ПРИМЕНЕНИЕ ИНГИБИТОРОВ ПУТИ КОМПЛЕМЕНТА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЛАЗНЫХ БОЛЕЗНЕЙ Российский патент 2011 года по МПК A61K39/395 A61P27/02 

Это изобретение относится к ингибированию пути комплемента, в частности к ингибированию Фактора D, у пациентов, страдающих от связанных с глазными болезнями состояний и от болезней, связанных с активацией комплемента, таких как возрастная макулярная дегенерация, диабетическая ретинопатия.

УРОВЕНЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Макулярная дегенерация представляет собой клинический термин, который применяется для описания семейства заболеваний, которые характеризуются прогрессирующей потерей центрального зрения, связанной с аномалиями мембраны Бруха, хориоида, невральной сетчатки и/или ретинального пигментного эпителия. В центре сетчатки находится желтое пятно, диаметр которого составляет примерно 1/3-1/2 см. Пятно обеспечивает острое зрение, в особенности в центре (в ямке), потому что колбочки сетчатки имеют более высокую плотность. Кровеносные сосуды, клетки ганглия, внутренний нуклеарный слой и клетки и плексиформные слои повернуты в одну сторону (в отличие от оставшихся, расположенных выше), предоставляя таким образом свету более прямого пути к колбочкам сетчатки. Под сетчаткой располагаются хориоид, набор кровеносных сосудов, вкрапленных в фиброзную ткань, и пигментный эпителий (PE), который покрывает хориоидный слой. Хориоидные кровеносные сосуды обеспечивают питанием сетчатку (в особенности, ее зрительные клетки). Хориоид и PE обнаружены в задней области глаза.

Ретинальные пигментные эпителиальные клетки (RPE), которые составляют PE, продуцируют, хранят и транспортируют множество факторов, которые ответственны за нормальное функционирование и существование фоторецепторов. Эти мультифункциональные клетки транспортируют метаболиты к фоторецепторам из кровотока через хориокапилляры глаза. RPE клетки также функционируют в качестве макрофагов, фагоцитирующих концы внешних сегментов палочек и колбочек сетчатки, которые продуцируются при нормальном течении клеточной физиологии. Разнообразные ионы, белки и вода передвигаются между RPE клетками и внутренним фоторецепторным пространством, и эти молекулы, в конечном счете, воздействуют на метаболизм и выживаемость фоторецепторов.

Возрастная макулярная дегенерация (AMD), самая распространенная макулярная дегенерация, ассоциирована с прогрессирующей потерей остроты зрения в центральном участке поля зрения, изменениями хроматического зрения и аномальной адаптацией к темноте и чувствительностью. Два принципиальных клинических проявления AMD были описаны как сухая, или атрофическая, форма и влажная, или экссудативная, форма. Сухая форма ассоциирована с атрофической клеточной смертью центральной сетчатки или макулы, которая требуется для тонкого зрения, применяемого для таких активностей, как чтение, вождение или распознавание лиц. Примерно у 10-20% таких пациентов с сухой формой AMD заболевание прогрессирует до второй формы AMD, известной как влажная форма AMD. Влажная (неоваскулярная/экссудативная) форма AMD вызвана аномальным ростом кровеносных сосудов перед сетчаткой под макулой и васкулярным просачиванием, приводящим в результате к смещению сетчатки, кровоизлиянию и образованию рубца. Это приводит в результате к ухудшению зрения на период времени, составляющий месяцы и годы. Однако пациенты могут страдать быстрой потерей зрения. Все случаи влажной формы AMD происходят из развитой сухой формы AMD. Влажная форма является причиной 85% случаев слепоты из-за AMD. При влажной форме AMD, поскольку через кровеносные сосуды просачивается жидкость и кровь, образуется рубцовая ткань, которая разрушает центральную сетчатку. Наиболее значительными факторами риска для развития обеих форм заболевания являются возраст и отложение друз, аномальных внеклеточных осадков за ретинальным пигментным эпителием. Друзы вызывают латеральное растяжение монослоя RPE и физическое смещение RPE от его непосредственной системы кровоснабжения, хориокапилляров. Это смещение создает физический барьер, который может воспрепятствовать нормальной диффузии метаболитов и отходов между хориокапиллярами и сетчаткой. Друзы являются признаком осадков, ассоциированных с AMD. Биогенез друз включает дисфункцию RPE, ухудшая гидролиз внешних сегментов фоторецептора и последовательное накопление дебриса. Друзы содержат активаторы комплемента, ингибиторы, фрагменты комплемента, специфичные для активации, и компоненты терминального пути комплемента, включая мембраноатакующий комплекс (MAC или C5b-9), наличие которых предполагает, что фокальная концентрация этих веществ может произвести мощный хемотаксический стимул для лейкоцитов, действующих через каскад комплемента (Killingsworth, et al., (2001) Exp Eye Res 73, 887-96). Недавние исследования включали локальное воспаление и активацию каскада комплемента в стадии их образования (Bok D. Proc Natl Acad Sci (USA). 2005; 102: 7053-4; Hageman GS, et al. Prog Retin Eye Res. 2001; 20: 705-32; Anderson DH, et al. Am J Ophthalmol. 2002; 134: 411-31. Johnson LV, et al. Exp Eye Res. 2001; 73: 887-96). Влажная форма AMD ассоциирована с хориоидальной неоваскуляризацией (CNV) и является сложным биологическим процессом. Патогенез образования нового хориоидального сосуда плохо изучен, но считается, что такие факторы, как воспаление, ишемия и локальное продуцирование ангиогенных факторов, являются важными. Хотя предполагалось, что воспаление играет роль, при этом роль комплемента не выяснялась. Предварительное исследование CNV на мышиной модели показало, что CNV вызвано активацией комплемента (Bora PS, J Immunol. 2005; 174: 491-497). Система комплемента является ключевым компонентом врожденного иммунитета против микробной инфекции и включает группу белков, которые обычно присутствуют в сыворотке в не активном состоянии. Эти белки организованы в три пути активации: классический, лектиновый и альтернативный (V.M. Holers, In Clinical Immunology: Principles and Practice, ed. R.R. Rich, Mosby Press; 1996, 363-391). Молекулы на поверхности микробов могут активировать эти пути, что приводит в результате к образованию протеазных комплексов, известных как C3-конвертазы. Классический путь представляет собой кальций/магний-зависимый каскад, который обычно активируется при образовании комплексов антиген/антитело. Он также может активироваться зависимым от антитела образом с помощью связывания C-реакционно-способного белка, образующего комплекс с лигандом и с помощью большого количества патогенов, включающих грам-отрицательные бактерии. Альтернативный путь представляет собой магний-зависимый каскад, который активируется с помощью вклада и активации C3 на определенных восприимчивых поверхностях (например, полисахаридах клеточной стенки дрожжей и бактерий, и определенных биополимерных веществах).

Альтернативный путь принимает участие в амплификации активности обоих путей - классического и лектинового (Suankratay, C., ibid; Farries, T.C. et al., MoI. Immunol. 27: 1155-1161(1990)). Активация пути комплемента генерирует биологически активные фрагменты белков комплемента, например C3a, C4a и C5a анафилатоксины и C5b-9 мембраноатакующие комплексы (MAC), которые опосредуют воспалительные реакции посредством вовлечения хемотаксиса лейкоцитов, активации макрофагов, нейтрофилов, тромбоцитов, тучных клеток и эндотелиальных клеток посредством увеличенной васкулярной проницаемости, цитолизиса и повреждения ткани.

Фактор D может быть подходящей мишенью для ингибирования этой амплификации путей комплемента, потому что его концентрация в плазме человека очень низкая (1,8 мкг/мл), и было показано, что он является лимитирующим ферментом активации альтернативного пути комплемента (P.H. Lesavre and HJ. Mϋller-Eberhard. J. Exp.Med., 1978; 148: 1498-1510; J.E. Volanakis et al., New Eng. J. Med., 1985; 312: 395-401). Было продемонстрировано с применением моделей на животных и в ex vivo исследованиях, что ингибирование активации комплемента является эффективным при лечении симптомов некоторых болезней, например красной волчанки и гломерулонефрита (Y. Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci.; 1996, 93: 8563-8568).

С применением анализа полиморфизма отдельных нуклеотидов (SNP) у AMD пациентов было обнаружено, что генетический вариант Фактора H (Y402H) является с высокой степенью ассоциированным с увеличенной заболеваемостью AMD (Zareparsi S, Branham KEH, Li M, et al. Am J Hum Genet. 2005; 77: 149-53; Haines JL, et al. Sci 2005; 208: 419-21). Субъекты, являющиеся или гомозиготными, или гетерозиготными по этой точечной мутации гена Фактора H, составляют 50% случаев AMD. Фактор H является ключевым растворимым ингибитором альтернативного пути комплемента (Rodriguez de Cordoba S, et al. Mol Immunol 2004; 41: 355-67). Он связывается с C3b и, таким образом, ускоряет распад C3-конвертазы альтернативного пути (C3bBb) и действует в качестве кофактора для опосредованной Фактором I протеолитической инактивации C3b. Исследования с гистохимическим окрашиванием показали, что существует одинаковое распределение Фактора H и MAC в области контакта RPE-хориоид. Обнаруженные у пациентов с AMD значительные количества отложений MAC в этой области контакта указывают, что гаплотип Фактора H (Y402H) может обладать ослабленной функцией ингибирования комплемента. Предполагается, что Фактор H (Y402H) может обладать пониженной аффинностью связывания с C3b. Таким образом, он не настолько эффективен, как дикий тип Фактора H в ингибировании активации альтернативного пути комплемента. Это ставит RPE и клетки хориоида в положение постоянного риска атаки комплемента, опосредованной альтернативным путем. Было показано, что отсутствие в плазме Фактора H вызывает неконтролируемую активацию альтернативного пути с использованием C3 и часто других компонентов комплемента, таких как C5. В соответствии с этими полученными данными известно, что уровень Фактора H в плазме уменьшается при курении, которое является известным фактором риска для развития AMD (Esparza-Gordillo J, et al. Immunogenetics. 2004; 56: 77-82).

В настоящее время не существует испытанной лекарственной терапии для сухой формы AMD и не доступно никакое лечение для развитой сухой формы AMD. Для избранных случаев влажной формы AMD может быть эффективен метод, известный как лазерная фотокоагуляция для закрытия протекающих или кровоточащих кровеносных сосудов. К сожалению, лазерная коагуляция не возвращает потерянное зрение, но только замедляет и в некоторых случаях предотвращает дальнейшую потерю зрения. Недавно было показано, что фотодинамичная терапия является эффективной для остановки аномального роста кровеносных сосудов примерно для одной трети пациентов с влажной формой AMD в случае раннего лечения. При использовании Фотодинамичной Терапии Visdyne (PDT) краситель инъецируют в глаз пациента, он накапливается в области протекания сосуда в сетчатке, и под воздействием лазера с низкой энергией он реагирует - закрывает протекающие сосуды. В дополнение к этим двум лазерным методам существует несколько антиангиогенных терапий, направленных на создание конструкций васкулярного эндотелиального фактора роста (VEGF) для лечения влажной формы AMD. Однако только 10% подвергнутых лечению пациентов показывают улучшение зрения.

Принимая во внимание эти неадекватные способы лечения влажной формы AMD и тотальное отсутствие доступных способов лечения развитой сухой формы AMD, очевидно, что необходимо создание новых способов лечения этого серьезного заболевания. В нашем изобретении предлагается новый способ лечения этого серьезного заболевания.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к ингибиторам комплемента для лечения связанных с глазной болезнью состояний или болезней, таких как возрастная макулярная дегенерация (AMD), диабетическая ретинопатия, ангиогенез, связанный с глазной болезнью (такой как неоваскуляризация, связанная с глазной болезнью, воздействующая на хориоидную, корнеальную или ткань сетчатки), и для лечения других состояний, связанных с глазной болезнью, включающих активацию комплемента. Лечение AMD включает обе формы AMD - влажную и сухую.

Ингибиторы комплемента по настоящему изобретению включают, но не ограничены ими, те, что ингибируют альтернативный путь комплемента, такие как Фактор D, пропердин, Фактор B, Фактор Ba и Фактор Bb, и те, что ингибируют классический путь комплемента, такие как C3a, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9 и C5b-9. Настоящее изобретение также включает применение ингибиторов комплемента в комбинации с другими агентами, такими как антиангиогенные агенты и противовоспалительные агенты, такие как стероиды.

Другое воплощение настоящего изобретения относится к применению ингибиторов C5aR и C3aR, таких как антитела и выделенные фрагменты, и однодоменные конструкции, а также низкомолекулярные компоненты.

Другое воплощение настоящего изобретения относится к применению рекомбинантного растворимого белка CRl (TPlO) и к белкам, выделенным из него; к применению молекул, ингибирующих C3 (таких как компстатин, пептидомиметик, который связывается с С3 и ингибирует его активацию); к применению киРНК, которые блокируют синтез C3, C5, FD, фактора P, фактора B.

Эти ингибиторы могут представлять собой, но не ограничены ими, низкомолекулярные химические компоненты, нуклеотиды, пептиды, белки, пептидомиметики и антитела.

Другое воплощение настоящего изобретения включает применение человеческого Фактора H, очищенного из крови человека, или рекомбинантного человеческого Фактора H, вводимого пациентам с помощью внутриглазного введения или с помощью другого клинически эффективного пути введения.

Антитела по настоящему изобретению включают цельные иммуноглобулины, scFv, Fab, Fab', Fv, F(ab')2 или dAb. Домены антител включают или VH домен, или VL домен.

Одно воплощение настоящего изобретения представляет собой применение моноклонального антитела, которое связывается с Фактором D и блокирует его способность активировать альтернативный путь комплемента. Такие антитела описаны в WO 01/70818 и US 20020081293, которые введены сюда с помощью ссылки, такие антитела, как моноклональное антитело 166-32, полученное из гибридомы, депонированной в ATCC и обозначенной HB 12476. Настоящее изобретение также включает антитела, которые специфично связываются с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело 166-32. Моноклональные антитела по настоящему изобретению могут также включать гуманизированные антитела сопутствующей заявки, которая введена сюда с помощью ссылки.

Одно воплощение по настоящему изобретению представляет собой применение моноклонального антитела, которое связывается с компонентом комплемента C5a. Такие антитела включают антитело 137-26, полученное из гибридомы, депонированной в ATCC и обозначенной PTA-3650, и любое антитело, которое специфично связывается с тем же эпитопом, что и антитело 137-26.

Согласно настоящему изобретению ингибитор пути комплемента может вводиться путем (a) парентерального введения; (b) с помощью биосовместимого или биодеградируемого имплантанта с замедленным высвобождением; (c) с помощью имплантации инфузионного насоса; или (d) с помощью локального введения, такого как субконъюнктивальное введение или введение в стекловидное тело. Ингибитор комплемента может также вводиться с помощью парентерального введения, выбранного из перорального введения, энтерального введения и местного введения. Местное введение может включать способы введения с помощью раствора для глазной примочки, глазной мази, глазного щитка или раствора глазных капель.

Кроме того, ингибитор комплемента по настоящему изобретению может вводиться в комбинации с иммуномодулирующим или иммуноподавляющим компонентом.

Другое воплощение настоящего изобретения относится к введению конструкций нуклеиновой кислоты, которые способны экспрессировать ингибиторы пути комплемента для генной терапии.

Другое воплощение настоящего изобретения включает способ скрининга ингибиторов комплемента, которые применимы в лечении AMD, включая применение модели AMD на стареющих мышах, дифицитных по Ccl-2 или Ccr-2. У этих мышей проявляются гистопатологические изменения, подобные обнаруженным при сухой и влажной форме AMD человека. Эти мыши могут быть подвергнуты лечению ингибиторами комплемента или Фактора H с помощью введения в стекловидное тело. Гистологическое исследование может быть осуществлено для определения защиты от развития AMD у мышей, подвергнутых лечению с помощью тестируемых агентов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Это изобретение не ограничено специальными, описанными в описании изобретения, методами, протоколами, клеточными линиями, векторами или реагентами, потому что они могут варьироваться. Кроме того, применяемая терминология не предназначена только для целей описания конкретных воплощений, и подразумевается, что она не ограничена рамками настоящего изобретения. В описании и формуле изобретения формы единственного числа включают ссылку на множественное число, если только в контексте ясно не оговорено другое, например ссылка на "клетку-хозяин" включает множество таких клеток-хозяев.

Если не определено по-другому, все применяемые технические и научные термины и любые акронимы имеют такие же значения, как и в общепринятом понимании специалистов в данной области изобретения. Здесь описаны приведенные для примера способы, инструменты и вещества, хотя в практической области настоящего изобретения могут применяться любые подобные или эквивалентные описанным здесь способам или веществам.

Все указанные патенты и публикации включены в описание посредством ссылки в допустимой по закону степени для целей описания и определения белков, ферментов, векторов, клеток-хозяев и методов, опубликованных здесь, которые могут применяться по настоящему изобретению. Однако здесь ничего не должно быть истолковано как допущение, что изобретение не дает права датировать более ранним числом такую заявку на основании предыдущего изобретения.

Определения

Термин "вариант аминокислотной последовательности" обозначает полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности, которые отличаются в некоторой степени от нативной последовательности полипептида. Обычно варианты аминокислотной последовательности имеют, по меньшей мере, примерно 70% гомологию с нативным полипептидом, или, по меньшей мере, примерно 80% гомологию, или, по меньшей мере, примерно 90% гомологию с нативным полипептидом. Варианты аминокислотной последовательности имеют замены, делеции и/или вставки в определенных положениях внутри нативной аминокислотной последовательности.

Термин "идентичность" или "гомология" определяется как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны с остатком соответствующей последовательности, с которой осуществляется сравнение, после сравнения последовательностей и введения пропусков, если необходимо для достижения максимального процента идентичности для всей последовательности, при этом, не учитывая никаких консервативных замен как часть идентичности. Ни N- или C-концевые удлинения или вставки не должны быть истолкованы как уменьшающие идентичность или гомологию. Способы и компьютерные программы для сравнения хорошо известны из уровня техники. Идентичность последовательности может быть легко рассчитана известными способами, включающими, но не ограниченными способами, описанными в (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; and Carillo, 30 H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Способы определения идентичности разработаны для получения наибольшего совпадения между тестируемыми последовательностями. Способы определения идентичности между двумя последовательностями с использованием компьютерных программ включают, но не ограничены пакетом программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, and FASTA (Atschul, S.F. et al., J Molec. Biol. 215: 403-410 (1990). Программа BLAST X общедоступна через NCBI и через другие источники (BLASTManual, Altschul, S., et al, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. MoI. Biol. 215: 403-410 (1990). Хорошо известный алгоритм Смита-Ватермана также может применяться для определения идентичности.

Термин "антитело" применяется здесь в широком смысле и конкретно охватывает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), образованные, по меньшей мере, из двух интактных антител и фрагментов антител, поскольку они проявляют желаемую биологическую активность.

Термин "моноклональное антитело", как применяется здесь, обозначает антитело, полученное из популяции по существу гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в минорных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты на антигене. Модификатор "моноклональное" показывает характер антитела, которое получено из, по существу, гомогенной популяции антител, и этот термин не должен быть истолкован, как требующий получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, которые применяются в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены с помощью гибридомного способа, описанного впервые Kohler et al, Nature, 256:495 (1975), или могут быть получены рекомбинантными методами ДНК (см. e.g., U.S. Pat. No. 4,816,567). "Моноклональные антитела" могут быть также выделены из фаговой библиотеки антител с применением методик, описанных, например, у Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991). Моноклональные антитела здесь конкретно включают "химерные" антитела, в которых участок тяжелой и/или легкой цепи является идентичным или гомологичным соответствующим последовательностям антител, выделенных из конкретных видов или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как оставшийся участок цепи(ей) является идентичным или гомологичным соответствующей последовательности антител, выделенных из других видов или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также является идентичным или гомологичным соответствующей последовательности таких фрагментов антител, поскольку они проявляют желаемую биологическую активность (U.S. Pat. No. 4,816,567; and Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).

"Фрагменты антител" включают участок интактного антитела, включающий его антиген-связывающий или вариабельный участок. Примеры фрагментов антитела включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2 и Fv; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител; и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител).

"Интактное" антитело представляет собой антитело, которое включает антиген-связывающий вариабельный участок, а также константный домен легкой цепи (CL) и константные домены тяжелой цепи, CH1, CH2 и CH3. Константные домены могут представлять собой нативные последовательности константных доменов (например, человеческие нативные последовательности константных доменов) или их вариант аминокислотной последовательности. Интактное антитело может обладать одной или более эффекторными функциями.

"Эффекторные функции" антитела обозначают такие биологические активности, которые могут быть отнесены к Fc участку (нативная последовательность Fc участка или вариант аминокислотной последовательности Fc участка) антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают CIq связывание; комплемент-зависимую цитотоксичность; связывание Fc рецетора; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; даун-регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, B-клеточный рецептор; BCR) и т.д.

В зависимости от аминокислотной последовательности константного домена их тяжелых цепей интактные антитела могут быть отнесены к различным "классам". Существует пять главных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на "подклассы" (изотипы), например IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам антител, называются α, δ, ε, γ и µ соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов хорошо известны.

"Антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность" (ADCC) обозначает клеточно-опосредованную реакцию, в которой не специфичные цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc рецепторы (FcR) (например, Натуральные Киллерные клетки (NK), нейтрофилы и макрофаги), распознают связанное антитело на клетке-мишени и, следовательно, вызывают лизис клетки-мишени. Первичные клетки, опосредующие ADCC, NK клетки, экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. FcR экспрессируется на гемопоэтических клетках. Для определения ADCC активности интересующей молекулы может быть осуществлен in vitro ADCC тест, такой как описанный в U.S. Пат.No. 5500362 или 5821337. Применяемые эффекторные клетки для таких тестов включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и Натуральные Киллерные (NK) клетки. Альтернативно или дополнительно, ADCC активность интересующей молекулы может быть определена in vivo, например, в модели животных. Некоторые такие модели являются общедоступными.

Термин "вариабельный" обозначает тот факт, что определенные участки вариабельных доменов существенно отличаются по последовательностям между антителами и применяются для связывания и специфичности каждого конкретного антитела для его конкретного антигена. Однако вариабельность неодинаково распределена по последовательностям вариабельных доменов антител. Она сконцентрирована в трех сегментах, называемых гипервариабельными участками, оба - в легкой цепи и вариабельные домены тяжелой цепи. Эти гипервариабельные участки также называются участками, определяющими комплементарность или CDR. Наиболее высококонсервативные участки называются каркасными участками (FR). Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелой и легкой цепей включает четыре FR, обычно принимающих конфигурацию β-листа, связанных тремя гипервариабельными участками, которые образуют петли, связывающие и в некоторых случаях образующие часть структуры β-листа. Гипервариабельные участки в каждой цепи посредством FR поддерживаются вместе в близком соседстве и с гипервариабельными участками из другой цепи вносят вклад в образование антиген-связывающего сайта антител (смотри Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).

Термин "гипервариабельный участок" обозначает аминокислотные остатки антитела, которые ответственны за связывание с антигеном. Гипервариабельный участок обычно включает аминокислотные остатки из "участка, определяющего комплементарность" или "CDR" (например, остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (Hl), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) и/или остатки из "гипервариабельной петли" (например, остатки 2632 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk J. MoL Biol. 196:901-917 (1987)). Как здесь определяется, остатки "Каркасного Участка" или "FR" остатки представляют собой такие остатки вариабельного домена, которые отличны от остатков гипервариабельного участка.

Посредством папаинового гидролиза антител получают два идентичных антиген-связывающих фрагмента, называемых "Fab" фрагментами, каждый с одним антиген-связывающим сайтом, и остаточный "Fc" фрагмент, чье название отражает его способность легко кристаллизоваться. При обработке пепсином получают F(ab')2 фрагмент, который имеет два антиген-связывающих сайта, и все еще остается способным к перекрестному связыванию антигена.

Fab фрагмент также содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CHI) тяжелой цепи. Fab' фрагменты отличаются от Fab фрагментов вставкой нескольких остатков в карбокси конец CHl домена тяжелой цепи, включая один или более цистеинов из шарнирного участка антитела. Fab'-SH здесь является обозначением для Fab', в котором цистеиновые остатки константных доменов несут, по меньшей мере, одну свободную тиольную группу. F(ab')2 фрагменты антитела исходно были получены как пары Fab' фрагментов, между которыми располагаются шарнирные цистеины. Также известны другие химические конденсации фрагментов антитела.

"Легкие цепи" антител из любых растительных видов могут быть отнесены к одному из двух совершенно отдельных типов, называемых каппа (K) и лямбда (л), на основании аминокислотных последовательностей их константных доменов.

"Fv" представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антиген-распознающий и антиген-связывающий сайт. Этот участок состоит из димера одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи, которые находятся в плотной, но не ковалентной связи. Они находятся в такой конфигурации, чтобы три гипервариабельных участка каждого гипервариабельного домена взаимодействовали для определения антиген-связывающего сайта на поверхности VH-VL димера. Вместе шесть гипервариабельных участков дают антителу антиген-связывающую специфичность. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, включающего только три гипервариабельных участка, специфичных для антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя с меньшей аффинностью, чем полный сайт связывания.

"Одноцепочечный Fv" или "scFv" фрагменты антитела включают VH и VL домены антитела, где эти домены присутствуют в виде одной полипептидной цепи. Предпочтительно Fv полипептид дополнительно включает полипептидный линкер между VH и VL доменами, который дает возможность scFv образовывать желаемую структуру для связывания антигена. В качестве обзора по scFv смотри Pliickthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994). scFv фрагменты антитела к ErbB2 описаны в WO93/16185; U.S. Пат. No. 5571894; и U.S. Пат. No. 5587458.

Термин "диатела" обозначает короткие фрагменты антитела с двумя антиген-связывающими сайтами, которые включают вариабельный домен тяжелой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (VL) в одну полипептидную цепь (VH-VL). Посредством применения линкера, который слишком короткий, чтобы дать возможность спариться двум доменам на одной и той же цепи, осуществляется принудительное спаривание доменов с комплементарными доменами на другой цепи и создаются два антиген-связывающих сайта. Диатела наиболее полно описаны, например, в EP 404097; WO 93/11161; и у Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 90:6444-6448 (1993).

"Однодоменное антитело" является синонимом с "dAb" и обозначает полипептид вариабельного участка иммуноглобулина, где связывание антигена осуществляется с помощью одного домена, содержащего вариабельный участок. Как применяется здесь, "однодоменное антитело" включает i) антитело, включающее вариабельный домен тяжелой цепи (VH), или его антиген-связывающий фрагмент, который образует антиген-связывающий сайт независимо от любого другого вариабельного домена, ii) антитело, включающее вариабельный домен легкой цепи (VL), или его антиген-связывающий фрагмент, который образует антиген-связывающий сайт независимо от любого другого вариабельного домена, iii) антитело, включающее полипептид, содержащий VH домен, связанный с другим полипептидом, содержащим VH или VL домен (например, VH-VH или VHx-VL), где каждый V домен образует антиген-связывающий сайт независимо от любого другого вариабельного домена, и iv) антитело, включающее полипептид, содержащий VL домен, связанный с другим полипептидом, содержащим VL домен (VL-VL), где каждый V домен образует антиген-связывающий сайт независимо от любого другого вариабельного домена. Как применяется здесь, VL домен обозначает обе формы легких цепей - каппа и лямбда.

"Гуманизированные" формы отличных от человеческих антител (например, грызунов) представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, выделенную из отличного от человеческого иммуноглобулина. Гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины, где гипервариабельные участки замещены остатками из гипервариабельного участка из отличных от человека видов, таких как мышь, крыса, кролик или отличный от человека примат, имеющие желаемую специфичность, аффинность и способность. В некоторых случаях остатки каркасного участка (FR) человеческого иммуноглобулина замещены на соответствующие, отличные от человеческих остатки. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать остатки, которые не обнаружены в человеческом антителе или в отличном от человеческого антителе. Эти модификации осуществляют для дополнительного улучшения характеристик антитела. Обычно гуманизированное антитело включает, по существу, все из, по меньшей мере, одного и обычно из двух вариабельных доменов, в которых все или, по существу, все из гипервариабельных петель соответствуют аналогичным последовательностям отличного от человеческого иммуноглобулина и все или, по существу, все из FR представляют собой аналогичные последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело также необязательно включает, по меньшей мере, фрагмент константного участка иммуноглобулина (Fc), обычно человеческого иммуноглобулина. Примеры методики гуманизации можно обнаружить, например, у Queen et al. U.S. Пат. No. 5585089, 5693761; 5693762; 6180370, которые введены сюда с помощью ссылки.

ПОЛУЧЕНИЕ АНТИТЕЛ

Антитела по настоящему изобретению могут быть получены с помощью любого подходящего способа, известного из уровня техники. Антитела по настоящему изобретению могут включать поликлональные антитела. Способы получения поликлональных антител известны специалисту в данной области (Harlow, et al., Antibodies: a Laboratory Manual (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988), которая, таким образом, полностью введена сюда с помощью ссылки).

Например, антитела могут быть получены путем введения иммуногена, включающего интересующий антиген, различным животным-хозяевам, включающим, но не ограниченным ими, кроликов, мышей, крыс и т.д., для того чтобы индуцировать продуцирование сыворотки, содержащей специфичные к антигену поликлональные антитела. Введение иммуногена может повлечь за собой одну или более инъекций иммунизированного агента и, если желательно, адъюванта. Для повышения иммунологического ответа могут применяться различные адъюванты в зависимости от видов-хозяев и включают, но не ограничены ими, адъювант Фрейнда (полный и не полный), минеральные гели, такие как гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюрониловые полиолы, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианины лимфы улитки, динитрофенол и потенциально применяемые человеческие адъюванты, такие как BCG (бацилла Кальмета-Герена) и Corynebacterium parvum. Дополнительные примеры адъювантов, которые могут применяться, включают MPL-TDM адъювант (монофосфорил липид A, синтетический дикориномиколат трегалозы).

Протоколы иммунизации хорошо известны из уровня техники и могут быть осуществлены с помощью способа, который вызывает иммунный ответ у выбранного животного-хозяина. Адъюванты хорошо известны из уровня техники.

Обычно иммуноген (содержащий или не содержащий адъювант) инъецируют млекопитающему с помощью многократных подкожных или внутрибрюшинных инъекций или иммуноген инъецируют внутримышечно или через IV. Иммуноген может включать антигенный полипептид, сшитый белок или их варианты. В зависимости от природы полипептидов (т.е. процента гидрофобности, процента гидрофильности, стабильности, суммарного заряда, изоэлектрической точки и т.д.) они могут применяться для конъюгации иммуногена с белком, о котором известно, что он является иммуногенным для иммунизируемого млекопитающего. Такая конъюгация включает как химическую конъюгацию путем модификации активных химических функциональных групп с двумя агентами - иммуногеном и иммуногенным белком, чтобы они были конъюгированы так, чтобы образовалась ковалентная связь, так и включает конъюгацию с помощью методики на основе образования сшитого белка, или с помощью других способов, известных специалисту в данной области. Примеры таких иммуногенных белков включают, но не ограничены ими, гемоцианин лимфы улитки, овальбумин, сывороточный альбумин, бычий тироглобулин, соевый ингибитор трипсина и разные Т-хелперные пептиды. Различные адъюванты могут применяться для повышения иммунологического ответа, как описано выше.

Антитела, применяемые по настоящему изобретению, включают моноклональные антитела. Моноклональные антитела могут быть получены с применением гибридомной методики, такой как методики, описанные у Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975) и U.S. Пат. No. 4376110, by Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2.sup.nd ed. (1988), by Hammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas (Elsevier, N.Y., (1981)), или могут быть получены с помощью других способов, известных специалисту в данной области. Другие примеры способов, которые могут применяться для получения моноклональных антител, включают, но не ограничены ими, гибридомную методику с человеческими В-клетками (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030) и EBV-гибридомную методику (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96). Такие антитела могут представлять собой любой класс иммуноглобулинов, включающий IgG, IgM, IgE, IgA, IgD и любой их подкласс. Гибридома, продуцирующая антитела по этому изобретению, может культивироваться in vitro или in vivo.

С применением обычных гибридомных методик животное-хозяин, такое как мышь, гуманизированная мышь, мышь с человеческой иммунной системой, хомяк, кролик, верблюд или любое другое подходящее животное-хозяин, обычно иммунизируется иммуногеном, чтобы вызвать ответ лимфоцитов, которые продуцируют или способны к продуцированию антител, которые специфично связываются с интересующим антигеном. Альтернативно, лимфоциты могут иммунизироваться антигеном in vitro.

Обычно при получении продуцирующих антитела гибиридом применяются или лимфоциты периферической крови ("PBL"), если желательно использовать клетки с человеческим происхождением, или применяются клетки селезенки или лимфатического узла, если желательно использовать источники клеток млекопитающих, отличных от человека. Затем производят слияние лимфоцитов с иммортализованной клеточной линией с применением подходящего агента для слияния, такого как полиэтиленгликоль, для образования гибридомной клетки (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986), pp.59-103). Иммортализованные клеточные линии обычно трансформируют клетки млекопитающих, в особенности клетки миеломы с происхождением от грызуна, быка или человека. Обычно применяется клеточная линия миеломы крысы или мыши. Гибридомные клетки могут культивироваться в подходящей культуральной среде, которая предпочтительно содержит одно или более веществ, которые ингибируют рост или выживание не слитых иммортализованных клеток. Например, если родительские клетки лишены фермента гуанин фосфорибозилтрансферазы (HGPRT или HPRT), то культуральная среда для гибридом обычно включает гипоксантин, аминоптерин или тимидин ("HAT среда"), вещества, которые предотвращают рост клеток, дефицитных по HGPRT.

Предпочтительные иммортализованные клеточные линии представляют собой клеточные линии, которые эффективно подвергаются слиянию, поддерживают стабильный высокий уровень экспрессии антитела у селектированных продуцирующих антитело клеток, и являются чувствительными к такой среде, как HAT. Более предпочтительные иммортализованные клеточные линии представляют собой мышиные миеломные линии, которые могут быть получены, например, из Клеточного Распределительного Центра Института SaIk, San Diego, Calif, и из Американской Типированной Коллекции Клеточных Культур, Manassas, Va. Клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы человек-мышь также могут применяться для продуцирования человеческих моноклональных антител (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp.51-63).

Культуральная среда, в которой культивируются гибридомные клетки, может затем быть проанализирована на присутствие моноклональных антител, направленных против иммуногена. Специфичность связывания моноклональных антител, продуцированных гибридомными клетками, определяется с помощью, например, иммунопреципитации или с помощью in vitro анализа связывания, такого как радиоиммуноанализ (RIA) или твердофазный ИФА (ELISA). Такие методики известны из уровня техники специалисту в данной области. Аффинность связывания моноклонального антитела может быть определена, например, с помощью Scatchard анализа (Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)).

После того как желаемые гибридомные клетки идентифицированы, клоны могут быть субклонированы с помощью процедур лимитирующего разведения и выращены с помощью стандартных методов (Goding, смотри выше). Подходящая культуральная среда для этой цели включает, например, Модифицированную Дульбекко Среду Иглу и RPMI-1640. Моноклональные антитела, секретированные субклонами, могут быть выделены или очищены из культуральной среды с помощью подходящих процедур очистки иммуноглобулинов, таких как, например, очистка с помощью протеин А-сефарозы, с помощью хроматографии на гидроксиапатите, гель-эксклюзионной хроматографии, гель-электрофореза, диализа или с помощью аффинной хроматографии.

Из уровня техники известно о существовании разнообразия способов получения моноклональных антител, и, таким образом, изобретение не ограничено единственным способом получения антител из гибридом. Например, моноклональные антитела могут быть получены с помощью методов рекомбинантной ДНК, таких как методы, описанные в U.S. Пат. No. 4816567. В этом контексте термин "моноклональное антитело" обозначает антитело, выделенное из единственного эукариотического, фагового или прокариотического клона. ДНК, кодирующие моноклональные антитела по изобретению, могут быть легко выделены и отсеквенированы с применением обычных процедур (например, с применением олигонуклеотидных зондов, которые способны к специфичному связыванию с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител, или с генами, кодирующими такие цепи человеческих антител, гуманизированных антител или антител из других источников). Гибридомные клетки по изобретению служат в качестве предпочтительного источника такой ДНК. Однажды выделенная ДНК может быть помещена в экспрессирующие векторы, которые затем трансформируются в клетки-хозяева, которые по-другому не продуцируют иммуноглобулиновый белок, такие клетки как NSO клетки, Обезьяньи COS клетки, клетки яичника Китайского хомячка (CHO) или миеломные клетки, чтобы получить синтез моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах. ДНК также может быть модифицирована, например, путем замещения кодирующей последовательности константных доменов тяжелой и легкой цепи человека в месте гомологичных мышиных последовательностей (U.S. Пат. No. 4816567; Morrison et al., выше) или путем ковалентного соединения с кодирующей последовательностью иммуноглобулина всей или части кодирующей последовательности не иммуноглобулинового полипептида. Такой не иммуноглобулиновый полипептид может быть замещен на константные домены антитела по изобретению или может быть замещен на вариабельные домены одного объединенного антигенного сайта антитела по изобретению для создания химерного бивалентного антитела.

Антитела могут представлять собой моновалентные антитела. Способы получения моновалентных антител хорошо известны из уровня техники. Например, один способ включает рекомбинантную экспрессию легкой цепи иммуноглобулина и модифицированной тяжелой цепи. Тяжелая цепь является усеченной обычно в любой точке участка Fc с тем, чтобы предотвратить перекрестное связывание тяжелой цепи. Альтернативно, существенные цистеиновые остатки замещают на другой аминокислотный остаток или делетируют с тем, чтобы предотвратить перекрестное связывание.

Фрагменты антитела, которые распознают специфические эпитопы, могут быть получены с помощью известных методик. Например, Fab и F(ab')2 фрагменты по изобретению могут быть получены с помощью протеолитического расщепления иммуноглобулиновых молекул с применением таких ферментов, как папаин (для получения Fab фрагментов) или пепсин (для получения F(ab')2 фрагментов). F(ab')2 фрагменты содержат вариабельный участок, константный участок легкой цепи и CHl домен тяжелой цепи.

Для некоторых применений, включающих in vivo применение антител у человека и in vitro анализ детекции, может быть предпочтительным применением химерных, гуманизированных или человеческих антител. Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой различные участки антитела выделены из различных видов животных, такие антитела имеют вариабельный участок, выделенный из мышиного моноклонального антитела, и константный участок человеческого иммуноглобулина. Способы получения химерных антител известны из уровня техники. Смотри, например, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; U.S. Пат. No. 5807715; 4816567 и 4816397, которые полностью введены сюда с помощью ссылки.

Гуманизированные антитела представляют собой полученные из отличных от человека видов молекулы антител, которые связываются с желаемым антигеном, имеющим один или более участков, определяющих комплиментарность (CDR) из отличных от человека видов, и каркасные участки (FR) из человеческой молекулы иммуноглобулина. Часто каркасные остатки в человеческих каркасных участках замещают на соответствующий остаток из CDR донорного антитела для изменения, предпочтительно для улучшения связывания антигена. Эти каркасные замещения идентифицируются с помощью способов, хорошо известных из уровня техники, например с помощью моделирования взаимодействий CDR и каркасных остатков для идентификации каркасных остатков, имеющих важность для связывания антигена, и с помощью сравнения последовательностей для идентификации необычных каркасных остатков в конкретных положениях. (Смотри, например, Queen et al., U.S. Пат. No. 5585089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), которые полностью введены сюда с помощью ссылки.) Антитела могут быть гуманизированы с применением различных методик, известных из уровня техники, включающих, например, CDR-пересадку (EP 239400; PCT публикация WO 91/09967; U.S. Пат. No. 5225539; 5530101; и 5585089), маскировку или перекладку (EP 592,106; EP 519596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)), и перемещение цепей (U.S. Пат. No. 5565332).

Обычно гуманизированное антитело имеет один или более аминокислотных остатков, введенных в него из отличного от человеческого источника. Эти отличные от человеческих аминокислотные остатки часто обозначают как "важные" остатки, которые обычно взяты из "важного" вариабельного домена. Гуманизация может быть обычно осуществлена, следуя способам Winter и сотр. (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988), путем замещения CDR грызунов или CDR последовательностей на соответствующие последовательности человеческого антитела. Соответственно, такие "гуманизированные" антитела являются химерными антителами (U.S. Пат. No. 4816567), где, по существу, менее чем интактный человеческий вариабельный домен был замещен на соответствующую последовательность из отличных от человека видов. В практике гуманизированные антитела обычно представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые CDR остатки и, возможно, некоторые FR остатки замещены из аналогичных сайтов антител грызунов.

Полностью человеческие антитела в особенности являются желательными для терапевтического лечения пациентов людей. Человеческие антитела могут быть получены с помощью различных способов, известных из уровня техники, включающих способы фагового дисплея, описанные выше, с применением библиотек антител, выделенных из человеческих иммуноглобулиновых последовательностей. Смотри также U.S. Пат. No. 4444887 и 4716111 и PCT публикации WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 и WO 91/10741; каждая из которых полностью введена сюда с помощью ссылки. Также доступны методики Cole et al. и Boerder et al. для получения человеческих моноклональных антител (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Riss, (1985); and Boerner et al., J. Immunol., 147(l):86-95, (1991)).

Человеческие антитела могут также представлять собой однодоменные антитела, имеющие VH или VL домен, который функционирует независимо от любого другого вариабельного домена. Эти антитела обычно выбраны из библиотеки антител, экспрессирующейся в фаге. Эти антитела и способы выделения таких антител описаны в U.S. Пат.No. 6595142; 6248516; и в заявках US20040110941 и US20030130496, каждая из которых введена сюда с помощью ссылки.

Человеческие антитела также могут быть получены с применением трансгенных мышей, которые не способны к экспрессии функциональных эндогенных иммуноглобулинов, но которые могут экспрессировать человеческие иммуноглобулиновые гены. Например, комплексы человеческих иммуноглобулиновых генов тяжелой и легкой цепи могут быть введены случайным образом или с помощью гомологичной рекомбинации в мышиные эмбриональные стволовые клетки. Альтернативно, человеческий вариабельный участок, константный участок и участок вариабельности могут быть введены в мышиные эмбриональные стволовые клетки в дополнение к человеческим генам тяжелой и легкой цепи. Мышиные иммуноглобулиновые гены тяжелой и легкой цепи могут быть представлены отдельно, как нефункциональные, или одновременно с введением человеческого иммуноглобулинового локуса путем гомологичной рекомбинации. В особенности гомозиготная делеция JH участка предотвращает эндогенное продуцирование антитела. Модифицированные эмбриональные стволовые клетки размножают и проводят их микроинъекцию в бластоцисты для получения химерных мышей. Химерных мышей затем оплодотворяют для получения гомозиготного потомка, который экспрессирует человеческие антитела. Трансгенных мышей иммунизируют обычным способом с выбранным антигеном, например, с помощью цельного или части полипептида по изобретению. Моноклональные антитела, направленные против антигена, могут быть получены из иммунизированных, трансгенных мышей с применением обычной гибридомной методики. Человеческие иммуноглобулиновые трансгены, скрытые при перегруппировке во время В-клеточной дифференцировки трансгенной мыши, и, следовательно, подвергаются переключению классов и соматической мутации. Таким образом, применяя такую методику, возможно получать терапевтически применимые антитела IgG, IgA, IgM и IgE. Для обзора этой методики получения человеческих антител смотри Lonberg and Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Для подробного обсуждения этой методики получения человеческих антител и человеческих моноклональных антител и протоколов получения таких антител, смотри, например, PCT публикации WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; Европейский Патент No. 0598877; U.S. Пат. No. 5413923; 5625126; 5633425; 5569825; 5661016; 5545806; 5814318; 5885793; 5916771 и 5939598, которые полностью введены сюда с помощью ссылки. Кроме того, такие компании, как Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.), Genpharm (San Jose, Calif) и Medarex, Inc. (Princeton, NJ.), могут быть заняты получением человеческих антител, направленных против выбранного антигена, с применением методики, подобной той, что описана выше.

Также человеческие MAb могут быть получены с помощью иммунизации мышей с трансплантированными лейкоцитами периферической крови человека, спленоцитами или костным мозгом (например, Trioma методики XTL). Полностью человеческие антитела, которые распознают выбранный эпитоп, могут быть получены с применением методики, обозначенной как "управляемая селекция". В этом способе выбранное отличное от человеческого моноклональное антитело, например мышиное антитело, применяется для управления селекцией полностью человеческого антитела, распознающего тот же эпитоп (Jespers et al., Bio/technology 12:899-903 (1988)).

Кроме того, антитела к полипептидам по изобретению могут, в свою очередь, применяться для получения антиидиотипических антител, которые "имитируют" полипептиды по изобретению с применением методик, хорошо известных специалисту в данной области из уровня техники (Смотри, например, Greenspan & Bona, FASEB J. 7(5): 437-444; (1989) and Nissinoff, J. Immunol. 147(8): 2429-2438 (1991)). Например, могут применяться антитела, которые связываются с полипептидом и конкурентно ингибируют полипептидную мультимеризацию и/или связывание полипептида по изобретению с лигандом, для получения антиидиотипов, которые "имитируют" полипептидную мультимеризацию и/или связывание домена и, как следствие, связываются с полипептидом и нейтрализуют его и/или его лиганд. Такие нейтрализующие антиидиотипы или Fab фрагмент таких антиидиотипов могут применяться в терапевтических режимах для нейтрализации лиганда полипептида. Например, такие антиидиотипические антитела могут применяться для связывания полипептида по изобретению и/или для связывания его лигандов/рецепторов, и таким образом, блокируют его биологическую активность.

Антитела по настоящему изобретению могут представлять собой биспецифичные антитела. Биспецифичные антитела представляют собой моноклональные предпочтительно человеческие или гуманизированные антитела, которые обладают специфичностями связывания, по меньшей мере, к двум различным антигенам. В настоящем изобретении одна из специфичностей связывания может быть направлена по отношению к Фактору D, другая может быть направлена к другому антигену и предпочтительно к белку клеточной поверхности, рецептору, субъединице рецептора, тканеспецифичному антигену, белку, выделенному из вируса, к кодируемому вирусом белку оболочки, к белку, выделенному из бактерии или к поверхностному бактериальному белку и т.д. Биспецифичные антитела могут также включать два или более однодоменных антител.

Способы получения биспецифичных антител хорошо известны. Традиционно рекомбинантное продуцирование биспецифичных антител основано на коэкспрессии двух пар - тяжелая цепь/легкая цепь иммуноглобулина, где две тяжелые цепи обладают различными специфичностями (Milstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983). Из-за случайного выбора тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина эти гибридомы (квадромы) продуцируют потенциальную смесь часто различных молекул антител, из которых только одна обладает правильной биспецифичной структурой. Очистка правильной молекулы обычно осуществляется путем стадий аффинной хроматографии. Подобные процедуры описаны в WO 93/08829, опубликованном 13 Мая, 1993, и у Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991).

Вариабельные домены антитела с желаемыми специфичностями связывания (объединенные сайты антитело-антиген) могут быть сшиты с последовательностями константных доменов иммуноглобулина. Сшивание предпочтительно осуществляют с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина, включающим, по меньшей мере, часть шарнирного участка, CH2 и CH3 участков. Антитело может иметь первый константный участок тяжелой цепи (CHl), содержащий сайт, необходимый для связывания легкой цепи, присутствующей, по меньшей мере, в одной из сшитых последовательностей. ДНК, кодирующие сшитые последовательности тяжелой цепи иммуноглобулина и, если желательно, легкой цепи иммуноглобулина, вставляют в отдельные экспрессирующие векторы и котрансформируют в подходящий организм-хозяин. Для дополнительных подробностей получения биспецифичных антител смотри, например, Suresh et al., Meth. In Enzym., 121:210 (1986).

Гетероконъюгатные антитела также предлагаются по настоящему изобретению. Гетероконъюгатные антитела состоят из двух ковалентно связанных антител. Предполагается, что такие антитела направляют клетки иммунной системы к нежелательным клеткам (U.S. Пат. No. 4676980). Предполагается, что антитела могут быть получены in vitro с применением известных способов синтетической белковой химии, включая способы, включающие перекрестно-связанные агенты. Например, могут быть сконструированы иммунотоксины с применением реакции дисульфидного обмена или путем образования тиоэфирной связи. Примеры подходящих реагентов для этой цели включают иминотиолат и метил-4-меркаптобутиримидат и те, что описаны, например, в U.S. Пат. No. 4676980. Кроме того, могут быть получены однодоменные антитела к IL-13. Примеры этой методики описаны в WO 9425591 для антител, выделенных из тяжелой цепи Ig из семейства верблюдовых Camelidae, а также в US 20030130496, описывающем выделение полностью человеческих однодоменных антител из фаговых библиотек.

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ (MAB)

В одном воплощении по изобретению моноклональные антитела, такие как к Фактору D, могут быть получены путем иммунизации грызунов (например, мышей, крыс, хомячков и морских свинок) или нативным Фактором D, очищенным из плазмы или мочи человека, или рекомбинантным Фактором D или его фрагментами, экспрессирующимися или эукариотической, или прокариотической системами. Другие животные могут применяться для иммунизации, например отличные от человека приматы, трансгенные мыши, экспрессирующие человеческие иммуноглобулины и мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), трансплантированные с человеческими В лимфоцитами. Гибридомы могут быть получены с помощью обычных процедур путем слияния В лимфоцитов из иммунизированных животных с миеломными клетками (например, Sp2/0 и NSO), как описано у G. Köhler and C. Milstein (Nature, 1975: 256: 495-497).

Кроме того, моноклональные антитела могут быть получены путем скрининга библиотек рекомбинантных одноцепочечных Fv или Fab из человеческих В лимфоцитов в системах фагового дисплея. Специфичность MAb к данному антигену может быть протестирована с помощью твердофазного ИФА (ELISA), Western иммуноблотинга или с помощью других иммунохимических методик. Ингибирующая активность антител по отношению к активации комплемента может быть определена для альтернативного пути с помощью гемолитического анализа с применением несенсибилизированных эритроцитов (RBC) кролика или морской свинки, и для классического пути ингибирующая активность может быть определена с применением сенсибилизированных RBC цыпленка или овцы. Гибридомы из ячеек с положительной реакцией клонируют с помощью лимитирующего разведения. Антитела очищают для характеристики специфичности к антигену, такому как фактор D, с помощью анализов, хорошо известных из уровня техники.

Также могут быть созданы связывающие одноцепочечные пептиды молекулы, в которых Fv участки тяжелой и легкой цепей являются связанными. Одноцепочечные антитела ("ScFv") и способ их конструирования описаны в U.S. Патенте No. 4946778. Альтернативно, Fab может быть сконструирован и может экспрессироваться с помощью подобных способов (MJ. Evans et al, J. Immunol. Meth., 1995; 184: 123-138). Каждое из полностью и частично человеческих антител является менее иммуногенным, чем полностью мышиные MAb, и фрагменты и одноцепочечные антитела также являются менее иммуногенными. Таким образом, маловероятно, что все эти типы антител вызовут иммунный ответ или аллергическую реакцию. Следовательно, они лучше подходят для in vivo введения людям, чем антитела с полностью животным происхождением, особенно когда необходимо повторное или продолжительное введение. Кроме того, меньший размер фрагмента антитела может помочь улучшить тканевую биодоступность, которая может быть критичной для лучшего накопления дозы при признаках острого заболевания.

В одном предпочтительном воплощении по изобретению терапевтически применяется химерный Fab, имеющий вариабельные участки животного происхождения (мышиные) и человеческие константные участки. Fab является предпочтительным, потому что он короче, чем цельный иммуноглобулин, и может обеспечить лучшую тканевую проницаемость; поскольку это моновалентная молекула, то существует меньший шанс образования иммунокомплексов и агрегатов; и он может быть получен в микробной системе, масштаб которой может быть легче увеличен, чем при использовании системы млекопитающих.

ПРИМЕНЕНИЕ ИНГИБИТОРОВ ПУТИ КОМПЛЕМЕНТА

Ингибиторы комплемента, такие как антитела и их связывающие фрагменты, могут быть введены субъектам в подходящем фармацевтическом составе различными путями, включающими, но не ограниченными ими, внутривенную инфузию, внутривенную болюсную инъекцию, и путем внутрибрюшинной инъекции, интрадермальной, внутримышечной, подкожной, внутриносовой, внутритрахейной, внутрипозвоночной инъекции и пероральным путем. Такое введение дает им возможность связываться с эндогенным антигеном, таким как Фактор D, и, таким образом, ингибировать получение анафилотоксинов C3b, C3a, C5a и C5b-9.

Определенная предпочтительная дозировка таких антител и молекул составляет между 10 и 500 мкг/мл сыворотки. Реальная дозировка может быть определена в клинических испытаниях, следуя обычной методике для определения оптимальных дозировок, т.е. путем введения различных дозировок и определения, какая из них является наиболее эффективной.

Ингибиторы пути комплемента могут функционировать, ингибируя in vivo активацию комплемента и/или альтернативный путь комплемента и воспалительные проявления, которые его сопровождают, такие как привлечение и активация макрофагов, нейтрофилов, тромбоцитов и тучных клеток, отек и разрушение ткани. Эти ингибиторы могут применяться для лечения заболеваний или состояний, которые опосредованы чрезмерной или неконтролируемой активацией системы комплемента.

Антитела по настоящему изобретению могут представлять собой моноспецифичные, биспецифичные, триспецифичные или антитела большей мультиспецифичности. Мультиспецифичные антитела могут быть специфичными к различным эпитопам выбранного антигена или могут быть специфичны к обоим - к антигену, а также к гетерологичному эпитопу, такому как гетерологичный полипептид или вещество твердой подложки. Смотри, например, PCT публикации WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt, et al, J. Immunol. 147:60-69 (1991); U.S. Пат.No. 4474893; 4714681; 4925648; 5573920; 5601819; Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992).

Антитела, применяемые по настоящему изобретению, могут быть описаны или определены в выражениях эпитоп(ы) или участок(тки) компонента пути комплемента, такого как Фактор D, который они распознают или специфично связывают. Эпитоп(ы) или полипептидный участок(тки) могут быть определены, как здесь описано, например, с помощью N-концевых и C-концевых положений, по числу следующих друг за другом аминокислотных остатков.

Антитела, применяемые по настоящему изобретению, также могут быть описаны или определены в выражении их перекрестной реакционно-способности. Антитела, которые связываются с полипептидными компонентами пути комплемента, которые имеют, по меньшей мере, 95% идентичности с IL-13, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 65%, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 55%, и, по меньшей мере, 50% идентичности (как рассчитано с применением способов, известных из уровня техники и описанных здесь), также включены в настоящее изобретение. Антитела к Фактору D также могут связываться с KD менее чем 10^-7 M, менее чем примерно 10^-6 M, менее чем примерно 10^-5 M с другими белками, такими как антитела к Фактору D из видов, отличных от того вида, против которого направлено действие антитела к Фактору D.

ВЕКТОРЫ И КЛЕТКИ-ХОЗЯЕВА

В другом аспекте в настоящем изобретении предлагаются векторные конструкции, включающие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитела по настоящему изобретению, и клетки-хозяева, включающие такой вектор. Могут применяться стандартные методики клонирования и трансформации при получении клеточных линий, экспрессирующих антитела по настоящему изобретению.

Векторы для рекомбинантой экспрессии, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитела по настоящему изобретению, могут быть получены с применением хорошо известных методик. Экспрессирующие векторы включают нуклеотидную последовательность, функционально связанную с подходящими нуклеотидными последовательностями, регулирующими транскрипцию или трансляцию, такими как последовательности, выделенные из генов млекопитающего, из микробных генов, вирусных или генов насекомого. Примеры регуляторных последовательностей включают транскрипционные промоторы, операторы, энхансеры, сайты связывания мРНК с рибосомой и/или другие подходящие последовательности, которые контролируют инициацию и терминацию транскрипции и трансляции. Нуклеотидные последовательности являются "функционально связанными", когда регуляторная последовательность функционально связана с нуклеотидной последовательностью подходящего полипептида. Таким образом, промоторная нуклеотидная последовательность функционально связана, например, с последовательностью тяжелой цепи антитела, если промоторная нуклеотидная последовательность контролирует транскрипцию подходящей нуклеотидной последовательности.

Кроме того, последовательности, кодирующие подходящие сигнальные пептиды, которые не являются природно-ассоциированными с последовательностями тяжелой и/или легкой цепи антитела, могут быть введены в экспрессирующие векторы. Например, нуклеотидная последовательность сигнального пептида (секреторного лидера) может быть сшита в одной рамке с полипептидной последовательностью так, что антитело будет секретироваться в периплазматическое пространство или в среду. Сигнальный пептид, который является функциональным в выбранных клетках-хозяевах, усиливает внеклеточную секрецию подходящего антитела. Сигнальный пептид может быть отщеплен от полипептида после секреции антитела из клетки. Примеры таких секреторных сигналов хорошо известны и включают, например, те, что описаны в US 5698435, US 5698417 и US 6204023.

Клетки-хозяева, применяемые по настоящему изобретению, включают, но не ограничены ими, микроорганизмы, такие как бактерии (например, E.coli, B. subtilis), трансформированные с рекомбинантной ДНК экспрессирующих векторов бактериофага, ДНК плазмидных экспрессирующих векторов или ДНК космидных экспрессирующих векторов, содержащих кодирующие последовательности антитела; дрожжи (например, Saccharomyces, Pichia), трансформированные рекомбинантными дрожжевыми экспрессирующими векторами, содержащими кодирующие последовательности антитела; клеточные системы насекомых, инфицированные рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, Бакуловирус), содержащими кодирующие последовательности антитела; клеточные системы растений, инфицированные рекомбинантными вирусными экспрессирующими векторами (например, мозаичный вирус цветной капусты, CaMV; мозаичный вирус табака, TMV) или трансформированные рекомбинантными плазмидными экспрессирующими векторами (например, Ti плазмидой), содержащими кодирующие последовательности антитела; или клеточные системы млекопитающего (например, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 клетки), несущие рекомбинантные экспрессирующие конструкции, содержащие промоторы, выделенные из генома клеток млекопитающего (например, металлотионеиновый промотор) или из вирусов млекопитающего (например, поздний промотор аденовируса; 7,5K промотор вируса вакцинии).

Вектор может представлять собой плазмидный вектор, одноцепочечный или двухцепочечный фаговый вектор или одноцепочечный или двухцепочечный РНК- или ДНК-вирусный вектор. Такие векторы могут быть введены в клетки в виде полинуклеотидов с помощью хорошо известных методик для введения ДНК и РНК в клетки. Векторы в случае фаговых и вирусных векторов также могут быть введены в клетки в виде упакованного и инкапсулированного вируса с помощью хорошо известных методик инфекции и трансдукции. Вирусные векторы могут быть репликативно компетентными или репликативно дефектными. В последнем случае вирусное размножение будет осуществляться только в комплементарных клетках-хозяевах. Бесклеточные системы трансляции также могут применяться для получения белка с применением РНК, выделенных из настоящих ДНК-конструкций. Такие векторы могут включать нуклеотидную последовательность, кодирующую константный участок молекулы антитела (смотри, например, PCT Публикацию WO 86/05807; PCT Публикацию WO 89/01036; и U.S. Пат. No. 5122464), и вариабельный домен антитела может быть клонирован в такой вектор для экспрессии всей тяжелой или легкой цепи.

Прокариоты, применяемые в качестве клеток-хозяев по настоящему изобретению, включают грамотрицательные или грамположительные организмы, такие как E.coli и B. subtilis. Экспрессирующие векторы для применения в прокариотических клетках-хозяевах обычно включают один или более генов фенотипически селектируемых маркеров. Ген афенотипически селектируемого маркера представляет собой, например, ген, кодирующий белок, который отвечает за устойчивость к антибиотику или который снабжает необходимыми аутотрофными условиями. Примеры применяемых экспрессирующих векторов для прокариотических клеток-хозяев включают те, что выделены из коммерчески доступных плазмид, таких как pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), pGEMl (Promega Biotec, Madison, Wisconsin., USA) и pET (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) и pRSET (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, USA) серии векторов (Studier, F.W., J. MoI. Biol. 219: 37 (1991); Schoepfer, R. Gene 124: 83 (1993)). Промоторные последовательности, обычно применяемые для рекомбинантной экспрессии векторов в прокариотических клетках-хозяевах, включают T7 (Rosenberg, et al. Gene 56, 125-135 (1987)), в-лактамазный промотор (пенициллиназный), лактозную промоторную систему (Chang et al., Nature 275:615 (1978); and Goeddel et al., Nature 281:544 (1979)), триптофановую промотроную систему (tap) (Goeddel et al., Nucl. Acids Res. 8:4057 (1980)) и tac промотор (Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).

Дрожжи, применяемые по настоящему изобретению, включают те, что происходят из Saccharomyces, Pichia, Actinomycetes и Kluyveromyces. Дрожжевые векторы часто содержат последовательность начала репликации из дрожжевой плазмиды 2м, автономно реплицирующуюся последовательность (ARS), прмоторный участок, последовательности полиаденилирования, последовательности терминации транскрипции и ген селектируемого маркера. Подходящие промоторные последовательности для дрожжевых векторов включают среди других промоторы металлотионенина, 3-фосфоглицерат киназы (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, (1980)) или промоторы других гликолитических ферментов (Holland et al., Biochem. 17:4900, (1978)), таких как энолаза, глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, гексокиназа, пируват декарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкозо-6-фосфат изомераза, 3-фосфоглицерат мутаза, пируват киназа, триозофосфат изомераза и глюкокиназа. Другие подходящие векторы и промоторы для применения в дрожжевой экспрессии дополнительно описаны у Fleer et al., Gene, 107:285-195 (1991). Другие подходящие промоторы и векторы для дрожжей и протоколы дрожжевой трансформации хорошо известны из уровня техники. Протоколы дрожжевой трансформации хорошо известны. Один такой протокол описан у Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. ScL, 75:1929 (1978). В протоколе Хиннена селектируются Trp+ трансформанты в селективной среде.

Системы культур клеток-хозяев млекопитающего или насекомого также могут применяться для экспрессии рекомбинантных антител, например Бакуловирусные системы для получения гетерологичных белков. В системах клеток насекомого в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов может применяться вирус нуклеарного гипергидроза Autographa californica (AcNPV). Вирус растет в клетках Spodoptera frugiperda. Последовательность, кодирующая антитела, может быть клонирована индивидуально в не существенные участки вируса (например, на место гена полигедрина) и может быть помещена под контроль AcNPV промотора (например, полигедринового промотора).

Могут применяться клетки NSO или клетки яичника Китайского хомячка (CHO) для экспрессии антител по настоящему изобретению у млекопитающих. Последовательности контроля транскрипции и трансляции для экспрессирующих векторов в клетках-хозяевах млекопитающего могут быть выделены из вирусных геномов. Обычно применяемые промоторные и энхансерные последовательности выделены из вируса Полиомы, Аденовируса 2, Обезьяньего Вируса 40 (SV40) и человеческого цитомегаловируса (CMV). ДНК последовательности, выделенные из вирусного генома SV40, могут применяться для обеспечения других генетических элементов для экспрессии структурной генной последовательности в клетке-хозяине млекопитающего, например последовательность начала репликации из SV40, ранний и поздний промотор, энхансер и сайты полиаденилирования. Конкретно применяются вирусные ранний и поздний промоторы, потому что оба могут быть легко получены из вирусного генома в виде фрагмента, который также может содержать вирусную последовательность начала репликации. Приведенные для примера экспрессирующие векторы для применения в клетках-хозяевах млекопитающих являются коммерчески доступными.

ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ, КОДИРУЮЩИЕ АНТИТЕЛА

В изобретении дополнительно предлагаются полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты, например ДНК, включающие нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело по изобретению или его фрагменты. Приведенные для примера полинуклеотиды включают те, что кодируют цепи антитела, включающие одну или более аминокислотных последовательностей, описанных здесь. В изобретении также охватываются полинуклеотиды, которые гибридизуются при строгих или менее строгих условиях гибридизации с полинуклеотидами, которые кодируют антитело по настоящему изобретению.

Полинуклеотиды могут быть получены, и нуклеотидная последовательность полинуклеотидов может быть определена с помощью способа, известного из уровня техники. Например, если известна последовательность полинуклеотида, то полинуклеотид, кодирующий антитело, может быть собран из химически синтезированных олигонуклеотидов (например, как описано у Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)), коротко, этот способ включает синтез перекрывающихся олигонуклеотидов, содержащих участки последовательности, кодирующей антитело, отжиг и лигирование этих олигонуклеотидов и затем амплификацию лигированных олигонуклеотидов с помощью ПЦР.

Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий антитело, может быть получен из нуклеиновой кислоты из подходящего источника. Если клон, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую конкретное антитело, не доступен, но последовательность молекулы антитела известна, то нуклеиновая кислота, кодирующая иммуноглобулин, может быть синтезирована химически или получена из подходящего источника (например, из кДНК библиотеки антител или из кДНК библиотеки или нуклеиновой кислоты, предпочтительно поли A+РНК, выделенных из тканей или клеток, экспрессирующих антитело по изобретению) с помощью ПЦР амплификации с применением синтетических праймеров, гибридизующихся с 3' и 5' концами последовательности или с помощью клонирования с применением олигонуклеотидного зонда, специфичного для конкретной генной последовательности для идентификации, например, кДНК клона из кДНК библиотеки, который кодирует антитело. Амплифицированные нуклеиновые кислоты, полученные с помощью ПЦР, затем могут быть клонированы в реплицирующиеся векторы для клонирования с применением способа, хорошо известного из уровня техники.

Однажды определив нуклеотидную последовательность и соответствующую аминокислотную последовательность антитела, с нуклеотидной последовательностью антитела можно осуществлять манипуляции с применением способов, хорошо известных из уровня техники, например, ПЦР и т.д. (смотри, например, методики, описанные у Sambrook et al., 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. and Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, которые полностью введены сюда с помощью ссылки), для получения антител, имеющих другую аминокислотную последовательность, например для создания аминокислотных замен, делеций и/или вставок.

В конкретном воплощении аминокислотная последовательность вариабельных доменов тяжелой и/или легкой цепи может быть исследована с целью идентификации последовательностей CDR с помощью хорошо известных способов, путем сравнения известных аминокислотных последовательностей с другими вариабельными участками тяжелой и/или легкой цепи для определения гипервариабельных участков последовательности. С применением обычных методик рекомбинантной ДНК один или более CDR могут быть вставлены в каркасные участки, например в человеческие каркасные участки для гуманизации отличного от человеческого антитела, как описано выше. Каркасные участки могут представлять собой природные или консенсусные каркасные участки и предпочтительно человеческие каркасные участки (смотри, например, Chothia et al., J. MoI. Biol. 278: 457-479 (1998) список человеческих каркасных участков). Предпочтительно полинуклеотид, полученный с помощью каркасных участков и CDR, кодирует антитело, которое специфично связывается с полипептидом по изобретению. Предпочтительно, как обсуждалось выше, может быть произведена одна или более аминокислотных замен внутри каркасных участков, и предпочтительно аминокислотные замены улучшают связывание антитела с его антигеном. Кроме того, такие способы могут применяться для получения аминокислотных замен или делеций одного или более цистеинов вариабельного участка, участвующих в образовании дисульфидной связи внутри цепи для получения молекул, лишенных одной или более дисульфидной связи внутри цепи. Другие изменения полинуклеотида охвачены настоящим изобретением и известны специалистам из уровня техники.

Кроме того, могут применяться методики, разработанные для продуцирования "химерных антител" (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855 (1984); Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984); Talceda et al., Nature 314:452-454 (1985)) путем сплайсинга генов из молекулы мышиного антитела с подходящей антигенной специфичностью вместе с генами из молекулы человеческого антитела с подходящей биологической активностью. Как описано выше, химерное антитело представляет собой молекулу, в которой различные участки выделены из различных видов животных, такое антитело, как те, что имеют вариабельный участок, выделенный из мышиного MAb, и константный участок человеческого иммуноглобулина, например гуманизированное антитело.

Альтернативно, методики, описанные для получения одноцепочечных антител (U.S. Пат. No. 4946778; Bird, Science 242:423-42 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); and Ward et al., Nature 334:544-54 (1989)), могут быть адаптированы для получения одноцепочечных антител. Одноцепочечные антитела образуются путем связывания фрагментов тяжелой и легкой цепи участка Fv посредством аминокислотного мостика, что приводит в результате к получению одноцепочечного полипептида. Также могут применяться методики для сборки функциональных Fv фрагментов в E.coli (Skerra et al., Science 242:1038-1041 (1988)).

СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИТЕЛ

Антитела по изобретению могут быть получены любым способом синтеза антител, известным из уровня техники, в особенности путем химического синтеза или предпочтительно с помощью методик рекомбинантной экспрессии.

Для рекомбинантной экспрессии антитела по изобретению или его фрагмента, производного или аналога (например, тяжелой или легкой цепи антитела по изобретению или одной цепи антитела по изобретению) требуется конструкция экспрессирующего вектора, содержащая полинуклеотид, который кодирует антитело или фрагмент антитела. Получив однажды полинуклеотид, кодирующий молекулу антитела, вектор для продуцирования антитела может быть получен с помощью методики рекомбинантной ДНК. Экспрессирующий вектор конструируется так, что он содержит последовательности, кодирующие антитело, и подходящие сигналы контроля транскрипции и трансляции. Эти способы включают, например, in vitro методики рекомбинантной ДНК, методики синтеза и in vivo генетическую рекомбинацию.

Экспрессирующие векторы переносят в клетки-хозяева с помощью обычных методик и трансфецированные клетки затем культивируют с помощью обычных методик для продуцирования антитела по изобретению. В одном аспекте по изобретению векторы, кодирующие обе цепи - тяжелую и легкую, могут коэкспрессироваться в клетке-хозяине для экспрессии цельной молекулы иммуноглобулина, как описано ниже.

Для экспрессии молекул антитела по изобретению могут применяться различные системы хозяин-экспрессирующий вектор, как описано выше. Такие системы экспрессии в организме-хозяине представляют носители, с помощью которых интересующие кодирующие последовательности могут быть получены и впоследствии очищены, но также представляют клетки, которые после трансформации или трансфекции подходящими кодирующими последовательностями ДНК могут экспрессировать in situ молекулу антитела по изобретению. Бактериальные клетки, такие как E.coli, и эукариотические клетки, обычно применяются для экспрессии молекулы рекомбинантного антитела, особенно для экспрессии цельной молекулы рекомбинантного антитела. Например, клетки млекопитающего, такие как клетки яичника Китайского хомячка (CHO), в соединении с вектором, содержащим главный промоторный элемент промежуточно-раннего из человеческого цитомегаловируса, представляют собой эффективную систему экспрессии антител (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)).

Кроме того, может быть выбран штамм клетки-хозяина, который модулирует экспрессию вставленных последовательностей или модифицирует и процессирует генный продукт определенным желаемым способом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг белкового продукта могут быть важными для функции белка. Различные клетки-хозяева имеют характеристики и определенные механизмы посттрансляционного процессинга и модификации белков и генных продуктов. Подходящие клеточные линии или системы клеток-хозяев могут быть выбраны, чтобы гарантировать корректную модификацию и процессинг экспрессирующегося чужеродного белка. С этой целью могут применяться эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточным аппаратом для правильного процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования генного продукта. Такие клетки-хозяева млекопитающих включают, но не ограничены ими, клетки CHO, COS, 293, 3T3 или миеломные клетки.

Для продолжительного с высоким выходом продуцирования рекомбинантных белков предпочтительна стабильная экспрессия. Например, могут быть разработаны клеточные линии, которые стабильно экспрессируют молекулу антитела. Скорее чем применение экспрессирующих векторов, которые содержат вирусные последовательности начала репликации, клетки-хозяева могут быть трансформированы ДНК, контролируемой с помощью подходящих элементов контроля экспрессии (например, с помощью последовательностей промотора, энхансера, терминаторов транскрипции, сайтов полиаденилирования и т.д.) и селектируемого маркера. Следом за введением чужеродной ДНК клеткам, содержащим конструкцию, дают возможность расти в течение 1-2 дней в обогащенной среде и затем переключают на селективную среду. Селектируемый маркер в рекомбинантной плазмиде отвечает за устойчивость к селекции и дает клеткам возможность стабильно интегрировать плазмиду в хромосомы клеток и расти с образованием фокусов, которые в свою очередь могут быть клонированы и развиты в клеточные линии. Этот способ преимущественно может применяться для конструирования клеточных линий, которые экспрессируют молекулу антитела. Такие сконструированные клеточные линии могут быть в особенности применимы при скрининге и оценке компонентов, которые взаимодействуют непосредственно с молекулой антитела или косвенно.

Может применяться ряд систем селекции, включающих, но не ограниченных системой генов тимидинкиназы простого вируса герпеса (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)) и аденин фосфорибозилтрансферазы (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) в клетках tk, hgprt или aprt- соответственно. Также может применяться устойчивость к антиметаболитам как основа селекции следующих генов: dhfr, который отвечает за устойчивость к метотрексату (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sd. USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, который отвечает за устойчивость к микофеноловой кислоте (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, который отвечает за устойчивость к аминогликозиду G-418 (Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991)); и hygro, который отвечает за устойчивость к гигромицину (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Способы, как правило, известные из уровня техники методик рекомбинантной ДНК, могут быть применены обычным образом для селекции желаемого рекомбинантного клона, и такие способы описаны, например, у Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. MoI. Biol. 150:1 (1981), которые полностью введены сюда с помощью ссылки.

Уровень экспрессии молекулы антитела может быть увеличен путем амплификации вектора (для обзора смотри Bebbington and Hentschel, "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells" (DNA Cloning, Vol.3. Academic Press, New York, 1987)). Когда маркер в векторной системе, экспрессирующей антитело, является амплифицируемым, то увеличение уровня ингибитора, присутствующего в культуре клетки-хозяина, будет увеличивать количество копий гена маркера. Так как амплифицированный участок ассоциирован с геном антитела, продуцирование антитела будет также увеличиваться (Grouse et al., MoI. Cell. Biol. 3:257 (1983)).

Клетка-хозяин может быть котрансфецирована двумя векторами по изобретению, первым вектором, кодирующим полипептид, выделенный из тяжелой цепи, и вторым вектором, кодирующим полипептид, выделенный из легкой цепи. Два вектора могут содержать идентичные селектируемые маркеры, которые дают возможность равной экспрессии полипептидов тяжелой и легкой цепи. Альтернативно, может применяться один вектор, который кодирует и способен к экспрессии обоих полипептидов - тяжелой и легкой цепи. В таких ситуациях легкая цепь должна быть помещена перед тяжелой цепью, чтобы избежать избытка токсической свободной тяжелой цепи (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)). Кодирующие последовательности тяжелой и легкой цепи могут включать кДНК или геномную ДНК.

Однажды полученная молекула антитела из животного, химически синтезированная или рекомбинантно экспрессированная, может быть очищена любым способом, известным из уровня техники, для очистки молекулы иммуноглобулина, например, с помощью хроматографии (например, ионно-обменной, аффинной, в особенности аффинной к определенному антигену после Протеин-А и эксклюзионной хроматографии), центрифугирования, дифференциальной растворимости или с помощью любой другой стандартной методики для очистки белков. Кроме того, антитела по настоящему изобретению или их фрагменты могут быть сшиты с последовательностями гетерологичных полипептидов, описанных здесь, или с другими известными из уровня техники для облегчения очистки.

Настоящее изобретение охватывает антитела, рекомбинантно сшитые или химически конъюгированные (включая обе - ковалентную и нековалентную конъюгации) с полипептидом. Сшитые или конъюгированные антитела по настоящему изобретению могут применяться для облегчения очистки. Смотри, например, Harbor et al., выше, и PCT публикацию WO 93/21232; EP 439,095; Naramura et al., Immunol. Lett. 39:91-99 (1994); U.S. Пат.No. 5,474,981; Gillies et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1428-1432 (1992); Fell et al., J. Immunol. 146:2446-2452(1991), которые полностью введены с помощью ссылки.

Кроме того, антитела или их фрагменты по настоящему изобретению могут быть сшиты с маркерными последовательностями, такими как пептид, для облегчения очистки. В предпочтительных воплощениях маркерная аминокислотная последовательность представляет собой среди прочих гексагистидиновый пептид, такой как фрагмент, предусмотренный в векторе pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Calif., 91311), многие из таких последовательностей являются коммерчески доступными. Как описано у Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824 (1989), например, гексагистидин предусмотрен для удобной очистки сшитого белка. Другие пептидные фрагменты, применяемые для очистки, включают, но не ограничены ими, "HA" фрагмент, который соответствует эпитопу, выделенному из белка гемагглютинина вируса гриппа (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) и "flag" фрагмент.

ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ ПРИМЕНЕНИЯ АНТИТЕЛ

Антитела по изобретению включают производные, которые модифицированы, т.е. с помощью ковалентного присоединения любого типа молекулы антитела, так что ковалентное присоединение не влияет на связывание антигена. Например, но не путем ограничения, производные антитела включают антитела, которые были модифицированы, например, с помощью биотинилирования, HRP или с помощью любого другого детектируемого компонента.

Антитела по настоящему изобретению могут применяться, например, но не ограничиваясь этими применениями, для детекции Фактора D, включая оба in vitro и in vivo диагностических способа. Например, антитела находят применение в иммуноанализах для качественного и количественного измерения уровня Фактора D в биологических образцах, полученных из глаз субъектов, страдающих связанными с глазными болезнями состояниями или заболеваниями. Обычные иммуноанализы описаны, например, у Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) (полностью введено сюда с помощью ссылки).

Как обсуждается более подробно ниже, антитела по настоящему изобретению могут применяться или индивидуально, или в комбинации с другими композициями. Антитела могут быть дополнительно рекомбинантно сшиты с гетерологичным полипептидом по N- или C-концу или могут быть химически конъюгированы (включая ковалентную и нековалентную конъюгации) с полипептидами или с другими композициям. Например, антитела по настоящему изобретению могут быть рекомбинантно сшиты или конъюгированы с молекулами, применяемыми в качестве меток в анализах по детектированию.

Настоящее изобретение дополнительно охватывает применение антител или их фрагментов, конъюгированных с диагностическим агентом, для детектирования уровня компонентов пути комплемента в глазе подвергнутого воздействию индивидуума. Антитела могут применяться в диагностических целях, например для наблюдения за развитием или прогрессией глазного состояния или болезни, как часть процедуры клинического исследования, например для определения эффективности данного режима лечения. Детекция может быть облегчена с помощью соединения антитела с детектируемым веществом. Примеры детектируемых веществ включают простетические группы, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества, биолюминесцентные вещества, радиоактивные вещества, излучающие позитроны металлы с применением различных томографий с позитронной эмиссией и не радиоактивных парамагнитных ионов металлов. Детектируемое вещество может быть присоединено или конъюгировано или непосредственно с антителом (или его фрагментом) или косвенно через посредник (такой как, например, линкер, известный из уровня техники) с применением методик, известных из уровня техники. Смотри, например, U.S. Пат. No. 4741900 для ионов металлов, которые могут быть конъюгированы с антителами для применения в качестве диагностиков согласно настоящему изобретению. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов престетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных веществ включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансил хлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного вещества включает люминол; примеры биолюминесцентных веществ включают люциферазу, люциферин и аэкворин; и примеры подходящего радиоактивного вещества включают 125I, 131I, 111In или - 99Tc.

Антитела также могут быть присоединены к твердой подложке, которая в особенности применяется для иммуноанализа или очистки антигена-мишени. Такая твердая подложка включает, но не ограничена ими, стекло, целлюлозу, полиакриламид, нейлон, полистирен, поливинилхлорид или полипропилен.

Меченые антитела и их производные и аналоги, которые специфично связываются с Фактором D, могут применяться для диагностических целей, чтобы детектировать, диагностировать или наблюдать за болезнями, заболеваниями и/или состояниями, ассоциированными с абберантной экспрессией и/или активностью Фактора D. В изобретении предлагается применение для детектирования абберантной экспрессии Фактора D, включающее (a) анализ экспрессии Фактора D в клетках или в жидкости организма индивидуума с применением одного или более антител по настоящему изобретению, специфичных к Фактору D и (b) сравнение уровня генной экспрессии со стандартным уровнем экспрессии, посредством чего увеличение или уменьшение анализируемого уровня экспрессии Фактора по сравнению со стандартным уровнем экспрессии является показателем абберантной экспрессии.

Антитела могут применяться для детектирования присутствия и/или уровня Фактора D в образце, например в глазной жидкости. Способ детектирования может включать контактирование образца с антителом к Фактору D и определение количества антитела, которое связывается с образцом.

В изобретении предлагается диагностический анализ для диагностики заболевания, включающий (a) анализ экспрессии Фактора D в клетках или в жидкости организма индивидуума с применением одного или более антител по настоящему изобретению, специфичных к Фактору D, и (b) сравнение уровня генной экспрессии со стандартным уровнем экспрессии, посредством чего увеличение или уменьшение анализируемого уровня экспрессии Фактора по сравнению со стандартным уровнем экспрессии является показателем для конкретного заболевания.

Антитела по изобретению могут применяться для анализа уровня белка в биологическом образце с применением классических иммуногистологических способов, известных из уровня техники специалисту в данной области (например, смотри Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985); Jalkanen, et al., J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Другие способы на основе антител, применяемые для детектирования экспрессии гена и белка, включают иммуноанализы, такие как твердофазный ИФА (ELISA) и радиоиммуноанализ (RIA). Подходящие метки для анализа с применением антител известны из уровня техники и включают ферментные метки, такие как глюкозоксидаза; радиоизитопы, такие как иод (125I, 121I), углерод (14C), сера (35S), тритий (3H), индий (112In) и технеций (99Tc); люминесцентные метки, такие как люминол; и флуоресцентные метки, такие как флуоресцеин и родамин, и биотин.

Один аспект по изобретению представляет собой детектирование и диагностику болезни или заболевания, ассоциированных с активацией комплемента в глазах субъекта, предпочтительно у млекопитающего, и наиболее предпочтительно у человека. В одном воплощении диагностика включает: a) забор образца из глаза пациента; b) измерение уровня компонентов комплемента, таких как C3a, или C3b, или C5a. Уровень фона может быть определен различными способами, включающими сравнение количества меченой детектированной молекулы со стандартной ранее определенной для конкретной системы величиной.

В воплощении мониторинг болезни или заболевания проводят путем повторения способа диагностики болезни или заболевания, например, через месяц после первичной диагностики, через шесть месяцев после первичной диагностики, через год после первичной диагностики и т.д.

ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ПРИМЕНЕНИЯ ИНГИБИТОРОВ ПУТИ КОМПЛЕМЕНТА

Ингибиторы пути комплемента могут водиться субъекту, страдающему глазной болезнью, такой как возрастная макулярная дегенерация. Антитело, содержащее или не содержащее терапевтический компонент, конъюгированный с ним, может применяться в терапевтических целях. Настоящее изобретение относится к применению ингибиторов пути комплемента, в особенности антител, включающему введение указанных ингибиторов животному, млекопитающему или человеку для лечения глазной болезни, заболевания или состояния, включающего активацию пути комплемента. Животное или субъект может представлять собой животное, нуждающееся в конкретном лечении, с конкретным диагностированным заболеванием, например, связанным с комплементом. Антитела, направленные против Фактора D, применяются для ингибирования заболеваний или состояний, связанных с альтернативным путем комплемента. В особенности настоящее изобретение относится к лечению AMD, диабетической ретинопатии и хориоидальной неоваскуляризации. Эффекты активации компонентов пути комплемента могут быть уменьшены или устранены у подвергнутого лечению млекопитающего, например, путем введения терапевтически приемлемой дозы антитела или антител по настоящему изобретению, или коктейля антител по настоящему изобретению, или в комбинации с другими молекулами из различных источников.

Терапевтические компоненты по изобретению включают, но не ограничены ими, антитела по изобретению (включающие фрагменты, их аналоги и производные, как здесь описано) и нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела по изобретению, как описано ниже (включающие фрагменты, их аналоги и производные, и антиидиотипические антитела, как описано здесь). Антитела по изобретению могут применяться для лечения, ингибирования или предотвращения болезней, заболеваний или состояний, ассоциированных с аберрантной экспрессией и/или активностью компонентов пути комплемента, в особенности компонентов альтернативного пути, и в особенности Фактора D. Лечение и/или предотвращение болезней, заболеваний или состояний, ассоциированных с аберрантной экспрессией и/или активностью Фактора D, включает, но не ограничено ими, облегчения, по меньшей мере, одного симптома, ассоциированного с этими болезнями, заболеваниями или состояниями. Антитела по изобретению могут предлагаться в виде фармацевтически приемлемых композиций, как известно из уровня техники или как описано в описании изобретения.

Количество антитела, которое эффективно при лечении, ингибировании и предотвращении болезни или заболевания, ассоциированных с аберрантной экспрессией и/или активацией компонентов пути комплемента, может быть определено с помощью стандартных клинических методик. Антитело может вводиться в режим лечения согласно болезни, например, в виде одной или нескольких доз от одного до нескольких дней для улучшения состояния болезни, или антитело может вводиться периодическими дозами в течение продолжительного времени для предотвращения глазных болезней или состояний.

Кроме того, in vitro анализы необязательно могут применяться для того, чтобы помочь идентификации оптимальных пределов дозировки. Точная доза, которую следует применять в составе, также будет зависеть от пути введения и серьезности болезни или заболевания и должна быть определена согласно решению практикующего врача и согласно обстоятельствам каждого конкретного пациента. Эффективные дозы могут быть экстраполированы исходя из кривых доза-ответ, выделенных на основе in vitro модельных тест-систем или модельных тест-систем животных.

Для антител дозировки, вводимые пациенту, обычно составляют от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг от веса тела пациента. Предпочтительно дозировка, вводимая пациенту, составляет между 0,1 мг/кг и 20 мг/кг от веса тела пациента, более предпочтительно 1 мг/кг-10 мг/кг от веса тела пациента. Обычно человеческие антитела имеют больший период полужизни внутри тела человека, чем антитела из других видов, благодаря иммунному ответу на чужеродные полипептиды. Таким образом, часто являются возможными более низкие дозировки человеческих антител и меньшая частота введений. Кроме того, дозировка и частота введений антител по изобретению могут быть уменьшены путем усиления усвоения и проницаемости в ткани (например, в мозг) антител с помощью модификаций, таких как, например, липидизация. В предпочтительном аспекте антитело является по существу очищенным (например, по существу свободным от веществ, которые ограничивают его эффект или производят нежелательные побочные эффекты).

Известны различные системы доставки, и они могут применяться для введения антитела по настоящему изобретению, системы доставки, включающие инъекцию, например инкапсуляцию в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные к экспрессии компонента, рецептор-опосредованный эндоцитоз (смотри, например, Wu et al., J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), конструкцию нуклеиновой кислоты, как части ретровирусного или другого вектора и т.д.

Антитело может быть введено млекопитающему любым приемлемым способом. Способы введения включают, но не ограничены ими, интрадермальный, внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, внутриносовой, эпидуральный, ингаляционный и пероральный пути введения. Однако для цели настоящего изобретения предпочтительным путем введения является внутриглазной.

Введение может быть систематическим или локальным. Кроме того, может быть желательным вводить терапевтические антитела или композиции по изобретению в центральную нервную систему любым подходящим путем, включающим интравентрикулярную или интратекальную инъекцию; интравентрикулярная инъекция может быть облегчена с помощью интравентрикулярного катетера, например, присоединенного к резервуару, такому как резервуар Оммайя.

В другом воплощении антитело может быть доставлено в везикуле, в особенности в липосоме (смотри Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp.353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp.317-327; смотри в основном там же).

Еще в одном воплощении антитело может быть доставлено в системе с контролируемым высвобождением. В одном воплощении может применяться насос (смотри Langer, выше; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). В другом воплощении могут применяться полимерные вещества (смотри Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, FIa. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); смотри также Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg. 71:105 (1989)). Еще в одном воплощении система с контролируемым высвобождением может быть помещена вблизи от терапевтической мишени.

В настоящем изобретении также предлагаются фармацевтические композиции, применяемые в настоящем способе. Такие композиции включают терапевтически эффективное количество антитела и физиологически приемлемый носитель. В конкретном воплощении термин "физиологически приемлемый" обозначает утвержденный регулирующим Федеральным ведомством или регулирующим ведомством под властью штата или присутствующий в списке U.S. Фармакопеи или в другом списке, обычно признаваемом фармакопеей для применения у животных и более конкретно у человека. Термин "носитель" обозначает разбавитель, адъювант, вспомогательное вещество или носитель, с которым вводится терапевтический агент. Такие физиологические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода или масла, включающие масла с происхождением из нефти, животного, растения или с синтетическим происхождением, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и подобные. Вода является предпочтительным носителем, когда фармацевтическая композиция вводится внутривенно. Солевые растворы и водный раствор декстрозы, растворы глицерина также могут применяться в качестве жидких носителей, в особенности для растворов для инъекций. Подходящие фармацевтические вспомогательные вещества включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое снятое молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и подобные. Композиция, если желательно, также может содержать минорные количества увлажняющих или эмульгирующих агентов или буферных агентов для приведения pH. Эти композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с непрерывным высвобождением и подобные. Композиция может быть включена в состав в виде суппозитория с традиционными связующими веществами и носителями, такими как триглицериды. Пероральный состав может включать стандартные носители, такие как фармацевтические категории маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, целлюлозы, карбоната магния и т.д. Примеры подходящих носителей описаны у E.W. Martin "Remington's Pharmaceutical Sciences". Такие композиции содержат эффективное количество антитела, предпочтительно в очищенной форме вместе с подходящим количеством носителя, так чтобы обеспечить форму для правильного введения пациенту. Состав должен соответствовать способу введения.

В одном воплощении композиция включена в состав в соответствии с обычными процедурами, как фармацевтическая композиция, адаптированная для внутривенного введения людям. Обычно композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. Где необходимо, композиция может включать солюбилизирующий агент и локальный анестетик, такой как лигнокаин, для облегчения боли в месте инъекции. Обычно ингредиенты поставляются или отдельно, или смешанные вместе в единой дозированной форме, например в виде сухого лиофилизованного порошка или в виде безводного концентрата в герметично упакованном контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного агента. Там, где композицию следует вводить с помощью инфузии, она может быть снабжена инфузионным флаконом, содержащим стерильную воду или солевой раствор фармацевтической категории. Там, где композицию вводят с помощью инъекции, она обеспечивается ампулой со стерильной водой для инъекции или солевым раствором.

В изобретении также предлагается фармацевтическая группа или набор, включающий один или более контейнеров, заполненных одним или более ингредиентов фармацевтической композиции по изобретению. Необязательно такой контейнер(ы) может сопровождаться замечанием в форме, предписанной государственным органом, регулирующим производство, применение или продажу лекарственных средств или биологических продуктов, причем замечание отражает утвержденное производственной организацией применение или продажу для введения человеку.

Кроме того, антитела по настоящему изобретению могут быть конъюгированы с различными эффекторными молекулами, такими как гетерологичные полипептиды, лекарственные средства, радионуклеотиды или токсины. Смотри, например, PCT публикации WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; U.S. Пат. No. 5314995; EP 396387. Антитело или его фрагмент могут быть конъюгированы с терапевтическим компонентом, таким как цитотоксин, например цитостатический или цитоцидный агент, тарапевтический агент или радиоактивный ион металла, например альфаизлучатель, такой как, например, 213Bi. Цитотоксин или цитотоксический агент включает любой агент, который является губительным для клеток. Примеры включают паклитаксол, цитохалазин В, грамицидин D, этидиум бромид, эметин, митомицин, этопосид, тенопосид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, динидроксиантрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги и гомологи. Терапевтические агенты включают, но не ограничены ими, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэтамин, тиотепа хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусулфан, дибромманнит, стрептозотоцин, митомицин C и цис-дихлордиамин платина (II) (DDP) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (известный как дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (известный как актиномицин), блеомицин, митрамицин и антрамицин (AMC)) и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин).

Методики конъюгации такого терапевтического компонента с антителами хорошо известны, смотри, например, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp.243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp.623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp.475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp.303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982). Альтернативно, антитело может быть конъюгировано со вторым антителом с образованием гетероконъюгата (смотри, например, Segal in U.S. Пат. No. 4676980).

Конъюгаты по изобретению могут применяться для модификации данного биологического ответа, причем терапевтический агент или лекарственный компонент не должны быть истолкованы как ограничивающиеся классическими химическими терапевтическими агентами. Например, лекарственный компонент может представлять собой белок или полипептид, обладающий желаемой биологической активностью. Такие белки могут включать, токсин, такой как абрин, рицин А, синегнойный экзотоксин или дифтерийный токсин; белок, такой как Фактор некроза опухоли, α-интерферон, β-интерферон, Фактор роста нервов, тромбоцитарный Фактор роста, активатор тканевого плазминогена, апопптозный агент, например TNF-α, TNF-β, AIM I (смотри Международную Публикацию No. WO 97/33899), AIM II (смотри Международную Публикацию No. WO 97/34911), Fas Лиганд (Takahashi et al., Int. Immunol., 6:1567-1574 (1994)), VEGI (смотри Международную Публикацию No. WO 99/23105), тромботический агент или антиангиогенный агент, например ангиостатин или эндостатин; или модификаторы биологического ответа, такие как, например, лимфокины, интерлейкин-1 ("IL-I"), интерлейкин-2 ("IL-2"), интерлейкин-6 ("IL-6"), гранулоцит макрофаг колониестимулирующий Фактор ("GM-CSF"), гранулоцит колониестимулирующий Фактор ("G-CSF") или другие Факторы роста.

ГЕННАЯ ТЕРАПИЯ НА ОСНОВЕ АНТИТЕЛА

В другом аспекте изобретения нуклеиновые кислоты, включающие последовательности, кодирующие антитела или их связывающие фрагменты, вводят для лечения, ингибирования или предотвращения болезни или заболевания, ассоциированных с аберрантной экспрессией и/или активацией компонентов пути комплемента, путем генной терапии. Генная терапия обозначает терапию, осуществляемую путем введения субъекту экспрессирующейся или способной к экспрессии нуклеиновой кислоты. В этом воплощении изобретения нуклеиновые кислоты продуцируют кодируемый ими белок, который опосредует терапевтический эффект. Любые из доступных способов генной терапии могут применяться согласно настоящему изобретению. Приведенные для примера способы описаны ниже.

Для основных обзоров способов генной терапии смотри Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIBTECH 11(5):155-215 (1993).

В одном аспекте компонент включает последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие антитело, причем указанные последовательности нуклеиновой кислоты являются частью экспрессирующих векторов, которые экспрессируют антитело, или его фрагменты, или его химерные белки, или его тяжелые или легкие цепи в подходящем хозяине. В особенности такие последовательности нуклеиновой кислоты имеют промоторы, функционально связанные с участком, кодирующим антитело, причем указанный промотор является индуцируемым или конститутивным и необязательно тканеспецифичным.

В другом конкретном воплощении применяются молекулы нуклеиновой кислоты, в которых последовательности, кодирующие антитело, и любые другие желаемые последовательности фланкированы участками, которые стимулируют гомологичную рекомбинацию в желаемом сайте генома, таким образом, обеспечивая внутрихромосомную экспрессию нуклеиновых кислот, кодирующих антитело (Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989). В конкретных воплощениях экспрессированная молекула антитела представляет собой одноцепочечное антитело; альтернативно, последовательности нуклеиновой кислоты включают последовательности, кодирующие обе цепи антитела - тяжелую и легкую, или их фрагменты.

Доставка нуклеиновых кислот пациенту может быть или прямой, в этом случае пациент непосредственно подвергается воздействию нуклеиновой кислоты или векторов, несущих нуклеиновую кислоту, или косвенной, в этом случае клетки сначала трансформируют нуклеиновыми кислотами in vitro, затем трансплантируют пациенту. Эти два способа известны соответственно как in vivo или ex vivo генная терапия.

В конкретном воплощении, последовательности нуклеиновой кислоты вводят непосредственно in vivo, где она экспрессируется, продуцируя кодируемый продукт. Это может быть осуществлено с помощью любых из многочисленных способов, известных из уровня техники, например путем конструирования нуклеиновых кислот как части подходящего вектора, экспрессирующего нуклеиновую кислоту, и его введения так, что они становятся внутриклеточными, например путем инфекции с применением ретровирусных векторов на основе дефектных или ослабленных вирусов или других вирусных векторов (смотри U.S. Пат. No. 4980286), или путем непосредственной инъекции свободной ДНК, или путем применения бомбардировки микрочастиц (например, генной пушки; Biolistic, Dupont), или с помощью покрытия липидами, или с помощью рецепторов клеточной поверхности, или трансфецирующих агентов, с помощью инкапсуляции в липосомы, микрочастицы или микрокапсулы, или путем их введения в связанном состоянии с пептидом, о котором известно, что он проникает в ядро, путем их введения связанными с лигандом, при условии опосредованного рецептором эндоцитоза (смотри, например, Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)) (способ, который может применяться для направленного взаимодействия с клеточными типами, специфически экспрессирующими рецепторы), и т.д. В другом воплощении могут быть образованы комплексы нуклеиновая кислота - лиганд, в которых лиганд включает фузогенный вирусный пептид для разрушения эндосом, что дает возможность нуклеиновой кислоте избежать лизосомной деградации. Еще в одном воплощении нуклеиновая кислота может быть подвергнута воздействию in vivo для клеточно-специфичного поглощения и экспрессии путем воздействия на конкретный рецептор (смотри, например, PCT Публикации WO 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316; WO 93/14188, WO 93/20221). Альтернативно, нуклеиновая кислота может быть введена внутриклеточно и для экспрессии введена в ДНК клетки-хозяина с помощью гомологичной рекомбинации (Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)).

В конкретном воплощении могут применяться вирусные векторы, которые содержат последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие антитело по изобретению (смотри Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Эти ретровирусные векторы содержат компоненты, необходимые для корректной упаковки вирусного генома и интеграции в ДНК клетки-хозяина. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие антитело, используемые в генной терапии, клонируют в один или более векторов, которые облегчают доставку гена пациенту. Более подробную информацию о ретровирусных векторах можно обнаружить у Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), где описано применение ретровирусного вектора, который осуществляет доставку гена mdrl в гематопоэтические стволовые клетки для того, чтобы сделать стволовые клетки более устойчивыми к химиотерапии. Другие ссылки, иллюстрирующие применение ретровирусных векторов в генной терапии описаны в: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); and Grossman and Wilson, Curr. Opin. Gen. and Dev. 3:110-114 (1993).

Аденовирусы также могут применяться в настоящем изобретении. Аденовирусы являются особенно привлекательными носителями по настоящему изобретению для доставки антител в клетки эпителия дыхательного пути. Аденовирусы естественно инфицируют клетки эпителия дыхательного пути. Другими мишенями для систем доставки на основе аденовируса являются печень, центральная нервная система, эндотелиальные клетки и мышца. Аденовирусы имеют преимущество, так как способны инфицировать не делящиеся клетки. У Kozarsky and Wilson, Curr. Opin. Gen. Dev. 3:499-503 (1993) представлен обзор генной терапии на основе аденовируса. У Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) продемонстрировано применение аденовирусных векторов для переноса генов к клеткам эпителия дыхательного пути макак-резус. Другие примеры применения аденовируса в генной терапии могут быть обнаружены у Rosenfeld et al., Science 252:431- 434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest.91:225-234 (1993); PCT Публикации WO94/12649; and Wang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995). Адено-ассоциированный вирус (AAV) также может быть предложен для применения в генной терапии (Walsh et al., Proc. Soc. Exp.Biol. Med. 204:289-300 (1993); U.S. Пат. No. 5436146; 6632670; 6642051).

Другой способ генной терапии включает перенос гена к клеткам в тканевой культуре такими способами, как электропорация, липофекция, опосредованная фосфатом кальция трансфекция или вирусная инфекция. Обычно способ для переноса включает перенос селектируемого маркера к клеткам. Клетки затем подвергают селекции для выделения тех клеток, которые получили перенесенный ген, и экспрессируют его. Эти клетки затем доставляются пациенту.

В этом воплощении нуклеиновую кислоту вводят в клетку перед введением in vivo полученной в результате рекомбинантной клетки. Такое введение может быть проведено с помощью способа, известного из уровня техники, включающего, но не ограниченного ими, трансфекцию, электропорацию, микроинъекцию, инфекцию вирусным вектором или вектором бактериофага, содержащим последовательности нуклеиновой кислоты, слияние клеток, хромосом-опосредованный перенос гена, микроклеточно-опосредованный перенос гена, слияние сферопластов и т.д. Многочисленные методики введения чужеродных генов в клетки известны из уровня техники (смотри, например, Loefflerand Behr, Meth. Enzymol.217:599-618 (1993); Cohen et al., Meth. Enzymol. 217:618-644 (1993); Cline, Pharmac. Ther. 29:69-92m (1985) и могут применяться в соответствии с настоящим изобретением при условии, что не нарушены физиологические и связанные с развитием функции клеток-реципиентов. Методика должна обеспечивать стабильный перенос нуклеиновой кислоты в клетку, так чтобы нуклеиновая кислота экспрессировалась потомством этой клетки.

Полученные в результате рекомбинантные клетки могут быть доставлены пациенту различными способами, известными из уровня техники. Рекомбинантные клетки крови (например, гематопоэтические стволовые или клетки-предшественники) предпочтительно вводят внутривенно. Предполагаемое количество клеток для применения зависит от желаемого эффекта, состояния пациента и т.д. и может быть определено специалистом в данной области.

Клетки, в которые была введена нуклеиновая кислота для целей генной терапии охватывают любой желаемый, доступный клеточный тип и включают, но не ограничены ими, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, кератиноциты, фибробласты, мышечные клетки, гепатоциты; клетки крови, такие как Т лимфоциты, В лимфоциты, моноциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, мегакариоциты, гранулоциты; различные стволовые и клетки-предшественники, например, полученные из костного мозга, из крови пуповины, эмбриональной печени и т.д.

В одном воплощении клетка, применяемая для генной терапии, является аутологичной пациенту. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие антитело по настоящему изобретению, вводят в клетки, так чтобы они экспрессировались клетками или их потомством, и рекомбинантные клетки затем вводят in vivo для терапевтического эффекта. Любые стволовые и/или клетки-предшественники, которые могут быть выделены и поддержаны In vitro, потенциально могут применяться в этом воплощении по настоящему изобретению (смотри, например PCT Публикацию WO 94/08598; Stemple and Anderson, Cell 71:973-985 (1992); Rheinwald, Meth. Cell Bio.21A:229 (1980); and Pittelkowand Scott, Mayo Clinic Proc. 61:771 (1986)).

МОДУЛИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ КОМПОНЕНТА ПУТИ КОМПЛЕМЕТА С ПОМОЩЬЮ КИРНК

Было доказано, что киРНК применимы в качестве инструмента при исследованиях модулирования генной экспрессии, где традиционные антагонисты, такие как малые молекулы или антитела, могут быть менее эффективны (Shi Y., Trends in Genetics 19(1):9-12 (2003)). In vitro синтезированные, двухцепочечные РНК длиной 21-23 нуклеотида могут действовать как интерферирующие РНК (иРНК) и могут специфично ингибировать генную экспрессию (Fire A., Trends in Genetics 391; 806-810 (1999)). Эти иРНК действуют путем опосредования деградации их РНК-мишеней. Поскольку их длина составляет до 30 нуклеотидов, они не могут инициировать механизм клеточной антивирусной защиты. Такие механизмы включают продуцирование интерферона и общее выключение синтеза белка клетки-хозяина. Практически киРНК могут быть синтезированы и затем клонированы в ДНК векторов. Такие векторы могут быть трансфецированы и заставляют экспрессироваться киРНК на высоком уровне. Высокий уровень экспрессии киРНК применяется для "нокдауна" или значительно уменьшает количество белка, продуцируемого в клетке, и, таким образом, это применяется в экспериментах, где предполагается, что сверхэкспрессия белка связана с таким заболеванием, как злокачественное заболевание. киРНК применяются в качестве антагонистов белков пути комплемента и действуют путем ограничения продуцирования клеткой антигена и ингибирования активации каскада комплемента.

ПЕПТИДОМИМЕТИКИ И МОЛЕКУЛЫ С НИЗКИМ МОЛЕКУЛЯРНЫМ ВЕСОМ

Хорошо известно специалистам в данной области, что возможно заменять пептиды пептидомиметиками. Пептидомиметики по отношению к пептидам обычно являются предпочтительными в качестве терапевтических агентов, обладающих усиленной биодоступностью и относительным отсутствием атак со стороны протеолитических ферментов. Методики молекулярного моделирования могут применяться для конструирования пептидомиметиков, которые подражают структуре связанных с комплементом пептидов, описанных здесь. Соответственно, в настоящем изобретении также предлагаются пептидомиметики и другие компоненты-прототипы, которые могут быть идентифицированы на основе данных, полученных из структурного анализа белка пути комплемента. Потенциальный аналог Фактора D может быть определен посредством применения компьютерного моделирования, применяющего программу соответствия, такую как GRAM, DOCK или AUTODOCK. Эта процедура может включать компьютерный подбор аналогов Фактора D. Компьютерные программы также могут применяться для оценки притяжения, отталкивания и стерических препятствий аналога с потенциальным сайтом связывания. Обычно строгий подбор (например, меньшие стерические препятствия и/или большая сила притяжения) наиболее сильного потенциального лекарственного средства будет иметь место, если эти свойства будут согласоваться с жесткой константой связывания. Кроме того, большая специфичность в дизайне потенциального наиболее вероятного лекарственного средства будет иметь место, если свойства лекарственного средства не будут противоречить другим свойствам экспрессирующей системы. Это минимизирует потенциальные побочные эффекты благодаря нежелательным взаимодействиям с другими белками.

Исходно может быть получен потенциальный аналог Фактора D с помощью скрининга библиотеки случайных пептидов, продуцируемых, например, рекомбинантным бактериофагом, или с помощью скрининга химической библиотеки. Аналог - лиганд, селектированный таким способом, может быть систематически модифицирован с помощью программ компьютерного моделирования до тех пор, пока не будет идентифицирован один или более подающих надежды потенциальных лигандов.

Такое компьютерное моделирование дает возможность селекции ограниченного количества рациональных химических модификаций в противоположность многочисленному количеству, по существу, случайных химических модификаций, которые могут быть произведены и из которых любая модификация может привести к получению применимого лекарственного средства. Таким образом, применение трехмерной структуры, описанной здесь, и компьютерного моделирования скринируется большое количество соединений, и несколько вероятных кандидатов могут быть определены без лабораторного синтеза бесчисленного количества соединений.

Однажды идентифицированный потенциальный аналог Фактора D может быть или селектирован из библиотеки химических соединений, коммерчерски доступной от большинства химических компаний, включая Merck, Glaxo Welcome, Bristol Meyers Squib, Monsanto/Searle, EH Lilly, Novartis и Pharmacia UpJohn, или альтернативно потенциальный лиганд синтезируется de novo. Как указано выше, синтез de novo одного или даже относительно небольшой группы конкретных соединений является рациональным исходя из уровня техники дизайна лекарственных средств.

Альтернативно, на основе молекулярных структур вариабельных участков антител к Фактору D можно применять молекулярное моделирование и рациональный молекулярный дизайн для получения и скрининга малых молекул, которые подражают молекулярным структурам участков связывания антител и ингибируют активность Фактора D. Эти малые молекулы могут представлять собой пептиды, пептидомиметики, олигонуклеотиды или органические соединения.

ПРИМЕР

Эффективность Антитела в индуцированной лазером хориоидальной неоваскуляризации (CNV) как модели влажной формы AMD.

Эффективность внутриглазных инъекций антитела может быть протестирована в модели CNV при повреждении лазером, как описано ранее у Krzystolik MG et al. (Arch Ophthalm. 2002; 120: 338-346). Эта модель может применяться для тестирования эффективности любого лекарственного средства - кандидата для предотвращения и/или улучшения при AMD. В этой индуцированной лазером модели CNV применяется аргоновый лазер зеленого диапазона для индукции CNV в макуле обезьяны. Существует хорошая корреляция между количеством CNV повреждений и ангиографической картиной просачивания.

Существуют две фазы исследований: Фаза 1, предотвращающая фаза, включает начало лечения антителом перед лазерной индукцией CNV и через одну неделю после воздействия лазером для ингибирования образования CNV, которая обычно появляется через 2-3 недели после повреждения лазером. Фаза 2, фаза лечения, начинается на 42 день (через 3 недели после повреждения лазером), когда CNV повреждения будут ожидаться в контрольных глазах из фазы 1. Фаза 2 определяет эффект лечения на ослабление степени существующих CNV повреждений и на ослабление просачивания существующих CNV повреждений.

Десять макак-крабоедов (Macaca fascicularis) обычно применяли в исследовании такого типа. Обезьянам делали анестезию во время всех процедур с помощью внутримышечных инъекций, например, гидрохлоридом кетамина (20 мг/кг); малеатом ацепромазина (0,125 мг/кг) и сульфатом атрофина (0,125 мг/кг). По необходимости вводили дополнительную анестезию 5-6 мг/кг гидрохлоридом кетамина. Кроме того, для местной анестезии обычно применяли 0,5% гидрохлорид пропаракаина. Перед энуклеацией могла вводиться дополнительная анестезия внутривенно раствором пентобарбитала натрия (5 мг/кг). Животных подвергали эвтаназии после проведения эксперимента.

ЛЕЧЕНИЕ С ПРИМЕНЕНИЕМ АНТИТЕЛА

Тестируемое антитело вводили в физиологическом буфере в концентрации, например, примерно 10 мкг/мкл. В контрольный глаз осуществляли инъекцию носителя, состоящего из всех компонентов, за исключением тестируемого антитела. Внутриглазные инъекции, например, примерно 50 мкл на глаз или с антителом, или с носителем осуществляли в каждый глаз, соответственно, через гладкую часть ресничного тела (pars plana) с применением иглы c калибром 30 и туберкулинового шприца после местной капельной анестезии и введения раствора 5% повидон-йода. Антитело извлекали из флакона через 5 мкм фильтр и для внутриглазной инъекции применяли новую (остроконечную) иглу калибра 30. После инъекции капельно вводили в своды головного мозга бактерицидную глазную мазь, такую как бацитрацин. Сайты инъекции обычно варьировали, чтобы избежать травмы склеры.

В фазе 1 случайно выбирали правый или левый глаз животного для введения внутриглазных инъекций антитела в дозе, например, примерно 500 мкг (50 мкл на глаз) и этот глаз обозначали как предохраненный глаз. Применяемая доза может быть определена на основе исследования безопасности и токсикологии перед данным исследованием эффективности или с помощью других подходящих клинических способов. Другой глаз выбирали для получения внутриглазных инъекций носителя и обозначали как контрольный глаз. Оба глаза каждого животного обычно получали две внутриглазные инъекции или с тестируемым антителом, или только с носителем в дни 0 и 14 перед обработкой лазером. На 21 день все глаза подвергали аргоновой лазерной фотокоагуляции в зеленом диапазоне для индукции CNV повреждений. На 28 день, через неделю после лазерной индукции предохраненный глаз получал другую инъекцию с антителом, и контрольный глаз получал инъекцию с носителем. Фазу 2 исследования начинали на 42 день или через 3 недели после лазерной индукции, когда ожидалось развитие CNV. После флуоресцентной ангиографии на 42 день оба глаза каждого животного получали внутриглазные инъекции антитела в дозе, например, примерно 500 мкг (50 мкл на глаз), и это повторялось на 56 день.

ИНДУКЦИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ CNV

CNV мембраны индуцировали в макуле макак-крабоедов с помощью лазерных лучей зеленого диапазона (Coherent Argon Dye Laser 920; Coherent Medical Laser, Palo Alto, Calif) с применением щелевой лампы и мягких контактных фундус-линз. Девять повреждений симметрично располагали в макуле каждого глаза с помощью закрытого маской хирурга. Лазерные переменные включают: размер пятна 50-100 мкм, длительность - 0,1 секунд и мощность в пределах от 350 до 700 мВт. Применяемую мощность определяли с помощью лазерной способности производить волдырь и небольшое кровоизлияние при выбранной энергии. Если кровоизлияния не замечали, то рядом с первым пятном располагали дополнительное лазерное пятно после такой же лазерной процедуры. Цветные фотографирования и флуоресцентную ангиографию обычно применяли для детекции и измерения степени CNV и просачивания CNV. Однако может применяться способ, способный измерять индуцированную лазером CNV и ассоциированные с ней эффекты.

ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАЗНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ

Глаза животных проверяли на относительный пупиллярный афферентный дефект и затем расширяли с помощью 2,5% фенилэфрина и 0,8% тропикамида. Оба глаза исследовали с применением биомикроскопии с щелевой лампой и косвенной офтальмоскопии в дни 0, 14, 28, 42 и 56 (перед инъекцией антитела); дни 1, 15, 29, 43 и 57 (после инъекции); в день 21 (перед обработкой лазером); дни 35 и 49 (промежуточные дни) и в день 63 (энуклеация и смерть).

ЦВЕТНОЕ ФОТОГРАФИРОВАНИЕ И ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ АНГИОГРАФИЯ

Фотографирование глазного дна обычно осуществляли у всех животных в те же дни, что и исследование глазных изменений. Фотографии можно было получить с применением фундус-камеры (Canon Fundus CF-60Z; Canon USA Inc, Lake Success, NY) пленки 35-мм, но можно было применять любой инструмент для фотографирования.

Imagenet Система Цифровой Ангиографии (Topcon 501 A и Imagenet система; Topcon America Corp, Paramus, NJ) может применяться для флуоресцентной ангиографии. Фотографии обоих глаз при отсутствии эффекта красных глаз обычно получали с помощью флуоресцентной ангиографии с применением 0,1 мл/кг от веса тела 10% флуоресцеина натрия (Akorn Inc, Abita Springs, La) со скоростью 1 мл/с. После инъекции флуоресцеина в первую минуту получали быстрые серии фотографий сначала заднего полюса правого глаза и затем левого глаза. Дополнительные пары фотографий обычно получали приблизительно через 1-2 и 5 минут. В период времени между 2 и 5 минутами получали две фотографии среднепериферических областей (височной и назальной) каждого глаза. Флуоресцентную ангиографию осуществляли на исходном уровне (день 0) и дни 7, 14, 29, 42, 49, 57 и 63.

АНАЛИЗ ОФТАЛЬМОЛОГИЧЕСКИХ ДАННЫХ

Фотографии и ангиограммы оценивали по очевидности ангиографического просачивания, кровоизлияний или любых других аномалий. Кровоизлияния глазного дна распределяли на основе системы распределения кровоизлияний сетчатки, которая включает менее чем 3 дисковых области, определяли как 1-я степень, кровоизлияния в 3-6 дисковых областях как 2-я степень и кровоизлияния в более чем 6 дисковых областях определяли как 3-я степень. Также оценивали связь кровоизлияний с CNV мембранами или сайтом лазерной индукции. Клинически значимые кровотечения определяли как любое кровоизлияние на глазном дне, большее чем или равное 6 дисковым областям.

Глазное воспаление также оценивали с применением биомикроскопии с щелевой лампой. Клетки передней камеры глаза и витреальные клетки считали с помощью щелевой лампы 2-мм с высоким увеличением и распределяли с применением схемы Американской Академии Офтальмологии. CNV повреждения распределяли с помощью просмотра флуоресцентных ангиограмм, осуществленных в дни 35, 42, 49, 56 и 63 опытными исследователями, обычно двумя, проводившими распределение согласно консенсусному мнению. CNV повреждения распределяли согласно следующей схеме с применением стандартизованных ангиографий для сравнения. 2-я степень повреждения проявляет гиперфлуоресценцию без просачивания. 3-я степень повреждений показывает гиперфлуоресценцию на ранней или среднепромежуточных фотографиях и позднее просачивание. 4-я степень повреждений показывает яркую гиперфлуоресценцию в промежуточном и позднем просачивании позади обработанных областей. 4-я степень повреждений определяли как клинически значимую.

Статистический анализ может быть осуществлен с применением Панели Данных, Собранных из Популяции с помощью Обобщенных Оценочных Уравнений и коэффициента частоты заболеваний (IRR). Коэффициент частоты заболеваний обычно определяют как количество повреждений 4-й степени, которые встречаются во время данного интервала, деленное на общее количество индуцированных повреждений. В фазе 1 IRR обозначает отношение коэффициента частоты заболеваний повреждений 4-й степени в предохраненных глазах к коэффициенту частоты заболеваний в контрольных глазах. IRR со значением 1 обозначает отсутствие различий между коэффициентами частоты заболеваний. Число гораздо меньшее, чем 1 указывает на уменьшение заболеваний при повреждениях 4-й степени в предохраненной группе против контрольной группы. В фазе 2 сравнивают заболевания при повреждениях 4-й степени в контрольных глазах против подвергнутых лечению глаз. Это обозначает, что заболевания при повреждениях 4-й степени сравнивают в течение всего времени в наборе глаз, которые сначала были определены в контрольную группу, но в дни 42 и 56 подвергнуты лечению антителом и определены как глаза, подвергнутые лечению.

СКРИНИНГ НА ПРЕДМЕТ АГЕНТОВ, ПРИМЕНЯЕМЫХ В ЛЕЧЕНИИ AMD

Исследование и лечение возрастной макулярной дегенерации (AMD) может быть осуществлено с применением новой модели на животном, включающей мышей, дефицитных или по хемоатрактанту моноцитов - белку-1 (Ccl-2; также известному как MCP-I) или дефицитных по его родственному C-C рецептору-2 хемокинов (Ccr-2) (Ambati, J. et al. Nat Med. 2003 Nov; 9(l l):1390-7. Epub 2003 Oct 19). У этих мышей развиваются кардинальные черты AMD, включающие накопление липофусцина в ретинальном пигментированном эпителии и накопление друз ниже ретинального пигментированного эпителия (RPE), атрофию фоторецептора и хориоидальную неоваскуляризацию (CNV).

Лечение этих мышей с желаемым агентом может дать возможность определения эффективности такого агента в лечении AMD.

Группа изобретений относится к медицине, а именно к офтальмологии, и может быть использована при лечении глазных болезней. Способы по изобретению включают введение ингибитора пути комплемента с подавлением активности С2а, С3a, С5, С5а, С5b, С7, С8 или С9. Также способы по изобретению касаются ингибирования альтернативного пути комплемента путем введения Фактора Н, или его функционального пептида, или киРНК, специфичной для белка пути комплемента, или нуклеиновой кислоты, кодирующей ингибитор пути комплемента. Использование изобретений позволяет лечить заболевания глаз за счет подавления активации классического и альтернативного путей комплемента. 4 н. и 35 з.п. ф-лы.

1. Способ предотвращения или облегчения глазной болезни у субъекта, включающий стадию введения ингибитора пути комплемента субъекту, нуждающемуся в таком введении, где ингибитор ингибирует активность С2а, С3а, С5, С5а, С5b, С7, С8 или С9.

2. Способ предотвращения или облегчения глазной болезни у субъекта, включающий стадию введения ингибитора пути комплемента субъекту, нуждающемуся в таком введении, где путь комплемента представляет собой альтернативный путь комплемента, где ингибитором является Фактор Н или его функциональный пептид или ингибирует активность фактора В, фактора Вa, фактора Вb или фактора D.

3. Способ по п.1 или 2, где глазную болезнь выбирают из группы, состоящей из дегенерации желтого пятна, диабетической ретинопатии и глазного ангиогенеза.

4. Способ по п.3, где субъекту требуется ингибирование глазной неоваскуляризации, которое воздействует на собственно сосудистую оболочку глаза, ретинальный пигментированный эпителий или ретинальную ткань.

5. Способ по п.1 или 2, где ингибитор пути комплемента представляет собой антитело, белок, пептид, пептидомиметик или молекулу с низким молекулярным весом.

6. Способ по п.1 или 2, где ингибитор пути комплемента представляет собой антитело или его связывающий фрагмент.

7. Способ по п.6, где ингибитор пути комплемента представляет собой фрагмент антитела, включающий Fab, Fab', F(ab')2, Fv, или одноцепочечный фрагмент Fv.

8. Способ по п.6, где ингибитор пути комплемента представляет собой однодоменное антитело.

9. Способ по п.6, где ингибитор пути комплемента представляет собой моноклональное антитело.

10. Способ по п.6, где ингибитор пути комплемента представляет собой химерное антитело, деимунизированное, гуманизированное, приматизированное или человеческое антитело.

11. Способ по п.6, где антитело или его связывающий фрагмент специфично связывается с компонентом альтернативного пути комплемента.

12. Способ по п.11, где антитело или его связывающий фрагмент, специфично связывается с Фактором D, Фактором В, Фактором Ва или Фактором Вb.

13. Способ по п.12, где антитело или его связывающий фрагмент специфично связывается с Фактором D.

14. Способ по п.13, где антитело представляет собой моноклональное антитело 166-32, полученное из гибридомы, депонированной в АТСС, и обозначенной НВ 12476.

15. Способ по п.13, где антитело или его связывающий фрагмент специфично связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело 166-32, полученное из гибридомы, депонированной в АТСС и обозначенной HВ 12476.

16. Способ по п.13, где антитело представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, выделенное из антитела 166-32, полученного из гибридомы, депонированной в АТСС и обозначенной НВ 12476.

17. Способ по п.6, где антитело или его связывающий фрагмент специфично связывается с компонентом классического или лектинового путей комплемента.

18. Способ по п.17, где антитело или его связывающий фрагмент специфично связывается с С2а, С3а, С5, С5а, С5b, С7, С8 или С9.

19. Способ по п.17, где антитело или его связывающий фрагмент специфично связывается с компонентом комплемента С5а.

20. Способ по п.19, где антитело представляет собой антитело 137-26, полученное из гибридомы, депонированной в АТСС и обозначенной РТА-3650.

21. Способ по п.19, где антитело или его связывающий фрагмент специфично связывается с тем же эпитопом, что и антитело 137-26, полученное из гибридомы, депонированной в АТСС и обозначенной РТА-3650.

22. Способ по любому из пп.1,2 и 6-21, где ингибитор пути комплемента вводят посредством парентерального введения, перорального введения, энтерального введения, внутриглазного введения, введения в стекловидное тело, субконъюнктивального введения, интрадермального введения, внутримышечного введения, интраперитонеального введения, внутривенного введения, подкожного введения, интраназального введения, интратекального введения, внутрижелудочкового введения, эпидурального введения, ингаляции, с помощью биосовместимого или биоразлагаемого имплантанта с замедленным высвобождением или имплантации инфузионного насоса.

23. Способ по любому из пп.1,2 и 6-21, где ингибитор пути комплемента вводят в глаз с помощью раствора для глазной примочки, глазной мази, глазного щитка или раствора глазных капель.

24. Способ по любому из пп.1,2 и 6-21, дополнительно включающий стадию введения иммуномодулирующего соединения, противовоспалительного соединения, антиангиогенного соединения или иммуноподавляющего компонента указанному субъекту.

25. Способ любому из пп.1,2 и 6-21, дополнительно включающий проведение субъекту антиангиогензивной терапии нацеленной на сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF).

26. Способ любому из пп.1,2 и 6-21, дополнительно включающий введение субъекту стероида.

27. Способ по п.3, где ингибитором пути комплемента является антитело, белок, пептид, пептидомиметик или молекула с низким молекулярным весом, который вводят с помощью парентерального введения, перорального введения, энтерального введения, внутриглазного введения, введения в стекловидное тело, субконъюнктивального введения, интрадермального введения, внутримышечного введения, интраперитонеального введения, внутривенного введения, подкожного введения, интраназального введения, интратекального введения, внутрижелудочкового введения, эпидурального введения, ингаляции, с помощью биосовместимого или биоразлагаемого имплантанта с замедленным высвобождением или имплантации инфузионного насоса.

28. Способ по п.3, где ингибитором пути комплемента является фактор Н или его функциональный пептид и ингибитор пути комплемента вводят посредством парентерального введения, перорального введения, энтерального введения, внутриглазного введения, введения в стекловидное тело, субконъюнктивального введения, интрадермального введения, внутримышечного введения, интраперитонеального введения, внутривенного введения, подкожного введения, интраназального введения, интратекального введения, внутрижелудочкового введения, эпидурального введения, ингаляции, с помощью биосовместимого или биоразлагаемого имплантанта с замедленным высвобождением или имплантации инфузионного насоса.

29. Способ по п.2, где глазную болезнь выбирают из группы, состоящей из дегенерации желтого пятна, диабетической ретинопатии и глазного ангиогенеза, и где ингибитором пути комплемента является антитело или его связывающий фрагмент, который специфично связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело 166-32, полученное из гибридомы, депонированной в АТСС, и обозначенной HВ 12476.

30. Способ по п.2, где субъекту требуется ингибирование глазной неоваскуляризации, которое воздействует на собственно сосудистую оболочку глаза, ретинальный пигментированный эпителий или ретинальную ткань и где ингибитором пути комплемента является антитело или его связывающий фрагмент, которое специфично связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело 166-32, полученное из гибридомы, депонированной в АТСС и обозначенной НВ 12476.

31. Способ по п.2, где глазную болезнь выбирают из группы, состоящей из дегенерации желтого пятна, диабетической ретинопатии и глазного ангиогенеза, и где ингибитором пути комплемента является антитело или его связывающий фрагмент, который специфично связывается с фактором D и которое вводят посредством парентерального введения, перорального введения, энтерального введения, внутриглазного введения, введения в стекловидное тело, субконъюнктивального введения, интрадермального введения, внутримышечного введения, интраперитонеального введения, внутривенного введения, подкожного введения, интраназального введения, интратекального введения, внутрижелудочкового введения, эпидурального введения, ингаляции, с помощью биосовместимого или биоразлагаемого имплантанта с замедленным высвобождением или имплантации инфузионного насоса.

32. Способ по п.2, где глазную болезнь выбирают из группы, состоящей из дегенерации желтого пятна, диабетической ретинопатии и глазного ангиогенеза, и где ингибитором пути комплемента является антитело или его связывающий фрагмент, который связывается с фактором D и которое вводят в глаз с помощью раствора для глазной примочки, глазной мази, глазного щитка или раствора глазных капель.

33. Способ по п.2, дополнительно включающий введение иммуномодулирующего соединения, противовоспалительного соединения, антиангиогенного соединения или иммуноподавляющего компонента указанному субъекту, где глазную болезнь выбирают из группы, состоящей из дегенерации желтого пятна, диабетической ретинопатии и глазного ангиогенеза, где ингибитором пути комплемента является антитело или его связывающий фрагмент, который связывается с фактором D.

34. Способ по п.2, дополнительно включающий проведение субъекту анти-ангиогензивной терапии нацеленной на сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), где глазное заболевание выбирают из группы, состоящей из дегенерации желтого пятна, диабетической ретинопатии и глазного ангиогенеза, где ингибитором пути комплемента является антитело или его связывающий фрагмент, который связывается с фактором D.

35. Способ по п.2, дополнительно включающий введение субъекту стероида, где глазное заболевание выбирают из группы, состоящей из дегенерации желтого пятна, диабетической ретинопатии и глазного ангиогенеза, где ингибитором пути комплемента является антитело или его связывающий фрагмент, который связывается с фактором D.

36. Способ по любому из пп.1,2 и 6-21, где дозировка ингибитора пути комплемента, вводимая субъекту, составляет от 0,1 до 100 мг/кг.

37. Способ по любому из пп.29-35, где дозировка ингибитора пути комплемента, вводимая субъекту, составляет от 0,1 до 100 мг/кг.

38. Способ ингибирования альтернативного пути активации комплемента у субъекта, имеющего глазную болезнь, включающий введение киРНК специфичной для белка пути комплемента.

39. Способ ингибирования активации альтернативного пути комплемента у пациента, имеющего глазное заболевание, включающий введение нуклеиновой кислоты, кодирующей ингибитор пути комплемента.