СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА БЕЛКОВ, ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НА ПОДЛОЖКЕ СКАНИРУЮЩЕГО ЗОНДОВОГО МИКРОСКОПА Российский патент 2011 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к биофизике и медицинской протеомике, в частности способу сайт-специфичного гидролиза белковых молекул при помощи энзима, иммобилизованных на поверхности сканирующего зондового микроскопа. Описываемый способ может быть использован для применения методов зондовой микроскопии и масс-спектрометрии при визуализации и идентификации белковых молекул в протеомных исследованиях. Масс-спектрометрическое исследование при этом обеспечивает верификацию результатов идентификации белков (белковых комплексов), полученных методом сканирующей зондовой микроскопии. Изобретение может быть использовано в медицинской диагностике инфекционных и онкологических заболеваний при проведении идентификации специфических белков и белковых комплексов в исследуемых биологических жидкостях организма.

Известен способ гидролиза [патент WO 2004049818], где белок (белковый комплекс, белоксодержащий исходный материал) подвергают воздействию, по крайней мере, одного энзима. Однако данный способ предполагает использование произвольного энзима, что не обеспечивает сайт-специфичность процесса гидролиза. В результате при последующем масс-спектроскопическом исследовании продуктов такого гидролиза невозможно идентифицировать исходный белок, так как существующие геномные базы данных предполагают использование сайт-специфичных энзимов, разрушающих пептидную связь при наличии в пептидной последовательности строго определенных аминокислот.

Известен способ [Дэвени Т., Гергей Я. Аминокислоты, пептиды и белки. М.: Мир, 1976 г., 368 с.], где предлагается реакция Сэнгера и Туппи, - неспецифический частичный кислотный гидролиз. Его недостатком является невозможность последующего анализа масс-спектрометрическими методами.

Известен патент [РФ 2351932], заключающийся в том, что используется гидролиз сайт-специфичным энзимом - трипсином - для специфического отделения частей (а именно, пептидов) белков (белковых комплексов) от поверхности. Тот факт, что гидролизуемые белки (белковые комплексы) иммобилизованы на поверхности, не позволяет добиться высокой степени гидролиза: реакция взаимодействия энзима и белка (белкового комплекса) протекает малоэффективно из-за того, что белки (белковые комплексы) расположены на поверхности, а энзим находится в объеме, что приводит к слабой кинетике реакции, которая определяется диффузией к поверхности.

Наиболее близким по своей технической сущности, принятым за прототип, является способ ферментативного гидролиза, заключающийся в использовании сайт-специфичного энзима трипсина совместно с ультразвуковым воздействием на стадии проведения реакции гидролиза, описанный в патенте [US 20090246813]. Недостатком данного способа, как и в предыдущем способе, является неэффективность его применения для гидролиза белков, иммобилизованных на поверхности, из-за сложности проведения реакции между белком (белковым комплексом), расположенным исключительно у поверхности, и энзимом трипсином, находящимся в объеме.

Задачей настоящего изобретения является снижение порога обнаружения белковых молекул (белков, белковых комплексов), иммобилизованных на поверхности подложки сканирующего зондового микроскопа при помощи масс-спектрометра до 10¹¹ шт./см². Для этого требуется обеспечить высокую эффективность гидролиза при достаточно низкой концентрации белка, обусловленной плотностью его усадки на поверхности, которая определяется возможностью их визуализации (регистрации) с помощью сканирующего зондового микроскопа.

Достигаемый технический результат состоит в повышении эффективности десорбирования белковых молекул, ковалентно связанных с подложкой, и их последующего гидролиза, что приводит к снижению порога обнаружения методами масс-спектрометрического анализа. Технический результат достигается путем предварительного ультразвукового воздействия, в ходе которого белки отсоединяются от поверхности и переходят в жидкую фазу, что повышает эффективность последующего гидролиза. Это отличает предлагаемый способ от прототипа, где ультразвуковое воздействие используется для повышения скорости гидролиза.

Для решения поставленной задачи предлагается способ, заключающийся в том, что белки подвергают воздействию ультразвука и сайт-специфичного фермента в буферном растворе с величиной pH и при температуре, которые обеспечивают активность фермента, а длительность воздействия выбирают таким образом, чтобы обеспечить гидролиз основной доли белков, но избежать неспецифичного гидролиза.

Перед воздействием фермента подложку сканирующего зондового микроскопа с иммобилизованным на ней белком извлекают из транспортировочного буферного раствора, помещают в 1-5% раствор уксусной кислоты и подвергают воздействию ультразвука высокой частоты с мощностью не менее 1 Вт/см², что обеспечивает разрыв связей белок-поверхность. После чего раствор, содержащий десорбированные белки, замораживают и подвергают лиофилизации.

Способ заключается в следующем: первоначально сливают транспортировочный буферный раствор из пробирки, в котором находится образец (подложка, предназначенная к исследованию в сканирующем зондовом микроскопе, с иммобилизованными на ней белковыми молекулами с концентрацией в диапазоне 10¹¹-10¹³ шт./см²). Далее образец заливают уксусной кислотой в диапазоне концентраций 1-5% так, чтобы образец был полностью погружен в раствор. Пробирку с образцом помещают в ультразвуковую ванну с частотой ультразвука 1-3 МГц и мощностью не менее 1 Вт/см² на время, обеспечивающее отделение максимального количества белков (белковых комплексов) от поверхности, но без разрушения самих белков, при температуре, диапазон которой обусловлен коэффициентом диффузии и сохранением структуры белка (белкового комплекса). Затем удаляют подложку из пробирки. После этого пробирку с раствором, содержащим десорбированные белки, замораживают и подвергают лиофилизации. Затем производят размораживание до комнатной температуры. Добавляют раствор энзима, а также буферный раствор, позволяющий поддерживать рН на уровне, необходимом для эффективной работы энзима. Выдерживают полученный раствор при температуре 37°C. Длительность воздействия выбирают таким образом, чтобы наибольшее количество целевого белка было гидролизовано и при этом было минимизировано количество продуктов самогидролиза энзима. После осуществления гидролиза производят остановку процесса путем изменения рН на слабокислую среду. Контроль продуктов самогидролиза энзима выполняют путем сравнения масс-спектров продуктов реакции исследуемого вещества, полученных при различной длительности выдерживания, и масс-спектра тестовой пробы, содержащей исключительно используемый энзим. Для целей контроля энзима с его помощью также проводят гидролиз известного белка при тех же условиях, что и гидролиз исследуемого вещества. Затем оба раствора продуктов гидролиза переносят в хроматограф, соединенный с масс-спектрометром, или на пластину МАЛДИ-спектрометра, предварительно добавив матрицу в раствор.

Пример №1

Первоначально сливают транспортировочный буферный раствор из пробирки, в которой находился образец размером 10×20×0.5 мм (подложка сканирующего зондового микроскопа). Затем заливают образец 2% уксусной кислотой так, чтобы образец был полностью погружен в раствор. Далее на 10 минут помещают пробирку с образцом в термостатирующую ультразвуковую ванну мощностью 5 Вт/см² при температуре 37°C. После этого вынимают подложку и замораживают раствор, содержащий десорбированные белки, при -70°C. Затем раствор подвергают лиофилизации в течение 4 ч, после чего размораживают до комнатной температуры. Добавляют в пробирку 400 мкл буферного раствора NH₄HCO₃ с концентрацией 3,95 мкг/мкл и 2 мкл трипсина с концентрацией 0.2 мкг/мкл. Далее пробирку помещают в термостат (с постоянным перемешиванием) при температуре 37°C на 12 часов. Затем добавляют МАЛДИ-матрицу и наносят на мишень для получения масс-спектра.

Пример №2

Первоначально сливают транспортировочный буферный раствор из пробирки, в которой находился образец размером 10×20×0.5 мм (подложка сканирующего зондового микроскопа). Затем заливают образец 2% уксусной кислотой так, чтобы образец был полностью погружен в раствор. Далее на 10 минут помещают пробирку с образцом в термостатирующую ультразвуковую ванну мощностью 5 Вт/см² при температуре 37°C. После этого вынимают подложку и замораживают раствор, содержащий десорбированные белки, при -70°C. Затем раствор подвергают лиофилизации в течение 4 ч, после чего размораживают до комнатной температуры. Добавляют в пробирку 400 мкл буферного раствора NH₄HCO₃ с концентрацией 3,95 мкг/мкл и 1/30 часть (по отношению к количеству белка) кристаллического пепсина. Далее пробирку помещают в термостат (с постоянным перемешиванием) при температуре 25°C на 17 часов. После чего пробу анализируют при помощи хромато-масс-спектрометра.

Использование способа обеспечивает снижение порога обнаружения белковых молекул (белков, белковых комплексов), иммобилизованных на поверхности подложки сканирующего зондового микроскопа, при помощи масс-спектрометра до концентрации 10¹¹ шт./см².

Изобретение относится к биофизике и медицинской протеомике. Для проведения специфичного ферментативного гидролиза белков, иммобилизованных на поверхности подложки сканирующего зондового микроскопа, белки подвергают воздействию ультразвука и сайт-специфичного фермента в буферном растворе с величиной рН и при температуре, которые обеспечивают активность фермента. При этом перед проведением ферментативного гидролиза подложку сканирующего зондового микроскопа помещают в 1-5% раствор уксусной кислоты и подвергают воздействию ультразвука высокой частоты 1-3 МГц и мощностью не менее 1 Вт/см² при температуре раствора, обеспечивающей разрыв связей белок-поверхность. Затем раствор, содержащий десорбированные белки, замораживают и подвергают лиофилизации. Подложка сканирующего зондового микроскопа может состоять из кремния, стекла, слюды, сапфира. Поверхность подложки сканирующего зондового микроскопа, на которой активированы молекулы белка, химически активирована силаном. Использование способа позволяет снизить порог обнаружения белковых молекул, иммобилизованных на поверхности подложки сканирующего зондового микроскопа, при помощи масс-спектрометра до 10¹¹ шт./см². 2 з.п. ф-лы.

1. Способ проведения специфичного ферментативного гидролиза белков, иммобилизованных на поверхности подложки сканирующего зондового микроскопа, заключающийся в том, что белки подвергают воздействию ультразвука и сайт-специфичного фермента в буферном растворе с величиной рН и при температуре, которые обеспечивают активность фермента, а длительность воздействия выбирают таким образом, чтобы обеспечить гидролиз основной доли белков, но избежать неспецифичного гидролиза, отличающийся тем, что перед воздействием фермента подложку сканирующего зондового микроскопа с иммобилизованным на ней белком извлекают из транспортировочного буферного раствора, помещают в 1-5%-ный раствор уксусной кислоты и подвергают воздействию ультразвука высокой частоты 1-3 МГц и мощностью не менее 1 Вт/см², обеспечивающей разрыв связей белок-поверхность, после чего раствор, содержащий десорбированные белки, замораживают и подвергают лиофилизации.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что подложка сканирующего зондового микроскопа может состоять из кремния, стекла, слюды, сапфира, а также другого твердого материала.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что поверхность подложки сканирующего зондового микроскопа химически активирована силаном, на которой иммобилизованы молекулы белка.