, такие как пропано, проп[l]ено, пропа[l,2]диено, проп[l]ино и т.д.; бутилены, такие как бутано, бут[l]ено, бут[2]ено, бута[l,3]диено, бут[l]ино, бут[2]ино, бута[l,3]диино и т.д.; и подобные. Если специфические уровни насыщения присутствуют, используется номенклатура алкано, алкено и/или алкино. В некоторых вариантах осуществления алкиленовая группа представляет собой (C₁-C₆)- или (C₁-C₃)-алкилен. В некоторых вариантах осуществления алкиленовая группа представляет собой прямоцепочечную насыщенную алканогруппу, например метано, этано, пропано, бутано и подобные.

Циклоалкил, сам по себе или как часть другого заместителя, относится к циклической версии алкильной группы. Типичные циклоалкильные группы включают, без ограничения, циклопропил; циклобутилы, такие как циклобутанил и циклобутенил; циклопентилы, такие как циклопентанил и циклопентенил; циклогексилы, такие как циклогексанил и циклогексенил; и подобные.

Незамещенная ароматическая циклическая система относится к ненасыщенной циклической или полициклической системе, имеющей сопряженную π-электронную систему. Специально включенными в определение "незамещенной ароматической циклической системы" являются конденсированные циклические системы, в которых один или несколько циклов являются ароматическими и один или несколько циклов являются насыщенными или ненасыщенными, такие как, например, флуорен, индан, инден, фенален, тетрагидронафталин и т.д. Типичные незамещенные ароматические циклические системы включают, без ограничения, ацеантрилен, аценафтилен, ацефенантрилен, антрацен, азулен, бензол, хризен, коронен, флуорантен, флуорен, гексацен, гексафен, гексален, индацен, s-индацен, индан, инден, нафталин, октацен, октафен, октален, овален, пента-2,4-диен, пентацен, пентален, пентафен, перилен, фенален, фенантрен, пицен, плейаден, пирен, пирантрен, рубицин, тетрагидронафталин, трифенилен, тринафталин и подобные.

Арил, сам по себе или как часть другого заместителя, относится к одновалентной ароматической углеводородной группе, имеющей установленное число атомов углерода (т.е. C₅-C₁₅ обозначает от 5 до 15 атомов углерода), полученный путем удаления одного атома водорода от одного атома углерода незамещенной ароматической циклической системы. Типичные арильные группы включают, без ограничения, группы, произведенные из ацеантрилена, аценафтилена, ацефенантрилена, антрацена, азулена, бензола, хризена, коронена, флуорантена, флуорена, гексацена, гексафена, гексалена, as-индацена, s-индацена, индана, индена, нафталина, октацена, октафена, окталена, овалена, пента-2,4-диена, пентацена, пенталена, пентафена, перилена, феналена, фенантрена, пицена, плейадена, пирена, пирантрена, рубицина, трифенилена, тринафталина и подобных, а также их различных гидроизомеров. В некоторых вариантах осуществления арильная группа представляет собой (C₅-C₁₅)-арил, более типично (C₅-C₁₀). Специфическими примерами являются фенил и нафтил.

Галоген или атом галогена сами по себе или как часть другого заместителя, пока не утверждается иное, относятся к атому фтора, хлора, брома и йода.

Галогеналкил, сам по себе или как часть другого заместителя, относится к алкильной группе, в которой один или несколько атомов водорода замещены на галоген. Так, термин "галогеналкил" относится к моногалогенидалкилам, дигалогенидалкилам, тригалогенидалкилам и т.д. до пергалогенидалкилов. Например, выражение "(C₁-C₂)-галогенидалкил" включает фторметил, дифторметил, трифторметил, 1-фторэтил, 1,1-дифторэтил, 1,2-дифторэтил, 1,1,1-трифторэтил, перфторэтил и т.д.

Гидроксиалкил, сам по себе или как часть другого заместителя, относится к алкильной группе, в которой один или несколько атомов водорода заменены с гидроксильным заместителем. Так, термин "гидроксиалкил" относится к моногидроксиалкилам, дигидроксиалкилам, тригидроксиалкилам и т.д.

Определенные выше группы могут включать преффиксы и/или суффиксы, которые обычно применяются в данной области техники для создания добавочных хорошо узнаваемых групп заместителей. В качестве примеров, алкилокси или алкокси относятся к группе формулы -OR, алкиламин относится к группе формулы -NHR и диалкиламин относится к группе формулы -NRR, где R, каждый независимо, представляет собой алкил. В качестве другого примера, галогеналкокси или галогеналкилокси относятся к группе формулы -OR', где R' представляет собой галогеналкил.

Термин "пролекарство" относится к производному активного соединения (лекарства), которое может требовать трансформации в условиях применения, таких как в пределах тела, для высвобождения активного лекарства. Пролекарства являются часто, но не необходимо, фармакологически неактивными до тех пор, пока не конвертированы в активные лекарства. Пролекарства обычно получаются путем маскировки функциональной группы в соединении лекарства, размещающейся в части, требующейся для активности, с прогруппой (определена ниже) для образования скрытой функциональности, которая претерпевает трансформацию, такую как расщепление, в определенных условиях применения, для высвобождения функциональной группы и, таким образом, активного лекарства. Расщепление скрытой функции может происходить самопроизвольно, например путем реакции гидролиза, или может быть катализировано или инициировано другим агентом, таким как фермент, действием света, кислоты или основания, или изменения, или воздействия, физического параметра или параметра окружающей среды, такого как изменение температуры. Агент может являться эндогенным в условиях применения, таким как фермент, присутствующий в клетках, которым назначают пролекарство, или кислотным условиям в желудке, или может поступать извне.

Широкое разнообразие прогрупп, так же как конечных скрытых функций, пригодных для маскировки функциональных групп в активных стереоизомерно обогащенных описанных здесь соединениях, которые дают пролекарства, хорошо известные в данной области техники. Например, гидроксильная функциональная группа может быть маскирована как сульфонатная, сложноэфирная или карбонатная скрытая функция, которые могут быть гидролизованы in vivo для образования гидроксильной группы. Аминофункциональная группа может быть маскирована как амидная, карбаматная, иминная, мочевинная, фосфенильная, фосфорильная или сульфенильная скрытая функция, которые могут быть гидролизованы in vivo для образования аминогруппы. Карбоксильная группа может быть маскирована как сложноэфирная (включая силильные сложные эфиры и сложные тиоэфиры), амидная или гидразидная скрытые функции, которые могут быть гидролизованы in vivo для образования карбоксильной группы. Другие специфические примеры пригодных прогрупп и их соответствующих скрытых функций будут очевидны для специалистов в данной области.

Термин "прогруппа" относится к типу защитной группы, которая, когда применяется для маскировки функциональной группы в активном стереоизомерно обогащенном соединении лекарства для образования скрытой функции, конвертирует лекарство в пролекарство. Прогруппы типично присоединены к функциональной группе лекарства через связи, которые являются расщепляемыми в определенных условиях применения. Таким образом, прогруппа является частью скрытой функции, которая расщепляется для высвобождения функциональной группы в определенных условиях применения. В качестве специфического примера амидная скрытая функция формулы -NH-C(O)CH₃ включает прогруппу -C(O)CH₃.

Термин "пролиферативное расстройство" относится к заболеванию или расстройству, характеризуемому аберрантной клеточной пролиферацией, например, когда клетки делятся больше, чем соответствующие нормальные клетки. Аберрантная пролиферация может быть вызвана любым механизмом действия или комбинацией механизмов действия. Например, клеточный цикл одной или нескольких клеток может подвергаться воздействию такому, что клетка(и) делится более часто, чем соответствующие нормальные клетки, или, в качестве другого примера, одна или несколько клеток могут обходить ингибирующие сигналы, которые обычно ограничивают число их делений. Пролиферативные заболевания включают, без ограничения, медленно или быстро растущие опухоли и раки.

Термин "антипролиферативное соединение" относится к соединению, которое ингибирует пролиферацию клетки по сравнению с необработанной контрольной клеткой подобного типа. Ингибирование может быть проведено по любому механизму или комбинации механизмов и может действовать, ингибируя пролиферацию цитостатично или цитотоксично. В качестве специфического примера ингибирование, применяемое здесь, включает, без ограничения, задержку клеточного деления, уменьшение скорости клеточного деления, пролиферации и/или роста и/или индуцирование смерти клетки, по любому механизму действия, включая, например, апоптоз.

Aurora-киназа относится к члену семейства серин/треонин белковых киназ, которые, как правило, обозначают как aurora-киназы. Семейство aurora серин/треонин белковых киназ является существенно важным для клеточной пролиферация (см., например, Bischhoff & Plowman, 1999, Trends Cell Biol. 9: 454-459; Giet & Prigent, 1999, J. Cell Science 112: 3591-3601; Nigg, 2001, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 21-32; Adams et al., 2001, Trends Cell Biol. 11: 49-54). В настоящее время у млекопитающих известны три члена семейства: aurora-A ("2"), aurora-B ("1") и aurora-C ("3") (см., например, Giet & Prigent, 1999, J. Cell Sci. 112: 3591-3601; Bischhoff & Plowman, 1999, Trends Cell Biol. 9: 454-459). Применяемый здесь термин "aurora-киназа" включает не только эти три известных у млекопитающих члена семейства, но также открытые позже у млекопитающих члены семейства и гомологичные белки из других образцов и организмов (в качестве неограничивающих примеров гомологичных членов семейства aurora-киназ из других образцов и организмов см. Schumacher et al., 1998, J. Cell Biol. 143: 1635-1646; Kimura et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 13766-13771).

Процесс, опосредованный aurora-киназой, или заболевание или расстройство, опосредованное aurora-киназой, относятся к клеточному процессу, заболеванию или расстройству, в которых aurora-киназа играет роль. Предполагается, что aurora-киназы играют ключевую роль в эпизодах фосфорилирования белка, которые регулируют митотическую фазу клеточного цикла. Человеческие aurora-киназы обнаруживают различные субклеточные локализации в течение митоза. Например, aurora-A регулируется на повышение концентрации в течение M-фазы клеточного цикла и локализуется на веретенном полюсе в течение митоза, что предполагает включение в функции центросомы. В то время как активность aurora-A максимизируется в течение профазы, предполагается, что aurora-B играет важную роль во время хроматидного разделения и образования бороздки расщепления в анафазе и телофазе. Роль aurora-C менее очевидна, но была показана локализация в центросомах в течение митоза от анафазы до цитокинеза. Кроме того, ингибирование активности aurora-киназы в клетках млекопитающих ведет к ненормальному клеточному росту и полиплоидии (Terada et al., 1998, EMBO J. 17: 667-676). Таким образом, полагают, что aurora-киназы регулируют клеточное деление, хромосомную сегрегацию, образование митотического веретена и цитокинез. Применяемые здесь, все эти различные процессы находятся в пределах объема процесса, опосредованного aurora-киназами.

Кроме того, с момента его открытия в 1997 г. семейство aurora-киназ у млекопитающих близко связано с опухолеобразованием. Наиболее неотразимое доказательство этого состоит в том, что сверхэкспрессия aurora-A трансформирует фибробласты грызуна (Bischoff et al., 1998, EMBO J. 17: 3052-3065). Клетки с повышенным уровнем этой киназы содержат множественные центросомы и многополярные веретена и быстро становятся анэуплоидными. Онкогенная активность aurora-киназ, вероятно, связана с генерацией такой генной неустойчивости. Действительно, наблюдали корреляцию между экстракопированием положения хромосомы aurora-A и хромосомальной неустойчивостью в раках груди и желудка (Miyoshi et al., 2001, Int. J. Cancer 92: 370-373; Sakakura et al., 2001, Brit. J. Cancer 84: 824-831).

Сообщалось, что aurora-киназы сверхэкспрессированы в большом количестве опухолей у человека. Повышенная экспрессия aurora-A была зафиксирована в более 50% колоректального рака (Bischoff et al., 1998, EMBO J. 17: 3052-3065; Takahashi et al., 2000, Jpn. J. Cancer Res. 91: 1007-1014), рака яичников (Gritsko et al., 2003, Clinical Cancer Research 9: 1420-1426) и рака желудка (Sakakura, 2001, Brit. J. Cancer 84: 824-831) и в 94% инвазивных канальных аденокарцином груди (Tanaka, 1999, Cancer Research. 59: 2041-2044). Также сообщалось о высоких уровнях aurora-A в клеточных линиях почечного рака, рака шейки матки, нейробластомы, меланомы, лимфомы, панкреатического рака и рака простаты (Bischoff et al., 1998, EMBO J. 17: 3052-3065; Kimura et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 7334-7340; Zhou et al., 1998, Nature Genetics 20: 189-193; Li et al., 2003, Clin. Cancer Res. 9(3): 991-7). Усиление/сверэкспрессию aurora-A наблюдали в раках мочевого пузыря человека и усиление aurora-A ассоциировали с анеуплоидией и агрессивным развитием болезни (Sen et al., 2002, J. Natl. Cancer Inst. 94(17): 1320-9). Кроме того, экстракопирование положения хромосомы aurora-A (20ql3) коррелирует с плохим прогнозом для пациентов с неузловым раком груди (Isola et al., 1995, American Journal of Pathology 147: 905-911). Aurora-B высоко экспрессирована в множественных человеческих опухолевых клеточных линиях, включая лейкемические клетки (Katayama et al., 1998, Gene 244: 1-7). Уровни этого фермента увеличиваются как функция стадии Дьюка в первичных колоректальных раках (Katayama et al, 1999, J. Nat'l Cancer Inst. 91: 1160-1162). Aurora-C, которую обычно обнаруживают только в эмбриональных клетках, также сверхэкспрессирована в значительном проценте первичных колоректальных раков и в разнообразных раковых клеточных линиях, включая клетки аденокарциномы шейки матки и карциномы груди (Kimura et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 7334-7340; Takahashi et al., 2000, Jpn. J. Cancer Res. 91: 1007-1014).

В противоположность этому семейство aurora экспрессировано на низком уровне в большинстве нормальных тканей за исключением тканей с высоком содержанием делящихся клеток, таких как тимус и яичко (Bischoff et al., 1998, EMBO J., 17: 3052-3065).

Для дальнейшего обзора роли(ей), которую aurora-киназы играют в пролиферативных расстройствах, см. Bischhoff & Plowman, 1999, Trends Cell Biol. 9: 454-459; Giet & Prigent, 1999, J. Cell Science 112: 3591-3601; Nigg, 2001, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 21-32; Adams et al., 2001, Trends Cell Biol. 11: 49-54 и Dutertre et al., 2002, Oncogene 21: 6175-6183.

Хотя сверхэкспрессия белков раковыми клетками не всегда указывает, что ингибирование белковой активности будет приводить к противоопухолевому эффекту, в функциональных исследованиях было подтверждено, что по меньшей мере следующие типы опухолевых клеток чувствительны к ингибированию активности aurora-киназы: простатические (DU145), шейки матки (Hela), панкреатические (Mia-Paca2, BX-PC3), гистологической лейкемии (U937), аденокарциномы легкого, эпидермоида легкого, мелкоклеточной карциномы легкого, груди, почечной карциномы, MolT3 (все) и Molt4 (все).

Основываясь на установленной роли aurora-киназ в разнообразных раках, примеры заболеваний и расстройств, опосредованных aurora-киназами, включают без ограничения меланому, лейкемию и солидноопухолевые раки, такие как, например, колоректальный, груди, желудка, яичников, шейки матки, почечный, простаты, панкреатический рак, меланому, лимфому, нейробластому и рак мочевого пузыря.

Терапевтически эффективное количество относится к количеству соединения, достаточному для лечения определенного расстройства, или заболевания, или одного или нескольких его симптомов. В отношении онкогенных пролиферативных расстройств терапевтически эффективное количество включает количество, достаточное для, среди прочего, сокращения опухоли или для уменьшения скорости роста опухоли.

Во многих случаях стандартные лечения онкогенного пролиферативного расстройства включают хирургическое вмешательство для удаления опухоли(ей) или отдельно, или в комбинации с лекарствами (хемотерапия) и/или радиационными терапиями. Применяемый здесь термин "терапевтически эффективное количество" соединения относится к количеству соединения, которое или предотвращает рецидив раков у пациентов, которые имели хирургически удаленную опухоль(и), или замедляет скорость возвращения опухоли(ей) у таких пациентов.

Согласно этому применяемое здесь обозначение "терапевтически эффективное количество" относится к количествам соединений, которые предоставляют терапевтическое преимущество дополнительно к другому типу терапии, такому как хирургическое вмешательство и/или лечение другими антипролиферативными агентами, включая, например, 5-фторурацил, винорелбин, таксол, винбластин, цисплатин, топотекан и т.д.

Профилактически эффективное количество относится к количеству соединения, достаточному для предотвращения развития определенного расстройства или заболевания у пациента. Типично, пациенты, к которым применяется профилактика, не страдают от определенного расстройства или заболевания, но считаются пациентами с повышенным риском развития этого заболевания или расстройства, основываясь на таких факторах, как, без ограничения, диагностические маркеры и история семейства.

6.2. Стереоизомерно обогащенные и стереоизомерно чистые соединения

Недавно было обнаружено, что определенные соединения ряда N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-N2-(замещенный фенил)-2,4-пиримидиндиамина, представленного структурной формулой (I) ниже, представляют собой мощные ингибиторы активности aurora-киназы и пролиферации раковых клеток в исследованиях in vitro (см., например, заявку № 11/133419, опубликованную 18 мая 2005 г., одновременную с заявкой № _________, озаглавленной как "Stereoisomerically Enriched β-Lactams Using Candida Antarctica", опубликованную одновременно с настоящей (подтверждено описью адвоката № 375462-030US), и международную заявку на патент № PCT/US05/17470, опубликованную 18 мая 2005 г., и цитированные там приоритетные заявки):

Специалисты в данной области высоко оценят, что в структурной формуле (I) стереохимия при углеродах 1, 2, 3 и 4 является неопределенной, так что соединения структурной формулы (I) включают восемь диастереомеров, представленных структурными формулами (Ia)-(Ih) ниже:

Соединения структурной формулы (I) также включают два цис-рацемата, представленных структурными формулами (IIa) и (IIb), и два транс-рацемата, представленные структурными формулами (IIIa) и (IIIb) ниже:

Цис-рацемат структурной формулы (IIa) может быть обозначен как 2-экзо-3-экзо-рацемат и, соответственно, включает (1R,2R,3S,4S)- и (1S,2S,3R,4R)-диастереомеры структурных формул (Ia) и (Ib). Цис-рацемат структурной формулы (IIb) может быть обозначен как 2-эндо-3-эндо-рацемат и включает, соответственно, (1R,2S,3R,4S)- и (1S,2R,3S,4R)-диастереомеры структурной формулы (Ic) и (Id). Как описано более детально в разделе примеров, для соединений, в которых R⁵ представляет собой атом фтора, R¹ представляет собой атом водорода, R² представляет собой 4-метилпиперазин-1-ил и R³ представляет собой метил, эти два цис-рацемата проявляют антипролиферативную активность по отношению к разнообразным различным линиям опухолевых клеток в антипролиферационных исследованиях in vitro. Однако этот 2-экзо-3-экзо-рацемат (рацемат r1) является приблизительно двадцатикратно более мощным, чем соответствующий 2-эндо-3-эндо рацемат (рацемат r2) во всех клеточных линиях, тестированных с обоими рацематами. Кроме того, было обнаружено, что (1R,2R,3S,4S)-диастереомер рацемата r1 является в значительной степени ответственным за потенциал рацемата r1. При тестировании на выделенных стереоизомерах этот (1R,2R,3S,4S)-диастереомер (обозначен как "a" диастереомер), как правило, проявляет IC₅₀ величины в наномолярном диапазоне, в то время как (1S,2S,3R,4R)-диастереомер (обозначен как "b" энантиомер), как правило, имеет IC₅₀ величины в микромолярном диапазоне на тех же клеточных линиях. Таким образом, в общем, (1R,2R,3S,4S)-диастереомер этого соединения является, как правило, 1000-кратно более мощным, чем его соответствующий (1S,2S,3R,4R)-энантиомер. Он также приблизительно в 20-50 раз более эффективен, чем соответствующий 2-эндо-3-эндо r2 рацемат в тестированных клеточных линиях. Подобным образом (1R,2R,3S,4S)-диастереомер проявляет превосходные результаты по сравнению с его (1S,2S,3R,4R)-энантиомером в основанных на клетках исследованиях ингибирования aurora-киназы B. Основываясь на наблюдающейся эффективности этого (1R,2R,3S,4S)-диастереомера, ожидали, что полный диапазон (1R,2R,3S,4S)-диастереомеров структурной формулы (Ia) будет подобным образом проявлять великолепную эффективность по сравнению с их соответствующими (1S,2S,3R,4R)-энантиомерами, 2-экзо-3-экзо-рацематами, 2-эндо-3-эндо-рацематами и другими соответствующими диастереомерами.

Согласно этому представленные здесь соединения, которые являются обогащенными, - это особенно мощные (1R,2R,3S,4S)-диастереомеры. В одном варианте осуществления такие стереоизомерно обогащенные соединения включают соединения структурной формулы (I):

которые обогащены соответствующим диастереомером структурной формулы (Ia):

где

каждый R¹ является независимо выбранным из группы, состоящей из атома водорода, низшего алкила, -(CH₂)_nOH, -OR^a, -O(CH₂)_n-R^a, -O(CH₂)_n-R^b, -C(O)OR^a, атома галогена, -CF₃ и -OCF₃;

каждый R² является независимо выбранным из группы, состоящей из атома водорода, низшего алкила, -OR^a, -O(CH₂)_n-R^a, -O(CH₂)_n-R^b, -NHC(O)R^a, атома галогена, -CF₃, -OCF₃,

каждый R³ является независимо выбранным из группы, состоящей из атома водорода, низшего алкила, -(CH₂)_n-OH, -OR^a, -O(CH₂)_n-R^a, -O(CH₂)_n-R^b, атома галогена, -CF₃, -OCF₃,

каждый R⁴ является независимо выбранным из группы, состоящей из атома водорода, низшего алкила, арилалкила, -OR^a, -NR^cR^c, -C(O)R^a, -C(O)OR^a и -C(O)NR^cR^c;

R⁵ представляет собой атом водорода, атом галогена, атом фтора, -CN, -NO₂, -C(O)OR^a или -CF₃;

n, каждое независимо, представляет собой целое число от 1 до 3;

каждый R^a является независимо выбранным из группы, состоящей из атома водорода, низшего алкила и низшего циклоалкила;

каждый R^b является независимо выбранным из группы, состоящей из -OR^a, -CF₃, -OCF₃, -NR^cR^c, -C(O)R^a, -C(O)OR^a, -C(O)NR^cR^c и -C(O)NR^aR^d;

каждый R^c является независимо выбранным из группы, состоящей из атома водорода и низшего алкила, или, альтернативно, два R^c заместителя вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать 4-9-членный насыщенный цикл, который необязательно включает 1-2 дополнительные гетероатомные группы, выбранные из O, NR^a, NR^a-C(O)R^a, NR^a-C(O)OR^a и NR^a-C(O)NR^a; и

R^d, каждый независимо, представляет собой низший моногидроксиалкил или низший дигидроксиалкил.

В другом варианте осуществления такие стереоизомерно обогащенные соединения включают 2-экзо-3-экзо цис-рацематы структурной формулы (IIa), где R¹, R², R³, R⁴ и R⁵ определены ранее для структурной формулы (I), которые обогащены диастереомером структурной формулы (Ia), supra.

Применяемое здесь обозначение, что соединение является «обогащенным», в частности, диастереомером, относится к ситуации, когда диастереомер присутствует в избытке над любым другим диастереомером, присутствующим в соединении. Действительное процентное содержание отдельного диастереомера, составляющего соединение, будет зависеть от числа других присутствующих диастереомеров. В качестве специфического примера, рацемическая смесь является обогащенной по определенному энантиомеру, когда этот энантиомер составляет более чем 50% смеси. Независимо от числа присутствующих диастереомеров соединение, которое является обогащенным, в частности, диастереомером, будет обычно включать по меньшей мере около 60%, 70%, 80%, 90% или даже более определенного диастереомера. Степень обогащения отдельного диастереомера может быть подтверждена с использованием традиционных аналитических способов, традиционно применяемых специалистами в данной области, как будет обсуждаться более детально ниже.

В другом варианте осуществления стереоизомерно обогащенные соединения включают соединения вышеупомянутой структурной формулы (Ia), supra, где R¹, R², R³, R⁴ и R⁵ определены ранее для структурной формулы (I), которые в основном свободны от соответствующего энантиомера и/или любого другого соответствующего диастереомера. Определение "в основном свободен от" обозначает, что соединение содержит менее чем около 10% нежелательных диастереомеров и/или энантиомеров, как установлено путем применения традиционных аналитических методов, регулярно применяемых специалистами в данной области (обсуждается более детально ниже). В некоторых вариантах осуществления количество нежелательных стереоизомеров может быть менее чем 10%, например 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или даже менее. Стереоизомерно обогащенные соединения, которые содержат около 95% или более желательного стереоизомера, обозначаются здесь как "в основном чистые" стереоизомеры. Стереоизомерно обогащенные соединения, которые содержат около 99% или более желаемого стереоизомера, обозначаются здесь как "чистые" стереоизомеры. Чистота любого стереоизомерно обогащенного соединения (диастереомерная чистота; % de) может быть подтверждена путем применения традиционных аналитических методов, как будет описано более детально ниже.

В некоторых вариантах осуществления различных стереоизомерно обогащенных соединений, описанных здесь, R¹ представляет собой атом водорода; R² представляет собой и R³ является отличным от В других вариантах осуществления описанных здесь различных стереоизомерно обогащенных соединений R³ представляет собой атом водорода, метил, метокси, трифторметил или атом хлора. В других вариантах осуществления R⁴ представляет собой метил, -C(O)CH₃, -C(O)OCH₃ или -C(O)OCH₂CH₃.

В следующих вариантах осуществления различных стереоизомерно обогащенных соединений, описанных здесь, R¹ представляет собой атом водорода, R² является отличным от и R³ представляет собой В следующих вариантах осуществления R² представляет собой атом водорода, метил, метокси, трифторметил или атом хлора. Предпочтительно, R⁴ представляет собой метил, -C(O)CH₃, -C(O)OCH₃ или -C(O)CH₂CH₃.

В следующих вариантах осуществления описанных здесь различных стереоизомерно обогащенных соединений R² является отличным от и R³ является отличным от В других вариантах осуществления R¹ и R², каждый, представляют собой атом водорода и R³ представляет собой -OCH₂NHR^a. В некоторых других вариантах осуществления R¹, R² и R³, каждый, независимо один от другого являются выбранными из группы, состоящей из атома водорода, метила, метокси, трифторметила и атома хлора, с условием, что по меньшей мере два из R¹, R² и R³ являются отличными от атома водорода.

В следующих вариантах осуществления R¹ представляет собой атом водорода, R² выбран из группы, состоящей из атома водорода, и , и R³ выбран из группы, состоящей из атома водорода, низшего алкила, атома галогена, CF₃, и В других вариантах осуществления R³ выбран из группы, состоящей из атома водорода, метила, атома хлора, -CF₃, и , и R⁴ представляет собой метил, -COR^a или -CO(O)R^a, где R^a представляет собой метил или этил. В следующем варианте осуществления R² выбран из группы, состоящей из атома водорода, и и R³ выбран из группы, состоящей из атома водорода, низшего алкила, атома галогена, -CF₃, и В других вариантах осуществления R³ выбран из группы, состоящей из атома водорода, метила, атома хлора, -CF₃, и , и R⁴ представляет собой метил, -COR^a или -CO(O)R³, где R^a представляет собой метил или этил. Предпочтительно, R² представляет собой R⁴ представляет собой -COR^a, где R^a представляет собой метил; и R³ представляет собой атом водорода. В других вариантах осуществления R² представляет собой R⁴ представляет собой -CO(O)R^a, где R^a представляет собой этил и R³ представляет собой атом водорода.

В следующем варианте осуществления R² представляет собой и R³ представляет собой атом водорода.

В следующем варианте осуществления R² представляет собой атом водорода; R³ представляет собой и R⁴ представляет собой метил, -COR^a или -CO(O)R^a, где R^a представляет собой метил или этил. Предпочтительно, R² представляет собой R⁴ представляет собой метил и R³ выбран из группы, состоящей из атома водорода, метила, атома хлора и -CF₃. Более предпочтительно, R³ представляет собой метил.

В следующих вариантах осуществления описанных здесь стереоизомерно обогащенных соединений R⁵ представляет собой атом фтора.

В следующих вариантах осуществления стереоизомерно обогащенное соединение представляет собой в основном стереоизомерно чистый или стереоизомерно чистый (1R,2R,3S,4S)-N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[3-метил-4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]-2,4-пиримидиндиамин.

Дополнительные типичные варианты осуществления соединений структурной формулы (I), которые могут быть стереоизомерно обогащены соответствующим диастереомером вышеописанной структурной формулы (Ia), в основном свободные от их любых энантиомеров и/или диастереомеров, и/или в основном чистые, или чистые в форме вышеописанного диастереомера структурной формулы (Ia), представлены в таблице 1 ниже:

Когда упоминаются описанные здесь специфические диастереомеры и/или рацемические смеси специфических соединений, такие как соединения, описанные в таблице 1, номер соединения продолжен далее буквой, обозначающей специфический диастереомер или рацемическую смесь, согласно следующим обозначениям:

a= (1R,2R,3S,4S)

b= (1S,2S,3R,4R)

c= (1R,2S,3R,4S)

d= (1S,2R,3S,4R)

e= (1R,2R,3R,4S)

f= (1S,2S,3S,4R)

g= (1R,2S,3S,4S)

h= (1S,2R,3R,4R)

r1= 2-экзо-3-экзо цис-рацемат

r2= 2-эндо-3-эндо цис-рацемат

r3= 2-экзо-3-эндо транс-рацемат

r4= 2-эндо-3-экзо транс-рацемат.

Таким образом, в качестве специфического примера, (1R,2R,3S,4S)-диастереомер соединения 60 обозначается как соединение 60a.

Специалисты в данной области высоко оценят, что описанные здесь стереоизомерно обогащенные соединения могут включать функциональные группы, которые могут быть маскированы с прогруппами для создания пролекарств. Такие пролекарства обычно являются, но необязательно, фармакологически неактивными до тех пор, пока они не конвертированы в их активную лекарственную форму. Например, эфирные группы обычно претерпевают кислотно-катализируемый гидролиз, который дает исходную карбоновую кислоту, когда попадают в кислотные условия желудка, или основно-катализируемый гидролиз, когда попадают в основные условия в кишечнике или в крови. Таким образом, когда назначаются пациенту перорально стереоизомерно обогащенные соединения, которые включают эфирные фрагменты, могут считаться пролекарствами для их соответствующей карбоновой кислоты независимо от того, является ли эфирная форма фармакологически активной.

В объем правовой охраны изобретения включены пролекарства различных описанных здесь стереоизомерно обогащенных соединений. В таких пролекарствах любой доступный функциональный фрагмент может быть маскирован прогруппой для получения пролекарства. Функциональные группы в описанных здесь стереохимически обогащенных соединениях, которые могут быть маскированы прогруппами для включения в скрытую функцию, включают, без ограничения, амины (первичные и вторичные), гидроксилы, сульфанилы (тиолы), карбоксилы и т.д. В данной области техники известно очень большое число прогрупп, пригодных для маскировки таких функциональных групп, которые дают скрытые функции, которые являются расщепляемыми в желательных условиях применения. Все эти прогруппы, по отдельности или в комбинациях, могут быть включены в стереоизомерно обогащенные пролекарства по изобретению.

В одном иллюстративном варианте осуществления стереоизомерно обогащенные пролекарства, которые являются обогащенными соответствующим диастереомером вышеупомянутой структурной формулы (Ia), supra, представляют собой соединения вышеупомянутой структурной формулы (I), в которых R^a, R^b и R^c могут быть, в добавление к их вышеописанным вариантам, прогруппой.

Специалисты в данной области высоко оценят, что много соединений и пролекарств, описанных здесь, так же как различных образцов соединений, специально описанных и/или представленных здесь, обнаруживают явление таутомерии и конформационной изомерии. Например, соединения и пролекарства могут существовать в некоторых таутомерных формах, включая енольную форму, кетонную форму и их смеси. Поскольку различные названия соединения, формулы и схематические начертания соединения в пределах описания и формулы изобретения могут представлять только одну из возможных таутомерных или конформационных форм, необходимо понимать, что изобретение включает любые таутомеры или конформационные изомеры, соединения или пролекарства, имеющие одно или несколько описанных здесь применений, так же как смеси этих различных изомерных форм. В случаях ограниченного вращения вокруг 2,4-пиримидиндиаминового ядра системы также возможны атропоизомеры, и они также специально включены в соединения и/или пролекарства по изобретению.

В зависимости от природы различных заместителей стереоизомерно обогащенные соединения и пролекарства могут находиться в форме солей. Такие соли включают соли, применимые для фармацевтических применений ("фармацевтически приемлемые соли"), соли, применимые для ветеринарных применений, и т.д. Как хорошо известно в области техники, такие соли могут быть произведены из кислот или оснований.

В некоторых вариантах осуществления соль представляет собой фармацевтически приемлемую соль. Как правило, фармацевтически приемлемые соли являются теми солями, которые сохраняют в основном одну или несколько желаемых фармакологических активностей исходного соединения и которые приемлемы для назначения людям. Фармацевтически приемлемые соли включают соли присоединения кислоты, образованные с неорганическими кислотами или органическими кислотами. Неорганические кислоты, пригодные для образования фармацевтически приемлемых солей присоединения кислоты, включают, в качестве примера и без ограничения, галогенводородные кислоты (например, соляную кислоту, бромистоводородную кислоту, йодистоводородную кислоту и т.д.), серную кислоту, азотную кислоту, фосфорную кислоту и подобные. Органические кислоты, пригодные для образования фармацевтически приемлемых солей присоединения кислоты, включают, в качестве примера и без ограничения, уксусную кислоту, трифторуксусную кислоту, пропионовую кислоту, гексановую кислоту, циклопентанпропионовую кислоту, гликолевую кислоту, щавелевую кислоту, пировиноградную кислоту, молочную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, яблочную кислоту, малеиновую кислоту, фумаровую кислоту, винную кислоту, лимонную кислоту, пальмитиновую кислоту, бензойную кислоту, 3-(4-гидроксибензоил)бензойную кислоту, коричную кислоту, манделовую кислоту, алкилсульфоновые кислоты (например, метансульфоновую кислоту, этансульфоновую кислоту, 1,2-этандисульфоновую кислоту, 2-гидроксиэтансульфоновую кислоту и т.д.), арилсульфоновые кислоты (например, бензолсульфоновую кислоту, 4-хлорбензолсульфоновую кислоту, 2-нафталинсульфоновую кислоту, 4-толуолсульфоновую кислоту, камфорсульфоновую кислоту и т.д.), 4-метилбицикло[2,2,2]-окт-2-ен-1-карбоновую кислоту, глюкогептоновую кислоту, 3-фенилпропионовую кислоту, триметилуксусную кислоту, третичную бутилуксусную кислоту, лаурилсерную кислоту, глюконовую кислоту, глутаминовую кислоту, гидроксинафтойную кислоту, салициловую кислоту, стеариновую кислоту, муконовую кислоту и подобные.

Фармацевтически приемлемые соли также включают соли, образующиеся, когда кислотный протон, присутствующий в незамещенном соединении, или замещается на ион металла (например, ион щелочного металла, щелочноземельного металла или ион алюминия), или координируется с органическим основанием (например, этаноламином, диэтаноламином, триэтаноламином, N-метилглюкамином, морфолином, пиперидином, диметиламином, диэтиламином и т.д.).

Как хорошо известно в данной области техники, стереоизомерно обогащенные соединения и пролекарства, так же как их соли, могут находиться в форме гидратов, сольватов и/или N-оксидов.

Стереоизомерное обогащение и/или чистота соединения и пролекарства, описанных здесь, могут быть установлены традиционными аналитическими методами, хорошо известными для специалистов в данной области. Например, хиральные сдвигающие ЯМР реагенты, газохроматографический анализ с применением хиральных колонок, анализ с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии на хиральных колонках, образование диастереомерных производных путем реакции с хиральными реагентами и традиционный анализ могут быть применены для установления стереоизомерного обогащения и/или чистоты специфического стереоизомера. Альтернативно, синтез с применением исходных веществ известного стереоизомерного обогащения и/или чистоты могут быть применены для установления стереоизомерного обогащения и/или чистоты описанных здесь соединений. Другие аналитические способы для демонстрации стереоизомерной гомогенности также находятся в пределах сферы действия специалиста в данной области.

6.3. Способы синтеза

Стереоизомерно обогащенные соединения и пролекарства могут быть синтезированы через разнообразные синтетические пути с применением коммерчески доступных исходных веществ и/или исходных веществ, получаемых традиционными синтетическими методами. Разнообразные типичные синтетические пути, которые могут быть применены для синтеза стереоизомерно обогащенных соединений и пролекарств, описаны в WO 03/063794 и US 2004/0029902, открытия которых включены здесь посредством цитирования.

В целях иллюстрации типичная синтетическая схема, которая может быть применена для синтеза всего диапазона описанных здесь соединений, представлена на схеме (I) ниже:

Схема (I)

На схеме (I) R¹, R², R³ и R⁵ определены для структурной формулы (I), supra, X представляет собой галоген (например, F, Cl, Br или I), и G, каждый, независимо от другого выбран из O и S. Необходимо отметить, что "*" в аминокарбоксамиде 6 указывает, что отдельный стереоцентр не определен. Согласно этому специалисты в данной области высоко оценят, что схема (I) может быть применена для получения рацемических диастереомерных смесей, диастереомерно обогащенных смесей соединений структурной формулы (I), так же как стереоизомеров соединений структурной формулы (I), которые в основном свободны от других определенных диастереомеров.

В соответствии со схемой (I) урацил или тиоурацил 2 дигалогенировали по 2 и 4 положениям с применением стандартного галогенирующего агента POX₃ (или других галогенирующих агентов) в стандартных условиях, что дало 2,4-бис-галогенпиримидин 4. В пиримидине 4 галоген в С4 положении является более реакционноспособным по отношению к нуклеофилам, чем галоген в С2 положении. Эта различная реакционноспособность может быть использована для синтеза описанных здесь соединений и пролекарств; во-первых, реагированием 2,4-бис-галогенпиримидина 4 с одним эквивалентом 2-аминобицикло[2.2.1]гепт-5-ен-3-карбоксамида 6, что дает 8, с последующей реакцией с анилином 10, которая дает соединения структурной формулы (I). Специалисты в данной области высоко оценят, что стереоизомерная конфигурация и оптическая чистота аминокарбоксамида 6 будет в большинстве обстоятельств определять стереоизомерную конфигурацию и оптическую чистоту соединений структурной формулы (I).

В большинстве ситуаций, как изображено на схеме, C4-галогенид является более реакционноспособным по отношению к нуклеофилам. Однако, как будет понятно специалистам в данной области, природа заместителя R⁵ может изменять эту реакционноспособность. Например, когда R⁵ представляет собой трифторметил, получается смесь 50:50 4N-замещенного-4-пиримидинамина 8 и соответствующего 2N-замещенного-2-пиримидинамина. Независимо от природы заместителя R⁵ региоселективность реакции может быть проконтролирована методом подбора растворителя и других синтетических условий (таких, как температура), как хорошо известно в области техники.

Реакции, обозначенные на схеме (I), могут проходить более быстро, когда реакционные смеси нагреваются посредством микроволнового излучения. Когда нагревание производится таким образом, могут быть применены следующие условия: нагрев до 175°C в этаноле в течение 5-20 мин в реакторе Смита (Smith) (Personal Chemistry, Biotage AB, Sweden) в запаянной ампуле (при давлении 20 бар).

Исходные вещества урацил или тиоурацил 2 могут быть приобретены в коммерческих источниках или получены с применением стандартных методик органической химии. Коммерчески доступные урацилы и тиоурацилы, которые могут быть применены как исходные вещества по схеме (I), включают, в качестве примера и без ограничения, урацил (Aldrich #13078-8; CAS Registry 66-22-8); 2-тиоурацил (Aldrich #11558-4; CAS Registry 141-90-2); 2,4-дитиоурацил (Aldrich #15846-1; CAS Registry 2001-93-6); 5-бромурацил (Aldrich #85247-3; CAS Registry 51-20-7; 5-фторурацил (Aldrich #85847-1; CAS Registry 51-21-8); 5-йодурацил (Aldrich #85785-8; CAS Registry 696-07-1); 5-нитроурацил (Aldrich #85276-7; CAS Registry 611-08-5); 5-(трифторметил)урацил (Aldrich #22327-1; CAS Registry 54-20-6). Дополнительные 5-замещенные урацилы и/или тиоурацилы доступны от General Intermediates of Canada, Inc., Edmonton, CA (http://www. generalintermediates.com) и/или Interchim, Cedex, France (http://www.interchim.com) или могут быть получены с применением стандартных методик. Очень большое количество литературных ссылок описывают приемлемые синтетические способы, предоставленные ниже.

Анилины 10 могут быть закуплены в коммерческих источниках или, альтернативно, могут быть синтезированы с использованием стандартных методик. Например, подходящие анилины могут быть синтезированы из нитропредшественников с применением стандартной химии. Специфические типичные реакции представлены в разделе примеров. См. также Vogel, 1989, Practical Organic Chemistry, Addison Wesley Longman, Ltd. и John Wiley & Sons, Inc.

Специалисты в данной области будут понимать, что в некоторых случаях анилины 10 могут включать функциональные группы, которые требуют защиты во время синтеза. Точная природа любой применяемой защитной группы(групп) будет зависеть от природы функциональной группы, которая защищается, и будет очевидна для специалистов в данной области. Руководство для выбора соответствующих защитных групп, так же как синтетические стратегии для их присоединения и удаления, могут быть найдены, например, в Greene & Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3-е издание, John Wiley & Sons, Inc., New York (1999) и ссылках, цитированных там (здесь и далее "Greene & Wuts").

Пролекарства, описанные здесь, могут быть получены традиционной модификацией вышеописанных способов.

Специалисты в данной области высоко оценят, что желаемый (1R,2R,3S,4S) диастереомер, соответствующий структурной формуле (Ia), supra, может быть выделен путем хирального разделения или другими стандартными методиками. Способы для хирального разделения специфических диастереомеров описаны более детально в разделе примеров.

Стереоизомерно обогащенные соединения и/или в основном чистые и/или чистые диастереомеры могут также быть синтезированы из исходных 2-амино-3-карбоксамидов 6, имеющих определенную стереохимию, или с помощью хиральных вспомогательных веществ.

В одном типичном варианте осуществления, представленном ниже на схеме (II), желаемый диастереомер расщепляли химически с применением (R)-метил-пара-метоксибензиламина 18 в качестве хирального вспомогательного вещества.

Схема (II)

На схеме (II) рацемический 2-экзо-3-экзо β-лактам 14r1 (полученный, как описано у Stajar et al., 1984, Tetrahedron 40(12): 2385) защищали Boc-группой, что приводило к соответствующему рацемическому Boc-защищенному β-лактаму 16r1. Boc-защищенный рацемат 16r1 затем вводили в реакцию с (R)-метил-пара-метоксибензиламином 18, что приводило к смеси диастереомеров 20a и 20b. Эту диастереомерную смесь обрабатывали кислотой, такой как TFA для расщепления Boc-группы, что приводило к смеси диастереомеров 22a и 22b, которая может быть введена в реакцию с 2,4-дигалоидпиримидином 4, что дает рацемическую смесь соединений 24a и 24b. На этой стадии соединения 24a и 24b могут быть отделены один от другого кристаллизацией и введены в реакцию с анилином 10, что дает выделенные диастереомеры 25a и 25b. Хиральные вспомогательные вещества из выделенных диастереомеров 25a и 25b могут затем быть расщеплены, что дает выделенные диастереомеры соответственно структурной формулы (Ia) и (Ib).

Для соединений 25a и 25b, в которых R¹ представляет собой атом водорода, R² представляет собой 4-метилпиперазин-1-ил, R³ представляет собой метил и R⁵ представляет собой атом фтора, расщепление хирального вспомогательного вещества представляется трудным. Для этих и других соединений, где такое расщепление представляется трудным, хиральное вспомогательное вещество может быть получено из соединений 24a и 24b, и полученные выделенные соединения введены в реакцию с анилином 10, которая дает выделенные диастереомеры структурной формулы (Ia) и (Ib). Специфические примеры таких реакций описаны в разделе примеров.

Соединения, которые являются стереоизомерно обогащенными, в основном стереоизомерно чистыми и/или стереоизомерно чистыми в виде определенных диастереомеров, могут также быть синтезированы из стереоизомерно обогащенных, в основном стереоизомерно чистых и/или стереоизомерно чистых β-лактамов. Такие стереоизомерно обогащенные и/или (в основном) стереоизомерно чистые β-лактамы могут быть ферментативно расщеплены и выделены. В одном типичном варианте осуществления (в основном) стереоизомерно чистые β-лактамы могут быть расщеплены и выделены из рацемической смеси 2-экзо-3-экзо β-лактама 14r1 с применением иммобилизованной липолазы (доступной от Sigma Chemical Co., catalog № L4777), как описано в Eniko et al., 2004, Tetrahedron Asymmetry 15: 573-575. В другом типичном варианте осуществления (в основном) стереоизомерно чистые β-лактамы могут быть расщеплены и выделены из 2-экзо-3-экзо Boc-защищенного рацемического β-лактама 16r1 с применением связанного или иммобилизованного на смоле хиразима L-2-тип B, фермент c.f. (Candida antarctica Тип B, c-f, доступен от Biocatalytics, Inc., Pasadena, CA), как описано в заявке № 60/628401, опубликованной 15 ноября 2004 г., одновременной с заявкой № 11/133419, опубликованной 18 мая 2005 г., и в международной заявке на патент № PCT/US05/17470, опубликованный 18 мая 2005 г., и одновременной с заявкой №__________, озаглавленной "Stereoisomerically Enriched β-Lactams Using Candida Antarctica", опубликованной одновременно с настоящей (подтверждено описью адвоката № 375462-030US), открытия которых включены здесь посредством цитирования. Специфический пример применения этого фермента для расщепления определенных диастереомеров β-лактамов описан в разделе примеров как способ синтеза 2-экзо-3-экзо рацемического β-лактама 16r1.

Примеры синтеза определенных диастереомеров структурной формулы (Ia), использующие ферментативные реакции, представлены на схемах (III) и (IV) ниже. Специфический пример применения фермента Новозим 435 представлен на схеме (IV), который подобен ферменту Хиразим, описанному ранее и представленному на схеме (III), который может быть применен для расщепления энантиомеров из рацемических β-лактамов, как описано в разделе примеров.

Схема (IV)

6.4. Активность антипролиферативных соединений

Активные стереоизомерно обогащенные соединения обычно ингибируют пролиферацию целевых клеток, таких как опухолевые клетки, с IC₅₀ в диапазоне от около 20 мкМ или менее, как измерено в стандартном исследовании клеточной пролиферации in vitro. Конечно, специалисты в данной области высоко оценят, что соединения, которые проявляют более низкие IC₅₀, например в порядке величин 10 мкМ, 1 мкМ, 100 нМ, 10 нМ, 1 нМ или даже более низких, могут быть особенно применимыми при терапевтических применениях. Антипролиферативная активность может быть цитостатической, или она может быть цитотоксической. В примерах, в которых желательна антипролиферативная активность, специфичная к отдельному клеточному типу, соединение может быть исследовано на активность к желаемому клеточному типу и проведен скрининг на отсутствие активности к другим клеточным типам. Желательная степень неактивности в таком скрининге или желаемое отношение активности к неактивности может различаться в различных ситуациях и может быть выбрано пользователем.

Активные соединения также обычно ингибируют активность aurora-киназы с IC₅₀ в диапазоне от около 20 мкМ или менее, обычно в диапазоне около 10 мкМ, 1 мкМ, 100 нМ, 10 мМ, 1 мМ или даже более низком. IC₅₀ для aurora-киназы может быть определена в стандартном исследовании in vitro с очищенной aurora-киназой или в функциональном клеточном исследовании. Приемлемое исследование связывания фермента, которое может быть применено для определения уровня активности aurora-киназы, описано в Fox et al., 1998, Protein Sci. 7: 2249-2255. Кемптидная пептидная последовательность LRRASLG (Bochern Ltd., UK) может применяться как субстрат для aurora-киназы A, aurora-киназы B и/или aurora-киназы C, и реакции могут быть проведены при 30°C в растворе, содержащем 100 мМ HEPES (pH 7,5), 10 мМ MgCl₂, 25 мМ NaCl, 1 мМ DTT. IC₅₀ величины могут быть определены с применением компьютерной нелинейной регрессии с коммерчески доступным программным обеспечением (например, Prism 3.0, GraphPed Software, San Diego, CA). Приемлемое функциональное исследование на клетках описано в разделе примеров.

6.5. Применения антипролиферативных соединений

Активные стереоизомерно обогащенные соединения, включая их различные пролекарства, соли, гидраты и/или N-оксидные формы, могут быть применены для ингибирования aurora-киназ, процессов, опосредованных aurora-киназой, и/или клеточной пролиферации в разнообразных контекстах. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка или популяция клеток приводится в контакт с количеством такого соединения, эффективным для ингибирования активности aurora-киназы, процесса, опосредованного aurora-киназой и/или пролиферации клетки или клеточной популяции. При применении для ингибирования клеточной пролиферации соединение может действовать цитотоксично, убивая клетку, или цитостатично, ингибируя пролиферацию без уничтожения клетки.

В некоторых вариантах осуществления способы могут быть использованы на практике in vivo как терапевтический подход по отношению к лечению или профилактике заболеваний или расстройств, опосредованных aurora-киназой, и, в частности, пролиферативных расстройств. Так, в специфическом варианте осуществления стереоизомерно обогащенные соединения, описанные здесь (и различные формы, описанные здесь), могут быть применены для лечения или профилактики пролиферативных расстройств животных, включая человека. Способ, как правило, включает назначение пациенту количества стереоизомерно обогащенного соединения или его пролекарства, соли, гидрата или N-оксида, эффективного для лечения или профилактики расстройства. В одном варианте осуществления пациент представляет собой млекопитающее, включая, без ограничения, корову, лошадь, кошек, собак, грызунов или приматов. В другом варианте осуществления пациент является человеком.

Разнообразные клеточные пролиферативные расстройства могут излечиваться или предотвращаться описанными здесь соединениями. В некоторых вариантах осуществления соединения применяли для лечения различных раков в угнетенных пациентах. Раки обычно классифицируют, основываясь на ткани и клеточном типе, из которого происходят раковые клетки. Карциномы считаются раками, возникающими из клеток эпителия, в то время как саркомы считаются раками, возникающими из соединительных тканей или мускулов. Другие типы рака включают лейкемии, которые возникают из клеток гематопоэза, и раки клеток нервной системы, которые возникают из нервной ткани. Для неинвазивных раков аденомы считаются доброкачественными эпителиальными опухолями с железистой структурой, в то время как хондромы являются доброкачественной опухолью, возникающей из хряща. В настоящем изобретении описанные соединения могут быть применены для лечения пролиферативных расстройств, состоящих из карцином, сарком, лейкемий, опухолей нервных клеток и неинвазивных опухолей.

В специфическом варианте осуществления соединения применяли для лечения солидноопухолевых раков, возникающих из тканей различных типов, включая, без ограничения, раки кости, груди, дыхательных путей, мозга, репродуктивных органов, желудочно-кишечного тракта, мочевых путей, мочевого пузыря, глаза, печени, кожи, головы, шеи, щитовидной железы, паращитовидной железы, почки, поджелудочной железы, крови, яичников, толстой кишки, яичника/простаты и их метастатические формы.

Специфические пролиферативные расстройства включают следующие:

a) пролиферативные расстройства груди включают, без ограничения, инвазивную карциному протоков, инвазивную дольчатую карциному, карциному протоков, карциному долек in situ и метастатический рак груди;

b) пролиферативные расстройства кожи включают, без ограничения, карциному базальных клеток, карциному чешуйчатых клеток, злокачественную меланому и саркому Капоши;

c) пролиферативные расстройства дыхательных путей включают, без ограничения, мелкоклеточную и немелкоклеточную карциному легкого, бронхиальный отек, плевролегочную бластому и злокачественную мезотелиому;

d) пролиферативные расстройства мозга включают, без ограничения, глиому ствола мозга и гипоталамуса, церебеллярную и церебральную астроцитому, медуллобластому, эпендимные опухоли, олигодендроглиальные, менингиомные и нейроэктодермальные и шишковидные опухоли;

e) пролиферативные расстройства мужских репродуктивных органов включают, без ограничения, рак простаты, рак яичка и рак пениса;

f) пролиферативные расстройства женских репродуктивных органов включают, без ограничения, рак матки (эндометриальный), шейки матки, яичников, вагинальный, вульвальный раки, саркому матки, опухоль эмбриональной клетки яичников;

g) пролиферативные расстройства желудочно-кишечного тракта включают, без ограничения, анальный, толстой кишки, колоректальный, пищевода, желчного пузыря, желудка, панкреатический раки, панкреатический рак островковых клеток, ректальный, тонкой кишки и рак слюнной железы;

h) пролиферативные расстройства печени включают, без ограничения, гепатоклеточную карциному, холангиокарциному, смешанную гепатоклеточную холангиокарциному и первичный рак печени;

i) пролиферативные расстройства глаз включают, без ограничения, внутриглазную меланому, ретинобластому и рабдомиосаркому;

j) пролиферативные расстройства и раки головы включают, без ограничения, ларингеальный, подглоточный, носоглоточный, ротоглоточный рак и раки щеки и ротовой полости, плоскоклеточный рак шеи, метастазирующий рак околоносовых пазух;

k) пролиферативные расстройства лимфомы включают, без ограничения, различные лимфомы T-клеток и B-клеток, неходжкинкую лимфому, лимфому кожных T-клеток, болезнь Ходжкина и лимфому центральной нервной системы;

l) лейкемии включают, без ограничения, острую костномозговую лейкемию, острую лимфобластическую лейкемию, хроническую лимфоцитарную лейкемию, хроническую миелогенную лейкемию и волосато-клетчатую лейкемию;

m) пролиферативные расстройства щитовидной железы включают рак щитовидной железы, тимому и злокачественную тимому;

n) саркомы включают, без ограничения, саркомы мягких тканей, остеосаркому, злокачественную фиброзную гистиоцитому, лимфосаркому и рабдомиосаркому.

Понятно, что описания пролиферативных расстройств не ограничены условиями, описанными выше, но включают другие расстройства, характеризуемые неконтролируемым ростом и злокачественностью. Далее, понятно, что пролиферативные расстройства включают различные метастазирующие формы опухолей и типов рака, описанных здесь. Соединения по настоящему изобретению могут быть протестированы на эффективность против описанных здесь расстройств, и установлен терапевтически эффективный режим. Эффективность, как описано ниже, включает ослабление или уменьшение опухоли, уменьшение в скорости клеточной пролиферации или цитостатическое, или цитотоксическое действие на клеточный рост.

6.6. Комбинированные терапии

Описанные здесь стереоизомерно обогащенные соединения могут применяться по отдельности, в комбинации друг с другом, как вспомогательное средство или в сочетании с другими существующими антипролиферативными терапиями. Так, соединения могут быть применены с обычными терапиями рака, такими как ионизирующая радиация в форме γ-лучей и x-лучей, передаваемая извне или изнутри путем имплантации радиоактивных соединений, и как дополнительные к хирургическому удалению опухолей.

В другом аспекте соединения могут быть применены с другими химиотерапевтическими агентами, применимыми для излечиваемого расстройства или состояния. Эти соединения могут назначаться совместно, последовательно, тем же путем назначения или различными путями.

В некоторых вариантах осуществления настоящие соединения применяли с другими антираковыми или цитотоксическими агентами. Различные классы антираковых и антинеопластических соединений включают, без ограничения, алкилаторные агенты, антиметаболиты, винка-алкалоиды, таксаны, антибиотики, ферменты, цитокины, координационные комплексы платины, замещенные мочевины, ингибиторы тирозинкиназ, гормоны и антагонисты гормонов. Типичные алкилаторные агенты включают, в качестве примера и без ограничения, мехлортамин, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан, хлорамбуцил, этиленимины, метилмеламины, алкилсульфонаты (например, бусульфан) и кармустин. Типичные антиметаболиты включают, в качестве примера и без ограничения, аналог фолиевой кислоты метотрексат; аналог пиримидина фторурацил, арабинозид цитозина; аналоги пурина меркаптопурин, тиогуанин и азатиоприн. Типичные винка-алкалоиды включают, в качестве примера и без ограничения, винбластин, винкристин, паклитаксель и колхицин. Типичные антибиотики включают, в качестве примера и без ограничения, актиномицин D, даунорубицин и блеомицин. Типичные ферменты, эффективные в качестве антинеопластических агентов, включают L-аспарагиназу. Типичные координационные соединения включают, в качестве примера и без ограничения, цисплатин и карбоплатин. Типичный гормоны и основанные на гормонах соединения включают, в качестве примера и без ограничения, адренокортикостероиды преднизон и дексаметазон; ингибиторы ароматазы аминоглутетимид, форместан и анастрозол; прогестиновые соединения капроат гидроксипрогестерона, медроксипрогестерон; и антиэстрогеновое соединение тамоксифен.

Эти и другие антираковые соединения, которые могут быть применены, описаны в Merck Index, 13^th Edition (O'Neil M.J. et al., ed.) Merck Publishing Group (2001) и Goodman и Gilmans the Pharmacological Basis of Therapeutics, 10-е издание, Hardman, J.G. и Limbird, L.E., eds., pg. 1381-1287, McGraw Hill (1996), которые включены здесь посредством цитирования.

Дополнительные антипролиферативные соединения, которые могут быть применены в комбинации с описанными здесь стереоизомерно обогащенными соединениями, включают, в качестве примера и без ограничения, антитела, направленные против рецепторов ростовых факторов (например, анти-Her2); антитела активации T-клеток (например, анти-CTLA-4 антитела); и цитокины, такие как интерферон-α и интерферон-y, интерлейкин-2 и GM-CSF.

6.7. Препараты и способы введения

При применении для лечения или профилактики таких заболеваний активные соединения и пролекарства могут быть назначены по отдельности как смеси одного или нескольких активных соединений или в смеси или комбинации с другими агентами, применимыми для лечения таких заболеваний и/или симптомов, связанных с такими заболеваниями. Активные соединения и пролекарства могут также назначаться в смеси или в комбинации с агентами, применимыми для лечения других расстройств или заболеваний, такими как стероиды, мембранные стабилизаторы. Активные соединения или пролекарства могут назначаться как таковые или как фармацевтические композиции, включающие активное соединение или пролекарство.

Фармацевтические композиции, включающие активные соединения (или их пролекарства), могут быть получены традиционными способами смешения, растворения, гранулирования, приготовления драже растиранием в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, захватывания или лиофилизации. Композиции могут быть рецептурированы традиционным способом с применением одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, разбавителей, наполнителей или вспомогательных веществ, которые облегчают переработку активных соединений в препараты, которые могут применяться фармацевтически (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 15^th Ed., Hoover, J.E. ed., Mack Publishing Co. (2003).

Активное соединение или пролекарство может быть рецептурировано в фармацевтических композициях само по себе или в форме гидрата, сольвата, N-оксида или фармацевтически приемлемой соли, как ранее описано. Обычно такие соли являются более растворимыми в водных растворах, чем соответствующие свободные кислоты и основания, но соли, имеющие более низкую растворимость, чем соответствующие свободные кислоты и основания, также могут быть получены.

Фармацевтические композиции могут находиться в форме, пригодной для фактически любого способа введения, включая, например, местный, глазной, оральный, буккальный, системный, назальный, инъекционный, чрескожный, ректальный, вагинальный и т.д., или в форме, пригодной для назначения посредством ингаляции или инфузии.

Для местного назначения активное соединение(я) или пролекарство(а) может быть рецептурировано в виде растворов, гелей, мазей, кремов, суспензий и т.д., как хорошо известно в области техники.

Системные препараты включают те, что предназначены для назначения путем инъекции, например подкожной, внутривенной, внутримышечной, интратекальной или внутрибрюшинной инъекции, так же как те, что предназначены для чрескожного, орального через слизистую или легочного назначения.

Применимые инъецируемые препараты включают стерильные суспензии, растворы или эмульсии активного соединения(й) в водных или масляных носителях. Композиции могут также содержать рецептурирующие агенты, такие как суспендирующий, стабилизирующий и/или диспергирующий агент. Препараты для инъекции могут быть представлены в стандартной дозированной форме, например в ампулах или в мультидозных контейнерах, и могут содержать добавленные консерванты.

Альтернативно, инъецируемый препарат может быть предоставлен в форме порошка для восстановления до применения влагосодержания с приемлемым носителем, включая, без ограничения, стерильную воду, свободную от пирогенов, буфер, раствор декстрозы и т.д. Для этой цели активное соединение(я) может быть высушено посредством любой методики, известной в области техники, такой как лиофилизация, и восстановлено носителем перед применением.

Для введения через слизистую в рецептуре применяли способствующее проникновению вещество, соответствующее преодолеваемому барьеру. Такие способствующее проникновению вещества известны в области техники.

Для орального введения фармацевтические композиции могут находиться в форме, например, ромбов, таблеток или капсул, полученных традиционным путем с фармацевтически приемлемыми наполнителями, такими как связывающие агенты (например, желатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или гидрофосфат кальция); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк или диоксид кремния); дезинтеграторы (например, картофельный крахмал или гликолят крахмалнатрия); или смачивающие агенты (например, лаурилсульфат натрия, лецитин). Таблетки могут быть покрыты способами, хорошо известными в области техники, например, сахарами, пленками или энтеральными покрытиями.

Жидкие препараты для перорального введения могут находиться в форме, например, эликсиров, растворов, сиропов или суспензий, или они могут быть представлены в виде сухого продукта для восстановления до применения водой или другим пригодным носителем. Такие жидкие препараты могут быть получены традиционным путем с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие агенты (например, сорбитольный сироп, производные целлюлозы или гидрированные пищевые жиры); эмульгирующими агентами (например, лецитин или гуммиарабик); неводными носителями (например, миндальное масло, масляные эфиры, этиловый спирт, Кремофор™ или фракционированные растительные масла); и консервантами (например, метил- или пропил-пара-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Препараты могут также, по мере необходимости, содержать буферные соли, консерванты, отдушки, окрашивающие агенты и подсластители.

Препараты для перорального введения могут быть удобно приготовлены, что дает контролируемое выделение активного соединения или пролекарства, как хорошо известно в области техники.

Для трансбуккального введения композиции могут находиться в форме таблеток или ромбов, рецептурированных традиционным способом.

Для ректального и вагинального путей введения активное соединение(я) может быть рецептурировано как растворы (для удерживающих клизм), суппозитории или мази, содержащие традиционные основания суппозитория, такие как масло какао или другие глицериды.

Для назального введения или введения путем ингаляции или вдувания активное соединение(я) или пролекарство(а) может быть легко помещено в форму аэрозольного спрея из упаковки под давлением или распылителя с применением приемлемого пропеллента, например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, фторуглеродов, диоксида углерода или другого пригодного газа. В случае аэрозоля под давлением дозированная форма может быть определена путем установки клапана, высвобождающего отмеренное количество. Капсулы и картриджи для применения в ингаляторе или аппарате для вдувания (например, капсулы и картриджи, включающие желатин) могут быть рецептурированы как содержащие порошкообразную смесь соединения и приемлемого порошкового основания, такого как лактоза или крахмал.

Для глазного введения активное соединение(я) или пролекарство(а) может быть рецептурировано как раствор, эмульсия, суспензия и т.д., приемлемые для назначения к глазу. Разнообразные носители, которые могут быть применены для назначения соединений к глазу, известны в области техники. Специфические неограничивающие примеры описаны в патенте США № 6261547; патенте США № 6197934; патенте США № 6056950; патенте США № 5800807; патенте США № 5776445; патенте США № 5698219; патенте США № 5521222; патенте США № 5403841; патенте США № 5077033; патенте США № 4882150 и патенте США № 4738851.

Для продолжительного выделения активное соединение(я) или пролекарство(а) может быть рецептурировано как выделение из депо для введения путем имплантации или внутримышечной инъекции. Активный ингредиент может быть рецептурирован с приемлемыми полимерными или гидрофобными веществами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами или в виде плохо растворимых производных, например в виде плохо растворимой соли. Альтернативно, могут применяться чрескожные системы доставки, производимые как липкий диск или пластырь, который медленно высвобождает активное соединение(я) для подкожной адсорбции. Для этой цели могут быть применены усилители просачивания для облегчения чрескожного проникновения активного соединения(й). Приемлемые чрескожные пластыри описаны в, например, патенте США № 5407713; патенте США № 5352456; патенте США № 5332213; патенте США № 5336168; патенте США № 5290561; патенте США № 5254346; патенте США № 5164189; патенте США № 5163899; патенте США № 5088977; патенте США № 5087240; патенте США № 5008110 и патенте США № 4921475.

Альтернативно, могут быть применены другие фармацевтические системы доставки. Липосомы и эмульсии являются хорошо известными примерами доставляющих носителей, которые могут быть применены для доставки активного соединения(ий) или пролекарств(а). Могут также использоваться определенные органические растворители, такие как диметилсульфоксид (ДМСО), хотя обычно ценой большей токсичности.

Фармацевтические композиции могут, если желательно, предоставляться в упаковке или дозаторном устройстве, которое может содержать одну или несколько стандартных дозированных форм, содержащих активное соединение(я). Упаковка может, например, включать металл или пластмассовую фольгу, такую как прозрачная упаковка. Упаковка или дозаторное устройство может быть сопровождено инструкциями по использованию.

6.8. Эффективные дозировки

Активное соединение(я), или пролекарство(а), или их композиции будут, как правило, применяться в количестве, эффективном для достижения намеченного результата, например в количестве, эффективном для лечения или профилактики отдельного излечиваемого заболевания. Соединение(я) может быть назначено терапевтически для достижения терапевтического преимущества. Под терапевтическим преимуществом обозначается искоренение или исправление основного излечиваемого расстройства и/или искоренение или исправление одного или нескольких симптомов, связанных с основным расстройством, так что пациент сообщает об улучшении в ощущениях или состоянии несмотря на то, что пациент может все еще страдать от основного расстройства. Терапевтическое преимущество также включает удержание или замедление прогресса заболевания независимо от того, достигнуто ли улучшение.

Количество назначаемого соединения будет зависеть от разнообразных факторов, включая, например, характерные излечиваемые симптомы, способ введения, тяжесть излечиваемых симптомов, возраст и массу пациента, биодоступность отдельного активного соединения и т.д. Определение эффективной дозировки легко осуществимо в пределах возможностей специалистов в данной области.

Эффективные дозировки могут быть оценены сначала из исследований in vitro. Например, начальная дозировка для применения на животных может быть рецептурирована для достижения концентрации активного соединения в циркулирующей крови или сыворотке, которая около или выше IC₅₀ отдельного соединения, как измерено в исследовании in vitro, таком как исследования in vitro, описанные в разделе примеров. Вычисление дозировок для достижения таких концентраций в циркулирующей крови или сыворотке, принимающее во внимание биодоступность отдельного соединения, находится в пределах возможностей специалистов в данной области. В качестве руководства может быть указано Fingl & Woodbury, "General Principles", In: Goodman and Gilman's The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, Chapter 1, pp. 1-46, последнее издание, Pergamon Press, и ссылки, цитированные там.

Начальные дозировки могут также быть оценены из данных in vivo, таких как животные модели. Животные модели, которые могут быть применены для тестирования эффективности соединений для лечения или профилактики различных заболеваний, описанных выше, хорошо известны в области техники. Дозировки количеств будут обычно находиться в диапазоне от приблизительно 0,0001, или 0,001, или 0,01 мг/кг/день до приблизительно 100 мг/кг/день, но могут быть более высокими или более низкими в зависимости от, среди других факторов, активности соединения, его биодоступности, способа введения и различных факторов, обсужденных выше. Дозировка количества и интервал могут быть установлены индивидуально для обеспечения плазменных уровней соединения(й), которые достаточны для поддержания терапевтического или профилактического эффекта. Например, соединения могут быть назначены один раз в неделю, несколько раз в неделю (например, через день), один раз в день или несколько раз в день в зависимости от, среди других факторов, способа введения, характерных излечиваемых симптомов и мнения предписывающего врача. В случаях местного введения или специального поступления, такого как местное наружное введение, эффективная местная концентрация активного соединения(й) может быть не связанной с плазменной концентрацией. Специалисты в данной области будут способны оптимизировать эффективные местные дозировки без непомерного экспериментирования.

Предпочтительно, соединение(я) будет предоставлять терапевтическое или профилактическое преимущество, не вызывая существенной токсичности. Токсичность соединения(ий) может быть определена с применением стандартных фармацевтических методик. Соотношение между токсической и терапевтической дозой (или профилактической), LD₅₀/ED₅₀, представляет собой терапевтический индекс (LD₅₀ представляет собой дозу, летальную для 50% популяции, и ED₅₀ представляет собой дозу, терапевтически эффективную в 50% популяции). Соединения(е), которые проявляют высокие терапевтические индексы, являются предпочтительными.

6.9. Наборы

Описанные здесь соединения и/или пролекарства могут быть подготовлены в форме наборов. В некоторых вариантах осуществления набор предоставляет соединение(я) и реагенты для приготовления композиции для введения. Композиция может быть в сухой или лиофилизированной форме или в растворе, особенно стерильном растворе. Когда композиция находится в сухой форме, реагент может включать фармацевтически приемлемый разбавитель для приготовления жидкого препарата. Набор может содержать устройство для введения или для распределения композиций, включая, без ограничения, шприц, пипетку, чрескожный пластырь или ингалятор.

Наборы могут включать другие терапевтические соединения для применения в сочетании с соединениями, описанными здесь. В некоторых вариантах осуществления терапевтические агенты представляют собой другие антираковые и антинеопластические соединения. Эти соединения могут быть предоставлены в отдельной форме или смешаны с соединениями по настоящему изобретению.

Наборы будут включать соответствующие инструкции по получению и назначению композиции, побочным эффектам композиции и любую другую существенную информацию. Инструкции могут быть в любом приемлемом формате, включая, без ограничения, напечатанный материал, видеопленку, компьютерный диск или оптический диск.

7. ПРИМЕРЫ

Изобретение далее проиллюстрировано со ссылкой на последующие примеры, которые описывают получение описанных здесь различных соединений, способы исследования их биологической активности и способы их применения. Для специалиста в данной области будет очевидно, что многие модификации как в веществах, так и в способах могут быть приобретены на практике без отклонения от объема изобретения.

7.1 Получение 4-(4-метилпиперазин-1-ил)-3-метилнитробензола

Реакция:

Методика: Гомогенную смесь 4-фтор-3-метилнитробензола 1 (20 г, 129 ммоль) и N-метилпиперазина 3 (25,82 г, 258 ммоль) в N-метилпирролидоне (ΝMP) (10 мл) кипятили с обратным холодильником (120°C) в атмосфере Ν₂ в течение 24 час. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь вылили в насыщенный раствор NaCl (100 мл). Полученное твердое вещество облучали ультразвуком в течение приблизительно 30 сек, фильтровали, промывали ледяной водой (2×10 мл) и высушивали в глубоком вакууме для получения 4-(4-метилпиперазин-1-ил)-3-метилнитробензола 5 (28 г, 92%).

¹H ЯМР (CD₃OD): δ 8,02 (м, 2H), 7,13 (д, 1Н, J=9,3 Гц), 3,08 (м, 4H), 2,66 (м, 4H), 2,38 (с, 6H); LCMS: чистота: 99%, МС (m/e): 236 (MH⁺).

7.2 Получение 4-(4-метилпиперазин-1-ил)-3-метиланилина

Реакция:

Методика: Гетерогенную смесь 4-(4-метилпиперазинил)-3-метилнитробензола 5 (20 г, 85 ммоль), 10% Pd/C (1,3 г) в метаноле (1,2 л) гидрировали [H₂] при давлении 40 фунтов на квадратный дюйм в течение 3 час. Палладиевый катализатор фильтровали через целитовый фильтр, промывали метанолом (3×50 мл) и объединенный фильтрат концентрировали, что дало 4-(4-метилпиперазин-1-ил)-3-метиланилин 7 (15 г, 86%).

¹H ЯМР (CD₃OD): δ 6,83 (д, 1Н, J=8,7 Гц), 6,59 (д, 1Н, J=2,7 Гц), 6,54 (дд, 1Н, J=8,4 и 2,7 Гц), 2,84 (т, 4H, J=4,8 Гц), 2,60 (ушир.м, 4H), 2,34 (с, 3H), 2,20 (с, 3H); LCMS: чистота: 99,9%, МС (m/e): 206 (MH⁺).

7.3 Получение 3-аза-4-оксо-трицикло[4.2.1.0(2,5)]нон-7-ена

Реакция:

Методика:

Часть 1: Раствор 2,5-норборнадиена 47 (25,0 мл, 0,246 моль) в CH₂Cl₂ (110 мл, свежая колба) охлаждали в бане лед с NaCl (-10°C). К этому раствору по каплям добавляли раствор CSI (21,4 мл, 0,246 моль) в CH₂Cl₂ (45 мл, свежая колба) с такой скоростью, чтобы поддерживать температуру ниже 5°C (добавление продолжалось приблизительно 1,25 час). По завершении добавления реакционную смесь перемешивали в течение 1 час при 0-5°C и после удаления из охлаждающей бани позволяли отогреться до 20°C. Реакционную смесь гасили водой (60 мл) и интенсивно перемешивали в течение нескольких минут. Органический слой отделяли, промывали насыщенным соляным раствором и высушивали над Na₂SO₄. Концентрирование дало слегка коричневое масло.

Часть 2: Смесь Na₂SO₃ (24,5 г), воды (70 мл) и CH₂Cl₂ (30 мл) охлаждали в бане лед с NaCl. Масло из части 1 разбавляли до 100 мл CH₂Cl₂ и добавляли по каплям к вышеупомянутой смеси с такой скоростью, чтобы поддерживать температуру ниже 15°C (добавление заняло приблизительно 1,75 час). pH реакционной смеси контролировали pH-метром и поддерживали основной (pH 7-10) добавлением 10% NaOH (масс./об.) (по мере необходимости). По завершении добавления реакционную смесь перемешивали в течение 1 час при 5-10°C (конечный pH составил 8,5). Реакционную смесь выливали в разделяющую воронку и отделяли CH₂Cl₂ слой. Эта органическая фаза являлась густой и желатинообразной твердой суспензией. Ее разбавляли водой (приблизительно 400 мл) для того, чтобы сделать раствор более текучим. Водный слой далее экстрагировали CH₂Cl₂ (4×100 мл). (Альтернативно, твердые вещества могут быть выделены из CH₂Cl₂ путем центрифугирования. Твердые вещества могут затем быть разбавлены водой (почти до полного растворения) и экстрагированы CH₂Cl₂. Водный слой далее экстрагировали CH₂Cl₂ (10×100 мл). CH₂Cl₂ экстракты контролировали по TLC на присутствие продукта. Объединенные органические экстракты промывали насыщенным соляным раствором, высушивали над MgSO₄ и фильтровали через целит. Удаление растворителя дало желаемый продукт, рацемический-2-экзо-3-эндо-3-аза-4-оксотрицикло[4.2.1.0(2,5)]нон-7-ен 14r1 в виде белого твердого вещества (20,5 г, 62%).

¹H ЯМР (ДМСО-d₆): δ 8,01 (ушир.с, 1Н), 6,22 (дд, J=3,3 и 5,4 Гц, 1Н), 6,12 (дд, J=3,3 и 5,4 Гц, 1Н), 2,88 (дд, J=1,5 и 3,3 Гц, 1Н), 2,79 (ушир.с, 1Н), 2,74 (ушир.с, 1Н), 1,58 (д, J=9,3 Гц, 1Н) и 1,47 (д, J=9,3 Гц, 1Н).

7.4. Получение 4-оксо-3-трет-бутоксикарбонилазатрицикло[4.2.1.0(2,5)]нон-7-ена

Реакция:

Методика: Гомогенную смесь 3-аза-4-оксо-трицикло[4.2.1.0(2,5)]нон-7-еа (14r1; рацемический 2-экзо-3-экзо; 10,0 г, 74 ммоль), (BOC)₂O (16,1 г, 74 ммоль) и DMAP (1,1 г) в CH₂Cl₂ перемешивали в атмосфере N₂ при комнатной температуре в течение 24 час. К этой реакционной смеси добавляли EtOAc (100 мл), затем H₂O (100 мл) и перемешивали еще в течение 1 час. Органический слой отделяли и промывали H₂O (2×100 мл). Органический слой высушивали над безводным Na₂SO₄ и растворитель удаляли при пониженном давлении, что дало 4-оксо-3-трет-бутоксикарбонилазатрицикло[4.2.1.0(2,5)]нон-7-ен (16r1; рацемический 2-экзо-3-экзо) (16,5 г, 70%);

¹Н ЯМР (ДМСО-d₆): δ 6,29 (дд, J=3,3 и 5,4 Гц, 1Н), 6,19 (дд, J=3,3 и 5,4 Гц, 1Н), 3,77 (д, J=4,5 Гц, 1Н), 3,13 (ушир.с, 1Н), 3,08-3,04 (м, 1Н), 2,93 (ушир.с, 1Н), 1,45 (с, 9H). LCMS: 95%.

7.5. Получение и выделение стереоизомерно чистых диастереомеров из (±)рацемического (2-экзо-3-экзо)-N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[3-метил-4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]-2,4-пиримидиндиамина

Рацемическую смесь соединения, обозначенного в заголовке примера, получали из 2-экзо-3-экзо-рацемата 2-аминобицикло[2.2.1]гепт-5-ен-3-карбоксамид, как указано ниже.

Реакция:

Методика: В круглодонную колбу, снабженную резиновой мембраной и магнитным якорем для перемешивания, помещали рацемический N-BOC-β-лактам 16r1 (2,0 г) при положительном давлении азота. К нему добавляли этилацетат (25 мл), затем 30% водный аммиак (25 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 час. Слой этилацетата отделяли и промывали 5% водным раствором NaHCO₃ (20 мл), высушивали над безводным Na₂SO₄ и растворитель упаривали, что дало 1,10 г рацемического N-BOC карбоксамида 28r1.

Реакция:

Методика: В круглодонную колбу, снабженную подводом N₂ и магнитным якорем для перемешивания, помещали рацемический N-BOC лактам 28r1 (2,00 г, 7,9 ммоль) и затем обрабатывали 20% TFA в CH₂Cl₂ при комнатной температуре в течение 2 час. Полученный раствор концентрировали при пониженном давлении. Следы TFA удаляли в высоком вакууме в течение нескольких часов, что дало интермедиат, TFA соль (30r1, рацемический). Полученную рацемическую TFA соль 30r1 обрабатывали 2,4-дихлор-5-фторпиримидином 10 (1,58 г, 9,51 мМ) в MeOH:H₂O (20:10 мл) в присутствии NaHCO₃ (1,33 г, 15,84 ммоль) при комнатной температуре в течение 48 час. Реакционную смесь разбавляли H₂O (25 мл), насыщали NaCl и экстрагировали EtOAc (3×50 мл). После высушивания над безводным Na₂SO₄ растворитель упаривали и остаток хроматографировали (силикагель, CH₂Cl₂, затем 2-4% 2N NH₃/MeOH в CH₂Cl₂), что дало 1,3 г рацемического моно-SNAr продукта 36r1.

Реакция:

Методика: Запаянную ампулу заполняли рацемическим моно-SNAr продуктом 36r1 (1,1 г, 8 ммоль), анилином 7 (0,90 г, 4,4 ммоль), TFA (0,6 мл) и метанолом (9 мл) и перемешивали при 100°C в течение 24 час. Полученный вязкий гомогенный раствор концентрировали и остаток хроматографировали (силикагель, CH₂Cl₂, затем 2-5% 2 N NH₃/MeOH в CH₂Cl₂), что дало ожидаемое рацемическое производное 2-экзо-3-экзо 2,4-пиримидиндиамина 60r1 (1,12 г; чистота: 95%).

Выделение энантиомеров: диастереомеры разделяли и выделяли из рацемата 60r1 методом препаративной HPLC хроматографии на хиральной колонке Phenomenex Chirex 3020 (250×10 мм колонка), элюирование смесью 35:63:2 (об.:об.:об.) гексан:дихлорметан:метанол при скорости потока 6 мл/мин. Энантиомер, элюирующийся при 9,44 мин, был отнесен как E1 энантиомер, а энантиомер, элюирующийся при 12,74 мин, был отнесен как E2 энантиомер.

7.6. Ферментное получение стереоизомерно чистого (1R,2R,3S,4S)-N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[3-метил-4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]-2,4-пиримидиндиамина с применением Хиразима

7.6.1 Получение стереохимически чистого N-Boc-β-лактама

Реакция:

Методика: Сухую запаянную ампулу, заполненную 4,0 г (17,02 ммоль) 4-оксо-3-трет-бутоксикарбонилаза-трицикло[4.2.1.0(2,5)]нон-7-еном (16r1; рацемический 2-экзо-3-экзо), связанным/иммобилизованным на смоле хиразимом L-2, тип B, c.f. (8,0 г, приобретенный от BioCatalytics Inc., Pasadena, CA) и диизопропиловым эфиром (80 мл), несильно трясли в термостате при 60°C в течение 60 час (ферментное расщепление рацемического N-BOC β-лактама 16r1 анализировали далее методом ¹Н ЯМР. Соотношение было найдено путем интегрирования трет-бутильной группы энантиомерно чистого N-BOC лактама 16a и N-BOC карбоновой кислоты 26b как 1:1). Полученную реакционную смесь фильтровали и твердую смолу промывали диизопропиловым эфиром (2×40 мл). Фильтрат концентрировали, что дало смесь энантиомерно чистого N-BOC-β-лактама 16a и N-BOC карбоновой кислоты 26b (общая масса: 4,0 г).

Реакция:

Методика: В круглодонную колбу, снабженную резиновой мембраной и магнитным якорем для перемешивания, помещали смесь энантиомерно чистого N-BOC-лактама 16a и N-BOC карбоновой кислоты 26b (4,0 г) при положительном давлении азота. К этой смеси добавляли этилацетат (50 мл), затем 25% водный гидроксид аммония (50 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 час. Прохождение реакции контролировали по TLC. Слой этилацетата отделяли и промывали 5% водным раствором NaHCO₃ (40 мл), высушивали над безводным Na₂SO₄ и растворитель упаривали, что дало 2,00 г (выход 7,93 ммоль при теоретическом 8,51 ммоль; выход 93%) желаемого энантиомерно чистого N-BOC карбоксамида 28a с более чем 99% энантиомерным избытком, как определено методом ВЭЖХ на хиральной колонке. Водный раствор, содержащий N-BOC-карбоксилат аммония, при подкислении холодным 1 N HCl с последующей экстракцией CH₂Cl₂ давал N-BOC карбоновую кислоту 26b (1,8 г, выход 7,11 ммоль при теоретическом 8,51 ммоль, 84% выход).

¹H ЯМР (ДМСО-d₆): 7,26 (ушир.с, 1Н), 6,66 (ушир.с, 1Н), 6,13 (м, 2H), 3,59 (т, 1Н, J=6,9 Гц), 2,80 (с, 1Н), 2,54 (с, 1Н), 2,31 (д, 1Н, J=8,1 Гц), 2,00 (д, 1Н, J=8,7 Гц), 1,36 (с, 9H), 1,30 (д, 1Н, J=8,1 Гц); LCMS: МС (m/z): 254 (MH⁺); [a]_D -76,78° (c 1,0, MeOH).

7.6.2 Получение стереоизомерно чистого моно-SNAr продукта

Реакция:

Методика: В круглодонную колбу, снабженную подводом N₂ и магнитным якорем для перемешивания, помещали энантиомерно чистый N-BOC карбоксамид 28a (2,00 г, 7,93 ммоль) и затем обрабатывали 20% TFA в CH₂Cl₂ при комнатной температуре в течение 2 час. Прохождение реакции контролировали по TLC. Полученный раствор концентрировали при пониженном давлении. Следы TFA удаляли в высоком вакууме в течение нескольких часов, что дало энантиомерно чистый интермедиат, TFA соль 30a с количественным выходом.

¹H ЯМР (ДМСО-d₆): 8,10 (ушир.с, 2H), 7,92 (с, 1Н), 7,25 (с, 1Н), 6,29 (м, 1Н), 6,18 (м, 1Н), 4,38 (ушир.с, 1Н), 3,06 (д, 1Н, J=7,2 Гц), 2,97 (с, 1Н), 2,87 (с, 1Н), 2,43 (д, 1Н, J=7,5 Гц), 2,10 (д, 1Н, J=6 Гц), 1,36 (д, 1Н, J=8,7 Гц); LCMS: МС (m/z): 152 (MH⁺).

Полученную TFA соль 30a обрабатывали 2,4-дихлор-5-фторпиримидином 34 (1,58 г, 9,51 ммоль) в MeOH:H₂O (20:10 мл) в присутствии NaHCO₃ (1,33 г, 15,84 ммоль) при комнатной температуре в течение 48 час. Реакционную смесь разбавляли H₂O (25 мл), насыщали NaCl и экстрагировали EtOAc (3×50 мл). После высушивания над безводным Na₂SO₄ растворитель упаривали и остаток хроматографировали (силикагель, CH₂Cl₂, затем 2-4% 2N NH₃/MeOH в CH₂Cl₂), что дало 2,02 г (91%) желаемого моно-SNAr продукта 36a.

¹H ЯМР (ДМСО-d6): 8,25 (д, 1Н, J=7,2 Гц), 8,07 (д, 1Н, J=3,3 Гц), 7,71 (с, 1Н), 7,19 (с, 1Н)₅ 6,29 (м, 2H), 3,99 (т, 1Н, J=7,8 Гц), 2,85 (с, 1Н), 2,75 (с, 1Н), 2,49 (д, 1Н, J=0,9 Гц), 2,11 (д, 1Н, J=8,7 Гц), 1,39 (д, 1Н, J=8,7 Гц); LCMS: чистота: 95%, МС (m/z): 283 (MH⁺). Энантиомерная чистота была более 99%, как определено методом хиральной ВЭЖХ; [a]_D +61,10° (c 1,0, MeOH).

7.6.3 Получение стереоизомерно чистого (1R,2R,3S,4S)-N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[3-метил-4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]-2,4-пиримидиндиамина

Реакция:

Методика: В сухую реакционную колбу, снабженную якорем для перемешивания, обратным холодильником и подводом N₂, помещали энантиомерно чистый моно-SNAr продукт 36a (2,25 г, 8 ммоль), анилин 7 (1,80 г, 8,8 ммоль), TFA (1,12 мл) и изопропанол (18 мл) и полученную реакционную смесь перемешивали при температуре кипения с обратным холодильником в течение 8-10 час. После охлаждения реакционной смеси до комнатной температуры добавляли этилацетат (20 мл). Полученное твердое вещество фильтровали и промывали этилацетатом (2×5 мл), что дало соединение 60a в форме соли с кислотой. Полученное твердое вещество затем трясли с водой и водную смесь доводили до pH 9 водным NaHCO₃, что вызывало выпадение твердого вещества. Твердое вещество фильтровали от смеси, промывали водой и высушивали, что дало 3,3 г (93%) производного 2,4-пиримидиндиамина 60a.

¹H ЯМР (ДМСО-d₆): 8,85 (с, 1Н), 7,83 (д, 1Н, J=2,7 Гц), 7,68 (с, 1Н), 7,47 (с, 2H), 7,36 (д, 1Н, J=7,8 Гц), 7,18 (с, 1Н), 6,89 (д, 1Н, J=8,7 Гц), 6,32 (м, 1Н), 6,25 (м, 1Н), 4,11 (т, 1Н, J=7,8 Гц), 3,32 (с, 3H), 2,86 (с, 1Н), 2,76 (м, 4H), 2,49 (м, 4H), 2,46 (м, 2H), 2,21 (с, 3H), 2,11 (д, 1Н, J=8,4 Гц), 1,39 (д, 1Н, J=9 Гц); LCMS: чистота: 100%, МС (m/z): 452 (M⁺); оптическая чистота >99% ee, как определено методом хиральной ВЭЖХ; [a]_D ^RT +101,2° (c 1,0, MeOH). Найденные хиральные аналитические данные, ¹H ЯМР и LCMS были идентичны энантиомеру, отнесенному как E1.

7.7. Ферментное получение стереоизомерно чистого (1R,2R,3S,4S)-N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[3-метил-4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]-2,4-пиримидиндиамина с применением фермента Новазим 435

7.7.1. Получение стереоизомерно чистого β-лактама

Реакция:

Методика: Иммобилизованную липолазу (8,0 г, от Sigma, порядковый номер L4777), β-лактам 14r1 (рацемический: 2-экзо-3-экзо) (4,0 г, 7,4 ммоль) и воду (0,13 мл, 7,4 ммоль) добавляли к 250 мл диизопропилового эфира в колбе под давлением. Смесь дегазировали азотом в течение 20 мин, колбу запаивали и инкубировали в течение 14 дней при 70°C. Смесь охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через целит и промывали 300 мл диизопропилового эфира. Объединенный фильтрат концентрировали досуха и остаток кристаллизовали из диизопропилового эфира, что дало энантиомерно чистый β-лактам 14a в виде бесцветных иголок (1,22 г, 61%). Энантиомерная чистота была более 99%, как определено методом хиральной ВЭЖХ.

7.7.2. Получение стереоизомерно чистого 2-N-Boc-амино-3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ена

Реакция:

Процедура: Гомогенную смесь энантиомерно чистого 3-аза-4-оксотрицикло[4.2.1.0(2,5)]нон-7-ена 14a (1,1 г, 8,2 ммоль), (BOC)₂O (2,76 г, 12,3 ммоль) и DMAP (100 мг) в CH₂Cl₂ перемешивали в атмосфере N₂ при комнатной температуре в течение 3 час, что дало энантиомерно чистый N-BOC лактам 16a, который применяли далее без выделения. К этой реакционной смеси добавляли 20 мл 25% водного гидроксида аммония и перемешивание продолжали в течение еще 4 час. Добавляли воду и реакционную смесь экстрагировали дихлорметаном (2×50 мл). Объединенную органическую фазу промывали водной HCl (5%), высушивали над сульфатом натрия и упаривали досуха при пониженном давлении, что дало энантиомерно чистый N-BOC карбоксамид 28a (2,51 г) в виде белого твердого вещества, которое применяли на следующей стадии без дальнейшей очистки.

7.7.3. Получение стереоизомерно чистого моно-SNAr продукта, (1R,2R,3S,4S)-N4-(3-Аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-2-хлор-5-фтор-4-аминопиридина

Реакция:

Методика: Энантиомерно чистый N-BOC карбоксамид 28a (2,51 г) растворяли в 10 мл дихлорметана и обрабатывали 10 мл TFA. Смесь перемешивали в течение 1 час при комнатной температуре и концентрировали досуха при пониженном давлении. Остаток суспендировали в толуоле и снова концентрировали досуха. Полученное твердое вещество растворяли в смеси метанол:вода (30 мл:3 мл) и обрабатывали 1,5 г бикарбоната натрия. Добавляли 5-фтор-2,4-дихлорпиримидин 34 (3 г, 17,9 ммоль) и смесь перемешивали в течение 2 дней при комнатной температуре. Летучие продукты удаляли в вакууме и остаток суспендировали в насыщенном соляном растворе. Осадок фильтровали, высушивали и подвергали колоночной хроматографии (силикагель, дихлорметан-метанол, 20:1), что дало желаемый энантиомерно чистый моно-SNAr продукт 36a в виде белого твердого вещества (1,7 г, 74%).

7.7.4. Получение стереоизомерно чистого (1R,2R,3S,4S)-N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[3-метил-4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]-2,4-пиримидиндиамина

Реакция:

Методика: Гомогенную смесь анилина 7 (400 мг, 1,95 ммоль), энантиомерно чистого моно-SNAr продукта 36a (400 мг, 1,41 ммоль) и 0,2 мл TFA в 4 мл изопропанола в запаянной ампуле перемешивали при 100°C в течение 20 час. Смесь охлаждали до комнатной температуры, разбавляли 2 мл диэтилового эфира, полученный осадок фильтровали и промывали диэтиловым эфиром. Оставшиеся твердые вещества растворяли в воде и обрабатывали 25% водным раствором гидроксида аммония. Полученный осадок фильтровали, промывали водой и высушивали, что дало 527 мг (83%) желаемого продукта, производного 2,4-пиримидиндиамина 60a в виде не совсем белого твердого вещества. Чистоту определяли методом LCMS как большую чем 97% и энантиомерную чистоту определяли методом ВЭЖХ на хиральной колонке как большую чем 99%. Хиральные аналитические данные, ¹H ЯМР и LCMS анализы были идентичны с энантиомером, которой был отнесен как E1.

7.8. Получение стереоизомерно чистых соединений с применением (R)-метил-пара-метоксибензиламина в качестве хирального вспомогательного вещества

7.8.1. Получение 2-экзо-3-экзо рацемических аминов

Реакция:

Методика: Гомогенную смесь 4-оксо-3-трет-бутоксикарбонилаза-трицикло[4.2.1.0(2,5)]нон-7-ена (16r1; рацемический-2-экзо-3-экзо) (9,2 г, 40 ммоль) и (R)-метил-4-метоксибензиламина 13 (18, 24 г, 48 ммоль) в сухом ТГФ (75 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 48 час. Реакционную смесь концентрировали, суспендировали в гексане (5 мл), облучали ультразвуком и твердое вещество отделяли путем фильтрования, что дало смесь диастереомеров 20a и 20b (12 мг). Альтернативно, очистка может быть выполнена с применением колоночной хроматографии (силикагель, гексаны, затем с 5%, 10%, 20% и 50% EtOAc в гексанах).

7.8.2. Получение 2-экзо-3-экзо рацемических моно-SNAr продуктов с последующим разделением изомерно чистых соединений путем кристаллизации

Реакция:

Методика: Гетерогенную смесь диастереомеров 20a и 20b (6,0 г, 17 ммоль), TFA (20 мл) в CH₂Cl₂ перемешивали при комнатной температуре в течение 2 час. Для контроля прохождения реакции применяли TLC. Конечную реакционную смесь концентрировали досуха и высушивали в высоком вакууме в течение нескольких часов, что дало диастереоизомерную смесь интермедиатов 22a и 22b. Эту смесь затем вводили в реакцию с 2,4-дихлор-5-фторпиримидином 34 (3,4 г, 20 ммоль) в присутствии NaHCO₃ (5,7 г, 68 ммоль) в смеси MeOH:H₂O (по 50 мл каждого) при комнатной температуре в течение 24 час. Реакционную смесь затем разбавляли водой, насыщенной NaCl (50 мл) и экстрагировали CH₂Cl₂. После высушивания над безводным Na₂SO₄ с последующим удалением растворителя при пониженном давлении экстракт приводил к остатку, который хроматографировали (силикагель, CH₂Cl₂, затем 2% 2 N NH₃/MeOH в CH₂Cl₂). Хроматографическая очистка приводила к смеси диастереоизомеров 38a и 38b (4,0 г) (отношение 1:1 может быть установлено четким разделением на обращенно-фазной LCMS). Полученные 4,0 г после кристаллизации с применением EtOAc:гексан (30:150 мл; об./об.) давали кристаллическое вещество интермедиата 38a, структуру кристалла которого подтверждали методом рентгеноструктурного анализа; химическая чистота: 96% и % de: 96%. [a]_D -36,7° (c, 0,18 MeOH). Маточник, содержащий другой изомер, который был приписан диастереоизомеру 38b, имел меньшую % de (70-80%).

7.8.3. Получение стереоизомерно чистого продукта

с применением хирального вспомогательного вещества

Реакция:

Методика: Смесь диастереоизомера 38a (1,42 г, 3,4 ммоль), анилина 7 (0,834 г, 4,0 ммоль) и TFA (700 мг) в MeOH (10 мл) нагревали в запаянной ампуле при 100°C в течение 24 час. Полученный остаток хроматографировали (силикагель, CH₂Cl₂, затем 2% 2 N NH₃/MeOH в CH₂Cl₂), что дало продукт 40a в виде бесцветного твердого вещества, химическая чистота 96%.

7.8.4. Расщепление хирального вспомогательного вещества

Расщепление хирального вспомогательного вещества из 40a было определено как затруднительное, поэтому расщепление хирального вспомогательного вещества из промежуточных соединений 38a и 38b с последующей SNAr-реакцией с анилином 7 проводилось, как описано ниже.

7.8.5. Расщепление хирального вспомогательного вещества из стереоизомерно чистого интермедиата 38a и получение стереоизомерно чистого (1R,2R,3S,4S)-N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[3-метил-4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]-2,4-пиримидиндиамина

Реакция:

Методика: В реакцию с DDQ (3 эквивалента) вводился моно-SNAr продукт с хиральным вспомогательным фрагментом 38a в CH₂Cl₂:H₂O при комнатной температуре для получения желаемого моно-SNAr продукта 36a. Моно-SNAr продукт очищали колоночной хроматографией и определили как идентичный соединению 36a, полученному ферментативным путем, что было подтверждено методом ВЭЖХ на хиральной колонке, LCMS и ¹H ЯМР. Далее, реакция моно-SNAr продукта 36a с анилином 7 в MeOH:TFA при 100°C в запаянной ампуле в течение 24 час давала желаемый продукт 60a. Его очищали колоночной хроматографией и анализировали методами ¹H ЯМР, LCMS и ВЭЖХ на хиральной колонке. ВЭЖХ на хиральной колонке, LCMS и ¹H ЯМР анализы показали, что данные для продукта 60a находятся в соответствии с энантиомером, обозначенным как E1.

7.8.6. Расщепление хирального вспомогательного вещества из интермедиата 38b и получение стереоизомерно чистого (1S,2S,3R,4R)-N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[3-метил-4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]-2,4-пиримидиндиамина

Реакция:

Методика: Моно-SNAr продукт 38b вводили в реакцию с DDQ (3 эквивалента) в CH₂Cl₂:Η₂O при комнатной температуре для получения желаемого моно-SNAr продукта 36b (после расщепления хирального вспомогательного вещества). Моно-SNAr продукт очищали колоночной хроматографией и было установлено, что это диастереоизомер, отличный от того, что был получен ферментативным путем, и это подтверждали методом ВЭЖХ на хиральной колонке. Далее, реакция моно-SNAr продукта 36b с анилином 7 в MeOH:TFA при 100°C в запаянной ампуле в течение 24 час давала желаемый продукт 60b. Его очищали колоночной хроматографией и катализировали методами ¹H ЯМР, LCMS и ВЭЖХ на хиральной колонке. ВЭЖХ на хиральной колонке, LCMS и ¹H ЯМР анализы показали, что данные для продукта 60b идентичны с энантиомером, обозначенным как E2, [a]_D ^RT -102,00° (c, 1,0 MeOH).

7.9. Получение хлористоводородных солей

Соли с HCl рацемата 60r1 и стереоизомерно чистого 60a были получены, как описано ниже.

7.9.1. Получение хлористоводородной соли рацемического N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[3-метил-4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]-2,4-пиримидиндиамина

К раствору 2-экзо-3-экзо рацемического N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[3-метил-4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]-2,4-пиримидиндиамина (60r1) (0,140 г, 0,3 ммоль) в MeOH (3 мл) при 0°C по каплям добавляли HCl (4 M, диоксан, 0,170 мл, 0,681 ммоль) и затем перемешивали при 0°C в течение 1 час и комнатной температуре в течение 15 мин. Прозрачный гомогенный раствор фильтровали, концентрировали и повторно растворяли в EtOH. К этанольному раствору добавляли этилацетат для осаждения желаемого продукта, который выделяли, что дало бис-хлористоводородную соль рацемического 2-экзо-3-экзо N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[3-метил-4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]-2,4-пиримидиндиамина (соединение 60r1·2HCl). LCMS: чистота: 98%; МС (m/e): 453 (MH⁺).

7.9.2. Получение хлористоводородной соли стереоизомерно чистого (1R,2R,3S,4S)-N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[3-метил-4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]-2,4-пиримидиндиамина

В способе, подобном вышеописанным, взаимодействие 2 эквивалентов HCl (4 M, диоксан) с стереоизомерно чистым (1R,2R,3S,4S)-N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[3-метил-4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]-2,4-пиримидиндиамином (60a) дало бис-хлористоводородную соль стереоизомерно чистого (1R,2R,3S,4S)-N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[3-метил-4-(4-метилпиперазин-1-ил)фенил]-2,4-пиримидиндиамина (соединение 60a·2HCl). LCMS: чистота: 97%; МС (m/e): 453 (MH⁺); [a]_D +46,3° (c, 0,04 MeOH).

7.10. Получение (1R,2R,3S,4S)N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[3-(l,3-оксазол-2-ил)фенил]-2,4-пиримидиндиамина

(1R,2R,3S,4S)-N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[3-(l,3-оксазол-2-ил)фенил]-2,4-пиримидиндиамин (соединение 90a) получали, как описано выше.

¹Η ЯМР (ДМСО-d₆): 9,36 (с, 1Н), 8,48 (с, 1Н), 8,14 (с, 1Н), 9,92 (д, 1Н, J=3 Гц), 7,79 (д, 1Н, J=7,8 Гц), 7,68 (с, 1Н), 7,42 (м, 4H), 7,18 (с, 1Н), 6,29 (м, 1Н), 6,13 (м, 1Н), 4,21 (т, 1Н, J=4,8 Гц), 2,86 (с, 1Н), 2,77 (с, 1Н), 2,55 (д, 1Н, J=8,1 Гц), 2,14 (д, 1Н, J=8,4 Гц), 1,39 (д, 1Н, J=8,7 Гц); LCMS: чистота: 98%, МС (m/e): 407 (MH⁺).

7.11. Ингибирование клеточной пролиферации in vitro

Соединения 60r1, 60r2, 60r1·2HCl, 60a, 60b и 60a·2HCl тестировали против разнообразных типов опухолевых клеток на их способность к ингибированию пролиферации с применением стандартных антипролиферативных исследований in vitro. Различные тестированные клеточные линии включали: A549 (карцинома легкого); ASPC-1 (аденокарцинома поджелудочной железы); BXPC-3 (панкреатическая аденокарцинома); CaOV-3 (аденокарцинома яичников); COLO 205 (колоректальная аденокарцинома); DU145 (карцинома простаты); ES-2 (карцинома паренхиматозной клетки яичников); H1299 (немелкоклеточная карцинома легкого); H1155 (немелкоклеточная карцинома легкого); H460 (крупноклеточная карцинома легкого); HELA (аденокарцинома шейки матки); HL160 (промиелобластная промиелоцитная лейкемия); K562 (хроническая миелогенная лейкемия костного мозга); L1210 (мышиная лимфоцитарная лейкемия); MiaPaCa-2 (панкреатическая карцинома); MOLT4 (T-лимфобластная острая лимфобластическая лейкемия); OVCAR-3 (аденокарцинома яичников); MOLT3 (T-лимфобластная острая лимфобластическая лейкемия); OVCAR-8 (карцинома яичников); PC3 (аденокарцинома простаты); SK-OV-3 (аденокарцинома яичников); SU86.86 (панкреатическая карцинома); SW620 (колоректальная аденокарцинома); THP-1 (моноцитная острая моноцитарная лейкемия); TOV-21G (карцинома паренхиматозной клетки яичников); U2OS (костная остеосаркома) и U937 (гистиоцитарная лимфома).

Полученные для соединений IC₅₀ величины представлены в таблице 2 ниже. В таблице 2 "+" обозначает IC₅₀ величину ≤1 мкМ, "++" обозначает IC₅₀-величину ≤20 нМ, "+++" обозначает IC₅₀ величину ≤10 нМ и "-" обозначает IC₅₀ величину >1 мкМ. Пустое пространство указывает на то, что соединение не тестировали против специфической клеточной линии.

7.12. Ингибирование aurora-киназ в функциональных клеточных исследованиях

Соединения 60a и 60b тестировали на их способность ингибировать aurora-киназу B в функциональном клеточном исследовании, включающем фосфорилирование его субстрата, гистона H3. Для исследования A549 клетки высевали в лунки микротитровальной тарелки (5000 клеток/лунку в 100 мкл среды F12K) ближе к полудню дня 1. Клетки росли в течение ночи (37°C, 5% CO₂). На день 2 50 мкл нокодазола (1 мкМ в среде) добавляли к каждой лунке, обеспечивая конечную концентрацию 333 нМ. Клетки росли в течение еще 18 час в тех же условиях.

На день 3 в лунки добавляли 50 мкл аликвоты различных концентраций тестовых соединений. Тестовые соединения готовили путем двукратного последовательного разбавления 2 мМ исходного раствора (в ДМСО). Разбавленные соединения в ДМСО далее разбавляли 1:50 со средой, которая образует конечный раствор, содержащий тестовое соединение 4X, 98% среды и 2% ДМСО. После инкубирования среду и тестовое соединение отмывали и клетки фиксировали 2% параформальдегидом (в буферном фосфатном физиологическом растворе "DPBS" по Дульбекко; 25 мкл на лунку; >20 мм инкубирование). Фиксированные клетки промывали один раз DPBS (200 мкл/лунку), окрашивали фосфогистоном H3 (Cell Signaling Technology; 1:500 в DPBS, 10% нормальная козлиная сыворотка "NGS", 0,05% Triton X-100; 1-2 час при комнатной температуре) и промывали дважды DPBS (200 мкл/лунку). Клетки затем окрашивали вторичными антителами, меченными флуоресцентными красителями (вторичные ослиные антимышиные антитела AlexFluor 488 (Invitrogen Molecular Probes; 1:2000) и DAPI (1:15000, исходный раствор 1 мг/мл) в течение 1 час при комнатной температуре, промывали 3 раза DPBS (200 мкл/лунку) и хранили в DPBS (100 мкл/лунку) при 4°C до тех пор, пока не были готовы для анализа.

Для всех коллекций данных применяли инвертированный флуоресцентный микроскоп Zeiss Axiovert S100 с объективом Plan-NEOFLUAR 10x, источниками света Hamamatsu Lightningcure 200 Mercury-Xenon и четырехполосным фильтром Omega Optical XF57. Система была снабжена моторизированной платформой Ludl Mac2000 с X/Y/Z контролем, сменными светофильтрами Ludl, манипулятором Zymark Twister и цифровой камерой Quantix от Roper Scientific. Все оборудование контролировали с ImagePro 4.5 с модулем ScopePro/StagePro 4.1 (Media Cybernetics) на ПК под управлением Win2000. Визуальные основные шрифты были написаны для ImagePro для автоматического контроля оборудования и коллекции изображений. Фокусировку выполняли со стандартной программой автофокусировки, содержащейся в StagePro, которая применяет максимальный местный контраст для определения лучшего плана фокуса от Z серий, захваченных один раз от каждой лунки. Когда один раз правильный фокус был достигнут, изображения захватывали в 3×3 сетке делений соседних изображений следующих к, но не включая, позиции фокусировки. Изображения захватывали и анализировали в 12-битном формате с применением сегментационной и морфологической процедур, содержащихся в пакете программного обеспечения ImagePro. Идентифицированные ядра подсчитывали и пиксельные данные для каждой клетки в соответствии с экспериментальными условиями сохраняли в базе данных с применением MySQL 4.0.14. Последующий анализ экспериментальных результатов и построение графика выполняли с применением Matlab 6.5.

Для анализа фосфогистона H3 данные конвертировали в файлы Facs и анализировали с применением FlowJo. Процент фосфо-H3 клеток распечатывали для концентрации каждого соединения для определения EC₅₀ ингибирования aurora-B.

Результаты. В этом исследовании соединение 60a ингибировало aurora-киназу B с IC₅₀ около 7 нМ. Резко отличаясь, IC₅₀ для его энантиомера, соединения 60b, составляло 2,49 мкМ, приблизительно в 350 раз больше.

7.13. Фармакокинетика соединения E1 на обезьянах

Соединение 60a вводили обезьянам внутривенно (1 мг/кг в физиологическом растворе) и перорально (5 мг/кг в физиологическом растворе) и плазменные концентрации контролировали более одного раза. При внутривенном введении плазменная концентрация соединения оставалась выше IC₅₀ 7 нМ в течение 11 час после введения; при введении перорально плазменная концентрация соединения сохранялась выше IC₅₀ в течение более 20 час.

7.14. Соединение 60a сокращает опухоли in vivo

Соединение 60a·2HCl тестировали на его способность уменьшать A549 и Colo205 опухоли в стандартной ксенотрансплантатной терапевтической модели на SCID-мышах и Colo205 и MiaPaCa опухолей в стандартной ксенотрансплантатной регрессионной модели на SCID-мышах. Когда возникали заметные опухоли и достигали предварительно выбранного объема (приблизительно 100 мм³ для модели лечения; >300 мм³ для регрессионной модели), мышам вводили тестовые соединения в количествах согласно режимам дозировки, представленным ниже в таблице 3 (протокол лечения) и таблице 4 (протокол регрессии).

Результаты. Ингибирующие эффекты соединения 60a·2HCl на рост опухоли Colo205 в модели лечения представлены на фиг.1 и 2. Результаты дневного режима дозирования представлены на фиг.1; результаты импульсных режимов дозирования - на фиг.2. Оба режима дозирования приводят к значительным (p<0,050) уменьшениям в скорости роста опухоли по сравнению с контролем носителя для всех тестированных уровней дозировки. Опухоли А549 менее чувствительны к лечению, приводя к приблизительно 40% восстановлению в среднем объеме опухоли, при следовании режиму дозирования 5 дней прием/2 дня без приема и уровне дозы 10 мг/кг qd (p>0,05).

Ингибирующие эффекты соединения 60a·2HCl на рост опухоли Colo205 в регрессионной модели представлены на фиг.3. Эффекты соединения 60a·2HCl на опухолях MiaPaCa в регрессионной модели представлены на фиг.4. Значительные уменьшения в скорости роста опухоли наблюдали с обоими линиями опухоли. Эти уменьшения не зависели от способа введения. Кроме того, уменьшения, наблюдаемые в опухолях MiaPaCa, были подобны тем, которые наблюдаются для таксола (см. фиг.4).

Хотя предшествующее изобретение описано в некоторых деталях для облегчения понимания, будет очевидно, что определенные изменения и модификации могут быть проведены на практике в пределах объема прилагаемой формулы изобретения. Согласно этому описанные варианты осуществления обсуждаются как иллюстративные и неограничивающие, и изобретение не ограничено данными здесь деталями, но может быть модифицировано в пределах объема и эквивалентов прилагаемой формулы изобретения.

Все литературные и патентные ссылки, цитированные в заявке, включены в заявку посредством цитирования для всех целей.

Изобретение относится к новым соединениям структурной формулы (I) в виде (2-экзо-3-экзо)цис-рацемата или диастереомера структурной формулы (Ia) и их фармацевтически приемлемым солям, обладающим антипролиферативной активностью и свойствами ингибитора активности aurora-киназы. В формулах (I) и (Ia)

каждый R¹ является водородом; каждый R² является независимо выбранным из группы, состоящей из атома водорода, низшего алкила и ; каждый R³ является независимо выбранным из группы, состоящей из атома водорода, низшего алкила и ; каждый R⁴ является независимо выбранным из группы, состоящей из атома водорода и низшего алкила; R⁵ представляет собой атом галогена. Изобретение относится также к фармацевтической композиции, способам ингибирования пролиферации опухолевой клетки, активности aurora-киназы, процесса, опосредованного aurora-киназой, способу лечения заболевания, опосредованного aurora-киназой, и к использованию указанных соединений для приготовления лекарственного средства. 7 н. и 36 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 табл.

1. Соединение структурной формулы (I):

или его фармацевтически приемлемая соль, в виде (2-экзо-3-экзо)цис-рацемата или диастереомера структурной формулы (Ia):

где каждый R¹ является водородом;
каждый R² является независимо выбранным из группы, состоящей из атома водорода, низшего алкила и ;
каждый R³ является независимо выбранным из группы, состоящей из атома водорода, низшего алкила и ;
каждый R⁴ является независимо выбранным из группы, состоящей из атома водорода и низшего алкила;
R⁵ представляет собой атом галогена.

2. Соединение по п.1, представляющее собой (2-экзо-3-экзо)цис-рацемат.

3. Соединение по п.1, в котором R⁵ представляет собой атом фтора.

4. Соединение по п.3, в котором R² означает ; R³ означает атома водорода или низший алкил.

5. Соединение по п.4, в котором R³ означает атом водорода или метил.

6. Соединение по п.4, в котором R⁴ означает метил.

7. Соединение по п.3, в котором R² представляет собой атом водорода; и R³ означает .

8. Соединение по п.3, в котором R² представляет собой атом водорода; и R³ означает атом водорода или метил.

9. Соединение по п.8, в котором R³ означает метил.

10. Соединение по п.3, в котором R³ означает атом водорода или низший алкил.

11. Соединение по п.10, в котором R³ означает метил; и R⁴ означает метил.

12. Соединение по п.1, в котором R³ означает атом водорода или метил; и R⁴ означает метил.

13. Соединение по п.12, в котором R² означает ; R³ означает атома водорода.

14. Соединение по п.12, в котором R² означает ; R³ выбирают из группы, состоящей из атома водорода и метила, и R⁴ означает метил.

15. Соединение по п.14, в котором R³ означает метил.

16. Соединение по п.1, которое является, по существу, чистым (1R,2R,3S,4S)-N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[(3-метил-4-(4-метилпиперазин-1-ил)]фенил-2,4-пиримидиндиамином.

17. Соединение по п.1, которое является чистым (1R,2R,3S,4S)-N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[(3-метил-4-(4-метилпиперазин-1-ил)]фенил-2,4-пиримидиндиамином.

18. Фармацевтическая композиция, обладающая антипролиферативной активностью, включающая соединение по любому из пп.1-17 и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель и/или разбавитель.

19. Композиция по п.18, в которой соединение представляет собой (1R,2R,3S,4S)-N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[(3-метил-4-(4-метилпиперазин-1-ил)]фенил-2,4-пиримидиндиамин.

20. Способ ингибирования пролиферации опухолевой клетки, включающий контактирование клетки с соединением по любому из пп.1-17 или с композицией по п.18, взятыми в количестве, эффективном для ингибирования ее пролиферации.

21. Способ по п.20, в котором опухолевая клетка представляет собой опухолевую клетку легкого, толстой кишки, груди, желудка, яичников, шейки матки, меланомы, почки, простаты, лимфомы, нейробластомы, поджелудочной железы, мочевого пузыря или печени.

22. Способ ингибирования активности aurora-киназы, включающий контактирование aurora-киназы с соединением по п.1, взятым в количестве, эффективном для ингибирования ее активности.

23. Способ по п.22, который проводится in vitro с очищенной или частично очищенной aurora-киназой.

24. Способ по п.22, который проводится in vitro с клеткой, экспрессирующей aurora-киназу.

25. Способ ингибирования процесса, опосредованного aurora-киназой, включающий контактирование клетки, экспрессирующей aurora-киназу, с соединением по п.1, взятым в количестве, эффективном для ингибирования процесса, опосредованного aurora-киназой.

26. Способ по п.25, в котором ингибируемый процесс, опосредованный aurora-киназой, представляет собой митоз.

27. Способ по п.25, в котором клетка представляет собой опухолевую клетку.

28. Способ по п.25, в котором клетка приводится в контакт с соединением в концентрации, которая равна или больше, чем его IC₅₀, которая измерена в исследовании in vitro.

29. Способ лечения заболевания, опосредованного aurora-киназой, включающий введение эффективного для лечения заболевания количества соединения по любому из пп.1-17 или композиции по п.18.

30. Способ по п.29, в котором заболевание, опосредованное aurora-киназой, представляет собой пролиферативное заболевание.

31. Способ по п.30, в котором пролиферативное заболевание представляет собой рак.

32. Способ по п.31, в котором рак представляет собой метастазирующую опухоль.

33. Способ по п.32, в котором рак выбран из рака легкого, рака груди, рака желудка, рака яичников, рака шейки матки, меланомы, рака почки, рака простаты, лимфомы, нейробластомы, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря и рака печени.

34. Способ по п.29, в котором соединение вводят в форме фармацевтической композиции.

35. Способ по п.29, в котором соединение вводят перорально.

36. Способ по п.29, в котором соединение вводят внутривенно.

37. Способ по п.29, в котором соединение вводят в количестве, эффективном для достижения концентрации в сыворотке, которая составляет около или выше IC₅₀ соединения, которая измерена в исследовании in vitro.

38. Применение соединения по любому из пп.1-17 для приготовления лекарственного средства для лечения заболевания, опосредованного aurora-киназой.

39. Применение по п.38, в котором заболевание, опосредованное aurora-киназой, представляет собой пролиферативное заболевание.

40. Применение по п.39, в котором пролиферативное заболевание представляет собой рак.

41. Применение по п.40, в котором рак представляет собой метастазирующую опухоль.

42. Применение по п.41, в котором рак выбран из рака легкого, рака груди, рака желудка, рака яичников, рака шейки матки, меланомы, рака почки, рака простаты, лейкемии, лимфомы, нейробластомы, рака поджелудочной железы, рака мочевого пузыря и рака печени.

43. Применение по любому из пп.38-42, в котором соединение представляет собой (1R,2R,3S,4S)-N4-(3-аминокарбонилбицикло[2.2.1]гепт-5-ен-2-ил)-5-фтор-N2-[(3-метил-4-(4-метилпиперазин-1-ил)]фенил-2,4-пиримидиндиамин.