СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАЛИЧИЯ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ НА ОСНОВЕ ИММУНОДЕТЕКЦИИ, СОПРЯЖЕННОЙ С ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИЕЙ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/53 C12Q1/68 

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к областям медицинской биохимии, диагностической медицинской микробиологии, прикладной иммунохимии и разработки диагностических тест-систем, касается разработки нового способа для высокочувствительного определения белка протективного антигена сибирской язвы (РА) в инфицированных образцах биологического происхождения и окружающей среде.

Основной областью применения предлагаемого способа определения протективного антигена сибирской язвы являются биомедицина, микробиологическая диагностика, микробиологические исследования, разработка средств ранней и высокоэффективной специфической диагностики вирулентного возбудителя сибирской язвы, санитарно-гигиенический контроль за наличием возбудителя сибиреязвенной инфекции в окружающей среде и продуктах животного происхождения, предотвращение угрозы биотерроризма.

Протективный антиген сибирской язвы представляет собой основной компонент экзотоксина, определяющего патогенность токсигенных штаммов грамположительной бактерии Bacillus anthracis, являющейся возбудителем особо опасного инфекционного заболевания сибирской язвы. Мономер РА имеет молекулярную массу 83 кДа. После протеолитической активации на поверхности клетки-хозяина, РА формирует интегрирующий в мембрану гептамер, который транслоцирует токсические ферменты эдема-фактор и летальный фактор в цитозоль, а также способен к транслокации гетерологичных белков [Petosa С., Collier R.J., Klimpel K.R. с соавт. // Nature. - 1997. - V.385, N.6619. - Р.833-838]. Рецептор для РА на поверхности клетки на данный момент не идентифицирован. Изучена третичная структура трансмембранного комплекса протективного антигена, кинетика транспорта веществ через мембранный канал, сформированный гептамером РА, проводились попытки применения этого белка для направленного транспорта лекарственных веществ. Протективный антиген является центральной мишенью для создания противосибиреязвенных вакцин на базе антител, некоторые из которых проходят клинические испытания.

Особенностью сибиреязвенной инфекции является протекающий практически бессимптомно ранний этап синтеза компонентов сибиреязвенного токсина, включая протективный антиген, и последующий быстрый переход инфицированного организма в так называемую "точку невозврата", при которой эффективность традиционно применяемой терапии антибиотиками не способна скомпенсировать развитие токсической патологии. Экспериментально показано, что концентрация протективного антигена у морских свинок через 24 часа после интраназальной инфекции спорами не превышает 0,1 нг на мл крови и достигает нанограммов только через 30-36 часов, однако, летальный исход возможен уже на вторые-третьи сутки после заражения, кроме того, появление в крови животных РА, как правило, предшествует появлению бактериемии [Kobiler D., Weiss S., Levy H. с соавт. // Infect, and Immun., - 2006. - V.74, N.10, Р.5871-5876]. Ранняя диагностика накопления протективного антигена при сибиреязвенной инфекции и своевременно примененная терапия обеспечивают благоприятный прогноз исхода заболевания. Применение в клинической практике специфичных и высокочувствительных диагностических тест-систем, способных определять крайне низкие (менее 1 нг) концентрации РА на ранних этапах сибиреязвенной инфекции, предотвращает риск летального исхода, а для эффективного предотвращения последствий массовых эпидемий или биотеррористических атак необходима детекция протективного антигена в количестве менее 1-10 пг.

Высокая специфичность и чувствительность детекции сибиреязвенной инфекции на ранних этапах не достижима способами, традиционно применяемыми на сегодняшний день в медицинской диагностике - иммуноферментным анализом (ИФА) и классической полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Чувствительность наиболее эффективных вариантов ИФА, задействующих флюоресцентные и хемилюминесцентные конъюгаты антител, не превышает 100 пг, а большинство систем ИФА применимо лишь при накоплении в тканях значительного количества патогенной бактерии, что происходит лишь через 50-72 часа после инфекции, то есть при приближении инфицированного организма к "точке невозврата" и к гибели [Mabry R., Brasky K., Geiger R с соавт. // Clin. and Vaccine Immunol. - 2006. - V.13, N.6. - P.671-677]. Специфичность ПЦР-амплификации фрагментов генов B. anthracis и ее потенциал в качестве диагностического инструмента сильно зависимы от качества и количества детектируемой ДНК-матрицы и количества примесей в исследуемых образцах близкородственной ДНК [Janse I., Hamidjaja R.A., Bok J.A., and van Rotterdam B.J. // BMC Microbiology. - 2010. - V.10. - P.314].

Решение проблемы повышения чувствительности анализа в диагностике сибиреязвенной инфекции на ранних этапах осуществляется при помощи ПЦР, проводимой в режиме реального времени, применения масс-спектрометрических методов, использования технологий аптамеров. Несмотря на значительно более высокую чувствительность по сравнению с традиционными методами ИФА и ПЦР, каждый из этих способов детекции имеет ряд существенных ограничений. В случае работы с образцами окружающей среды и биологическими пробами ПЦР-диагностика B.anthracis в режиме реального времени требует тщательного подбора условий реакции, долгой и сложной процедуры предварительной обработки образцов, постоянного дублирования экспериментов и борьбы с фоновыми загрязнениями [Antwerpen M.H., Zimmermann P., Bewley К. с соавт. // Mol. Cell. Probes. - 2008. - V.22. - Р.313-315]. Реакция крайне чувствительна к контаминации и легко приводит к ложноположительным результатам. Масс-спектрометрическая детекция применяется для детекции компонентов токсина сибирской язвы и обладает высокой чувствительностью (1-5 пг) [Boyer А.Е., Gallegos-Candela M., Lins R.C. с соавт. // Molecules. - 2011. - V.16, N.3. - Р.2391-2413], но при широкомасштабном применении для разнородных образцов может оказаться неспецифичной и осложняется необходимостью предварительной очистки мишени, что неизбежно приводит к потерям времени и материала и, таким образом, не может использоваться для ранней диагностики и для количественного определения токсина и его компонентов. Аптамерные системы определения компонентов сибиреязвенного патогена, обладая преимуществом прямого узнавания антигена и, как следствие, высокой скоростью тестирования, на данный момент недостаточно оптимизированы и не имеют достаточной аффинности и специфичности для обеспечения высокой чувствительности разрабатываемых на их основе способов детекции. Нижний порог чувствительности детекции существующими аптамерами протективного антигена составляет 1 нМ [Cella L.N., Sanchez P., Zhong W. с соавт. // Anal. Chem. - 2010. - V.82, N.5. - Р.2042-2047]. На данный момент большинство этих методов выявления ранних стадий сибиреязвенной инфекции находится на стадии экспериментальных разработок и не существуют в виде стандартизованных коммерчески доступных диагностических тест-систем.

Известен способ детекции, основанный на флюоресцентном иммуноанализе и примененный в коммерчески доступной диагностической тест-системе, одобренной Научной ассоциацией по качеству аналитических инструментов (АОАС) и ориентированной на определение наличия спор сибирской язвы в окружающей среде и биологических образцах ("RAMP Anthrax Test", Response Biomedical Corporation, США), обладающий высокой чувствительностью (предел чувствительности - 4 нг спор). Однако, помимо того, что детекция по этому способу требует наличия специфического оборудования от того же производителя (RAMP Reader), данный способ весьма дорогостоящий, применим лишь к споровой форме бактерии B. anthracis и не пригоден для обнаружения бактерий в вегетативной форме или для детекции компонентов летального токсина на достаточно ранних стадиях заражения с целью проведения своевременной терапии.

Известен способ детекции протективного антигена сибирской язвы на основе ИФА ("Anthrax Protective Antigen IgG ELISA", BioQuant, CIIIA), однако, он основан на детекции специфических антител против протективного антигена, которые могут появиться лишь на поздних стадиях инфекции, когда терапия неэффективна.

Известен способ определения инфекции Bacillus anthracis, разработанный на основе ПЦР (производимая НАРВАК "Тест-система для идентификации бактерий вида Bacillus anthracis методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), разработанная в РосНИПЧИ "Микроб", г.Саратов, "Тест-система для выявления ДНК В. anthracis рХ01+ методом полимеразной цепной реакции", набор для определения сибиреязвенной инфекции на основе ПЦР "Anthrax Bacillus PCR Kit DNA PCR Instrument", Gentaur Molecular Products, США). Недостатком способа определения на основе традиционной ПЦР является долгая и сложная схема пробоподготовки, необходимая для получения воспроизводимых результатов и исключения ложноположительных сигналов, сложность количественной оценки результатов анализа, а также невозможность применения этих систем на ранних стадиях инфекции.

Известен способ определения сибиреязвенной инфекции, основанный на ПЦР, проводимой в режиме реального времени (набор "RealArt™ В. anthracis PCR Kit", Qiagen, США). Данный способ обладает высокой чувствительностью к спорам и вегетативным клеткам сибирской язвы (предел чувствительности детекции до 50 вегетативных клеток или спор), однако он не позволяет детектировать летальный токсин и его компоненты и проводить анализ на ранних стадиях развития заболевания.

Известен способ определения протективного антигена сибирской язвы, базирующийся на амплификации фрагментов этого гена при помощи ПЦР, проводимой в режиме реального времени ("LightCycler Bacillus anthracis kit; Roche Applied Science, США), он имеет высокую возпроизводимость и чувствительность, однако, этот способ не позволяет количественно определить уровень протективного антигена В. anthracis и, таким образом, не дает представления об уровне угрозы интоксикации.

Известен и активно разрабатывается наиболее технически близкий к заявляемому способ детекции биологических молекул, объединяющий преимущества специфичности иммунологической детекции с высокой чувствительностью полимеразной цепной реакции [US Patent 5665539]. Данный подход, получивший название иммуно-ПЦР, в своем простейшем варианте основан на иммобилизации антигена на твердой фазе с последующей детекцией его при помощи специфического антитела, ковалентно или нековалентно связанного с ДНК-матрицей, позволяющей провести амплификацию сигнала при помощи ПЦР. Оптимизированными вариантами данного способа являются иммобилизация на твердой фазе антитела к одному из эпитопов антигена и последующая детекция антигена антителом к его другому эпитопу [Komatsu M., Kobayashi D., Saito К. с соавт. // Clin. Chem. - 2001. - V.47, N.7. - Р.1297-1301], повышение чувствительности за счет апмлификации ДНК-матрицы при помощи различных вариантов ПЦР в режиме реального времени с применением флюоресцентной метки [Canto C.L., Sumita L.M., Machado A.F. с соавт. // Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. - 2008. - V.50, N.I - P.61-63], внедрение улучшенных конъюгатов и модификаций матриц ДНК [Niemeyer C.M., Wacker R. and Adier M // Nucleic Acids Res. - 2003. - V.31, N.16. - P.90] и др. Способы определения на базе имммуно-ПЦР успешно применялись для детекции различных инфекционных патогенов, в частности, для детекции Шига-токсина патогенных штаммов E.coli [Не X., Qi W., с соавт.// Appl. Environ. Microbiol. - 2011. - V.77, N.11 - Р.3558-3564], вирусов [Barletta J., Bartolome A., and Constantine N.T. // J. Virol. Methods. - 2009. - V.157, N.2 - P.122-132.], стафилококкового энтеротоксина [Fischer A., von Eiff С., Kuczius Т. с соавт.// J. Mol. Med. (Berl). - 2007. - V.85, N.5. - P.461-469] и др.

Разработка способов детекции сибиреязвенной инфекции или протективного антигена B.anthracis на основе иммуно-ПЦР не проводилась.

Изобретение решает задачу создания высокочувствительного способа идентификации протективного антигена сибирской язвы на основе иммунодетекции, сопряженной с ПЦР в режиме реального времени, применимого для его выявления в образцах биологических жидкостей и тканей на ранних и поздних этапах развития сибиреязвенной инфекции, а также в продуктах питания и окружающей среде, употребимого для работы как с инфекционно опасными, так и с инактивированными пробами.

Поставленная задача решается за счет способа детекции протективного антигена сибирской язвы с помощью пары моноклональных антител, специфичных к белку РА, одно из которых, иммобилизованое на твердом носителе (хроматографических носителях и парамагнитных частицах) за счет взаимодействия с белком G бактерий рода Streptococcus, служит для связывания РА, находящегося в исследуемой пробе, а второе (биотинилированное) антитело детектирует РА и посредством мостика, образованного тетравалентной молекулой нейтравидина, связывается с биотинилированными фрагментами ДНК, используемыми в качестве субстрата для ПЦР-амплификации с флюоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени.

Также поставленная задача решается за счет применения покрытых белком G бактерий рода Streptococcus хроматографических носителей и парамагнитных частиц, которые позволяют иммобилизовать на поверхности частиц антитело к протективному антигену, провести специфическое связывание РА из жидких образцов, избавиться от содержащихся в образцах загрязнений на ранних этапах эксперимента и провести отделение ДНК-матрицы, применяемой для конечной ПЦР-амплификации, от других компонентов детекционного комплекса.

Также поставленная задача решается за счет применения высокоаффинных моноклональных антител, специфичных к различным эпитопам белка РА, в силу чего не происходит конкуренции антител за сайт связывания в структуре белка, что способствует повышению чувствительности детекции.

Также поставленная задача решается за счет конъюгата ДНК с нейтравидином, образующего молекулярную "сетку", при использовании которой для детекции возможно увеличить количество матричных молекул ДНК, связанных с единичной молекулой биотинилированного антитела и, таким образом, амплифицировать сигнал.

Также поставленная задача решается за счет блокировки поверхности твердой фазы раствором Денхардт-ДНК, которая препятствует неспецифической сорбции конъюгата ДНК-нейтравидин на поверхности магнитных частиц и пробирок стрипов и снижает вероятность ложноположительных результатов эксперимента.

Также поставленная задача решается за счет отделения ДНК-матрицы, применяемой для конечной ПЦР-амплификации, от прочих компонентов образованного детекционного комплекса посредством обработки специфической эндонуклеазой рестрикции, не нарушающей первичную структуру ДНК и сохраняющей возможность амплификации матричной ДНК в режиме реального времени по методу TaqMan, что способствует снижению фонового сигнала в эксперименте.

Также поставленная задача решается за счет применения в анализе редко встречающейся в окружающей среде ДНК-матрицы, оптимизированной для проведения ПЦР-амплификации с флюоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени, что снижает вероятность возникновения ложноположительного сигнала при детекции, позволяет существенно повысить чувствительность метода и провести количественное определение содержания РА в исследуемых образцах.

Техническим результатом изобретения является создание эффективного высокочувствительного способа детекции протективного антигена сибирской язвы, применимого для нужд клинической диагностики и мониторинга окружающей среды и качества продуктов питания. Отличием предлагаемого способа является осуществление детекции на базе двух специфических моноклональных антител к различным эпитопам белка РА, одно из которых посредством биотин-нейтравидинового взаимодействия связывается с ДНК, служащей матрицей для проведения ПЦР-амплификации с флюоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени. С использованием разработанного способа можно детектировать протективный антиген сибирской язвы в концентрации до 0,1 пМ.

В предлагаемом техническом решении специфичность узнавания РА обеспечивается за счет пары высокоаффинных моноклональных антител, взаимодействующих с различными эпитопами молекулы РА. Это позволяет повысить чувствительность метода и избежать конкуренции антител за один эпитоп на молекуле белка РА. Одно из антител подвергается биотинилированию для последующего присоединения конъюгата ДНК с нейтравидином.

Предлагаемое техническое решение предусматривает использование нековалентного конъюгата ДНК с нейтравидином, который представляет собой молекулярную "сетку", образованную за счет взаимодействия биотина, находящегося на 5'-концах двухцепочечного фрагмента ДНК с тетравалентной молекулой нейтравидина. Наиболее эффективным является формирование таких комплексов в эквимолярном соотношении биотинилированной ДНК к белку нейтравидина. Нейтравидин является белком авидинового ряда, характеризующимся высокой специфичностью и эффективностью взаимодействия с биотином. Применение молекулярной "сетки" вместо несвязанных фрагментов биотинилированной ДНК повышает количество ДНК-матрицы, удерживаемой единичной молекулой антитела, и более чем в 10 раз увеличивает чувствительность метода.

Существенным условием успешного использования заявленного способа является блокировка свободных валентностей связывания твердой фазы, которая осуществляется пятикратным раствором Денхардт, содержащим 1% ДНК спермы лосося для предотвращения неспецифического связывания с поверхностью конъюгата ДНК-нейтравидин.

Важным достоинством предлагаемого способа определения ПА является применение в качестве носителя комплекса парамагнитных частиц, которые допускают проведение автоматизации этого метода детекции с использованием роботизированных дозаторов и промывочных устройств и минимизирует контакт оператора с потенциально инфицированным материалом. Кроме парамагнитных частиц предпочтительными матрицами для иммобилизации антитела к РА являются: 1) немагнитные пористые и непористые полимерные микросферы и микрочастицы; 2) хроматографические носители; 3) микрочастицы, образуемые коллоидным золотом; 4) квантовые точки; 5) пористые и непористые полимерные поверхности; 6) рабочие поверхности биосенсоров.

К преимуществам заявленного способа определения протективного антигена сибирской язвы относятся: 1) высокая чувствительность метода, позволяющая провести диагностику накопления белка протективного антигена на ранних стадиях заражения сибирской язвой, своевременно начать терапию инфицированного, предотвратить возможность возникновения эпидемии или нейтрализовать последствия биотеррористической атаки; 2) гомологичность заявленного метода в части реагентов, материалов и оборудования стандартному иммуноферментному анализу и технологиям ПЦР-диагностики, применяемым в клинической практике; 3) высокая специфичность детекции РА, обеспечивающаяся примененным принципом иммунодетекции, и низкая вероятность получения ложноположительных сигналов по сравнению со стандартными методами ПЦР-диагностики; 4) возможность проведения быстрого автоматизированного анализа большого количества образцов; 5) дешевизна большинства используемых в анализе материалов; 6) возможность экстраполяции разработанного способа для детекции любых других патогенных и непатогенных молекул при подборе соответствующей пары специфических моноклональных детектирующих антител.

Изобретение осуществляют следующим образом:

Моноклональное антитело, специфичное к белку протективного антигена сибирской язвы, связывают на парамагнитных частицах за счет взаимодействия с иммобилизованным на их поверхности белком G бактерий рода Streptococcus. Свободные валентности поверхности планшета и парамагнитных частиц блокируют пятикратным раствором Денхардт, содержащим 1% ДНК спермы лосося. Троекратно промывают планшет и частицы раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия и 5 мМ ЭДТА.

Проводят подготовку проб инфицированного биологического материала или образцов окружающей среды и продуктов питания. Для этого биологические жидкости центрифугируют для освобождения от клеточного дебриса и добавляют к супернатанту 1/10 раствора, содержащего 200 мМ трис-HCl, 1 М хлорида натрия и 50 мМ ЭДТА. Твердые образцы продуктов питания и почвы гомогенизируют с раствором, содержащим 40 мМ трис-HCl рН 7,5, 200 мМ хлорида натрия и 10 мМ ЭДТА, и инкубируют при встряхивании на шейкере в течение 10 минут, после чего удаляют твердые частицы центрифугированием.

Подготовленные пробы инкубируют с антителом, иммобилизованным на поверхности парамагнитных частиц в течение 1 часа. После трехкратной промывки частиц раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия и 5 мМ ЭДТА, к ним добавляют биотинилированное антитело и инкубируют парамагнитные частицы с биотинилированным антителом при комнатной температуре со встряхиванием в течение 30 минут, после чего повторяют промывку парамагнитных частиц.

К связанному на поверхности парамагнитных частиц сэндвичу "антитело-протективный антиген-биотинилированное антитело" добавляют раствор нековалентного конъюгата ДНК с нейтравидином (молекулярная "сетка") и инкубируют парамагнитные частицы с конъюгатом в течение 30 минут. Промывку поверхности частиц от не связавшегося конъюгата с ДНК проводят раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 300 мМ хлорида натрия.

После полного удаления промывочного раствора в лунки планшета или пробирки стрипа добавляют буферный раствор для эндонуклеазы рестрикции Sac I, содержащий фермент Sac I в концентрации 50 ед/мл. Рестрикцию проводят при 37°С в течение 1 часа, затем помещают планшет на магнитную плату для фиксации частиц за счет магнитного взаимодействия и переносят супернатант из лунок планшета в пробирки для ПЦР.

В пробирки для ПЦР, содержащие продукты рестрикции, отобранные с парамагнитных частиц, обработанных рестриктазой Sac I, вносят 10 объемов смеси для амплификации, содержащей буфер для ПЦР-амплификации, праймеры, рекомбинантную Taq-полимеразу и пробу TaqMan для проведения реакции ПЦР в режиме реального времени. Детекция флюоресцентного сигнала проводится при температуре отжига праймеров 57°С и времени элонгации 1 минута с использованием прибора для ПЦР в режиме реального времени в течение 50 циклов амплификации.

Отрицательные контрольные значения флюоресценции фиксируются в лунках планшета или пробирках в составе стрипа, не содержащих тестируемых образцов. Положительные контрольные значения флюоресценции регистрируются в лунках или пробирках, содержащих фиксированные количества белка протективного антигена сибирской язвы, взятого в известной концентрации. Принципиальная схема осуществления изобретения приведена на фиг.1. Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:

Фиг.1. Схема постановки эксперимента при определении протективного антигена сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.

Фиг.2. Последовательность ДНК, используемая при определении протективного антигена сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией. Последовательности ДНК, соответствующие олигонуклеотидам, использованным для амплификации фрагмента, сайтам эндонуклеазы рестрикции SacI и пробе TaqMan, примененной для проведения ПЦР-амплификации в режиме реального времени, выделены подчеркиванием. Последовательности ДНК, соответствующие олигонуклеотидам, использованным для детекции фрагмента ПЦР в режиме реального времени, выделены жирным шрифтом.

Фиг.3. Последовательности олигонуклеотидов, используемых для приготовления конъюгата ДНК-матрицы с нейтравидином и проведения ПЦР-амплификации в режиме реального времени. На фиг.3 представлены последовательности пробы TaqMan, биотинилированных праймеров, использованных для наработки ДНК-матрицы, конъюгированной с нейтравидином, и праймеров, примененных для проведения реакции ПЦР в режиме реального времени с пробой TaqMan. Проба TaqMan содержит на 5'-конце карбоксифлюоресцеин (FAM), а на 3'-конце гаситель флюоресценции RTQ1 (разработка компании Syntol, Россия).

Фиг.4. Получение конъюгата биотинилированной ДНК с нейтравидином для определения протективного антигена сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией. Результаты электрофореза в полиакриламидном геле комплексов биотинилированной ДНК с нейтравидином, сформированных при различном молярном соотношении ДНК к нейтравидину. Дорожка 1 - маркер молекулярной массы #SM1163 (Fermentas), 2 - молярное соотношение ДНК к нейтравидину 1:2, 3 - молярное соотношение ДНК к нейтравидину 2:1, 4 - молярное соотношение ДНК к нейтравидину 1:1.

Фиг.5. Типичные результаты определения протективного антигена сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией в режиме реального времени. Результаты измерения флюоресценции в реакции ПЦР-амплификации по методу TaqMan в режиме реального времени при определении протективного антигена по способу иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией. По вертикальной оси изложены значения флюоресценции в единицах, по горизонтальной оси представлено количество циклов ПЦР-амплификации. Кривая 1 - положительный контроль (образец с концентрацией РА 100 рМ), кривая 2 - отрицательный контроль (образец, не содержащий РА), кривые 3-8 - экспериментальные образцы с различным содержанием РА.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.

Пример 1. Получение биотинилированного антитела для определения протективного антигена сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.

Выделение антител для детекции протективного антигена сибирской язвы проводят из асцитной жидкости. Отобранную асцитную жидкость подвергают центрифугированию при 10000 об/мин в течение 15 минут для удаления клеточного дебриса. К полученному супернатанту добавляют равный объем буфера, содержащего 40 мМ трис-HCl рН 7,5, 200 мМ хлорида натрия, и проводят высаливание антитела из раствора добавлением насыщенного сульфата аммония до концентрации 50%, а затем выдерживают сульфатный раствор в течение 1 часа при температуре +4°С для формирования осадка. Полученный сульфатный осадок собирают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 15 минут и растворяют в буфере, содержащем 50 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия. Полученный белковый раствор центрифугируют при 12000 об/мин в течение 15 минут для удаления нерастворенных примесей и наносят на колонку Protein G (GE Healthcare, США), уравновешенную 10 объемами буфера, использованного для растворения белка. Колонку промывают 10 объемами того же буфера для удаления не связавшегося белка и элюируют белок антитела раствором, содержащим 100 мМ глицин-HCl рН 2,6 и 100 мМ хлорида натрия. Приводят значение рН раствора к 8.0 добавлением раствора 1 М триса-основание с использованием рН-бумаги. Определяют концентрацию полученного белка антитела спектрофотометрически и анализируют его чистоту электрофорезом в денатурирующем полиакриламидном геле по методике Laemmli.

Полученный белок антитела троекратно диализуют против 100 объемов фосфатного буфера, содержащего 20 мМ Na₂HPO₄ и 100 мМ хлорида натрия для удаления аминогрупп. Готовят раствор NHS-биотина в DMSO из расчета 1 мг/мл и добавляют полученный раствор к раствору антитела в объемном соотношении 1:8. Проводят реакцию биотинилирования при +4°С в течение ночи со встряхиванием и троекратно диализуют против 100 объемов фосфатного буфера, содержащего 20 мМ Na₂HPO₄ и 100 мМ хлорида натрия для удаления не связавшегося биотина.

Полноту биотинилирования контролируют постановкой иммуноблота с детекцией биотинилированного антитела конъюгатом нейтравидин-пероксидаза (Pierce, США).

Пример 2. Приготовление проб для определения протективного антигена сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.

Подготовку проб инфицированного биологического материала проводят следующим образом. Отобранные образцы биологических жидкостей (кровь, моча, слюна) центрифугируют при 5000 об/мин и температуре +4°С для освобождения от клеточного дебриса, отбирают супернатант и повторно центрифугируют его при 10000 об/мин в течение 15 минут. К супернатанту добавляют 1/10 стерильного раствора, содержащего 200 мМ трис-HCl, 1 М хлорида натрия и 50 мМ ЭДТА.

К образцам биологических тканей, почвы и продуктов питания добавляют раствор, содержащий 40 мМ трис-HCl рН 7,5, 200 мМ хлорида натрия и 10 мМ ЭДТА из расчета один объем раствора (в мл) на одну единицу массы твердого образца (в г) и растирают в гомогенизаторе Дунса (20 ударов плотно прилегающего пестика) во льду. Полученный однородный гомогенат встряхивают на шейкере при температуре +4°С в течение 10 минут и удаляют твердые частицы центрифугированием при 10000 об/мин в течение 15 минут.

В случае необходимости проводят уничтожение в образцах жизнеспособных клеток и спор возбудителя сибирской язвы прогревом при 95°С в течение 1 часа.

Подготовленные образцы хранят при температуре +4°С в течение 4 часов до проведения анализа или замораживают при -70°С для длительного хранения.

Пример 3. Приготовление конъюгата биотинилированной ДНК с нейтравидином для определения протективного антигена сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.

В качестве ДНК для получения конъюгата с нейтравидином и матрицы для последующей ПЦР-амплификации в режиме реального времени используют фрагмент геномной ДНК Fusarium avenaceum длиной 747 пар оснований (фиг.2). Праймеры для амплификации фрагмента на 5'-концах модифицируют биотином (фиг.3). Наработку биотинилированного фрагмента ДНК проводят ПЦР амплификацией при помощи Taq-полимеразы при температуре отжига праймеров 56°С и времени элонгации фрагмента 1 минута. Продукты ПЦР-реакции осаждают 3 объемами этанола с добавлением 1/10 объема ацетата натрия рН 5,2 и растворяют в 0,5 мл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl рН 7,5 и 300 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА. Раствор ДНК центрифугируют для удаления нерастворенных примесей и наносят на гель-фильтрационную колонку Superdex-200 (GE-Healthcare, Великобритания), уравновешенную тем же буфером, для удаления побочных продуктов синтеза и не задействованных в синтезе олигонуклеотидов. Гель-фильтрацию проводят при скорости потока 0,5 мл/мин, выход разделяемых продуктов контролируют спектрофотометрически. Определяют содержание целевого фрагмента ДНК во фракциях гель-фильтрации электрофорезом в агарозном геле. Фракции, содержащие синтезированный фрагмент, осаждают 3 объемами этанола с добавлением 1/10 объема ацетата натрия рН 5,2 и растворяют в буфере, содержащем 20 мМ трис-HCl, 100 мМ хлорида натрия и 5 мМ ЭДТА. Количество ДНК в полученном растворе определяют спектрофотометрически.

Готовят раствор нейтравидина (Pierce, США) из расчета 1 мг/мл и смешивают его в эквимолярном соотношении с раствором ДНК. Смесь инкубируют при +4°С в течение ночи. Образование молекулярной "сетки" биотинилированной ДНК с нейтравидином контролируют электрофорезом ДНК в полиакриламидном геле по замедлению скорости миграции продуктов разделения против исходного фрагмента ДНК (фиг.4). Полученный конъюгат биотинилированной ДНК с нейтравидином очищают от несвязанной ДНК и нейтравидина гель-фильтрацией на колонке Superdex-200 (GE-Healthcare, Великобритания), уравновешенной буфером, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 300 мМ хлорида натрия и 5 мМ ЭДТА. Содержание конъюгата во фракциях гель-фильтрации контролируют электрофорезом в агарозном геле. Очищенный конъюгат концентрируют с использованием Microcon YM-50 (Millipore, США). Спектрофотометрически определяют концентрацию конъюгата по ДНК и белку и на основании этих данных рассчитывают соотношение ДНК к белку в полученной молекулярной "сетке". К конъюгату добавляют глицерин до 50% и хранят по аликвотам при температуре -70°С.

Пример 4. Постановка иммунодетекции протективного антигена и связывание его с ДНК-матрицей для последующей ПЦР-амплификации в режиме реального времени.

В лунки иммунологического микропланшета разносят по 300 мкл раствора Денхардт (20 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 1% Ficoll 400, 1% поливинилпирролидон, 1% бычий сывороточный альбумин), содержащего 1% ДНК спермы лосося, и инкубируют в течение 1 часа при 37°С для блокировки свободных валентностей поверхности микропланшета. Парамагнитные частицы с иммобилизованным белком G бактерий семейства Streptococcus (Protein G Magnetic Beads, New England Biolabs, США) наносят в лунки микропланшета в количестве 10 мкл суспензии частиц на лунку. Помещают планшет на магнитную плату прибора Bio-Plex Pro II Wash Station (Bio-Rad, США) и трижды промывают парамагнитные частицы, удерживаемые магнитным взаимодействием с платой, буферным раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА с применением программы MAGx3. В лунки планшета по 50 мкл разносят раствор антитела к протективному антигену сибирской язвы, содержащий 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия и 20 мкг/мл антитела. Инкубируют планшет в течение 1 часа при комнатной температуре со встряхиванием. Проводят блокировку свободных валентностей поверхности парамагнитных частиц приготовленным на том же буфере раствором Денхардт, содержащим 1% ДНК спермы лосося. Для этого в лунки микропланшета добавляют 300 мкл раствора Денхардт-ДНК и инкубируют при встряхивании в течение 1 часа при 37°С. Троекратно промывают парамагнитные частицы с применением прибора Bio-Plex Pro II Wash Station (Bio-Rad, США) раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА. В лунки микропланшета разносят по 100 мкл подготовленные образцы, содержащие протективный антиген сибирской язвы в различных концентрациях. В лунки, служащие отрицательным контролем, добавляют буферный раствор, содержащий 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА, либо экспериментальные образцы, заведомо не содержащие белка протективного антигена. Инкубируют планшет при встряхивании в течение 1 часа при комнатной температуре. Троекратно промывают парамагнитные частицы раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА с применением прибора Bio-Plex Pro II Wash Station (Bio-Rad, США). В лунки планшета добавляют по 100 мкл раствора, содержащего биотинилированное антитело, узнающее другой эпитоп белка протективного антигена сибирской язвы, и инкубируют планшет при встряхивании в течение 30 минут при комнатной температуре. Троекратно промывают парамагнитные частицы раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 100 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА с применением прибора Bio-Plex Pro II Wash Station (Bio-Rad, США). В лунки планшета добавляют по 100 мкл раствора 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 300 мМ хлорида натрия, 5 мМ ЭДТА, содержащего конъюгат биотинилированной ДНК с нейтравидином в количестве 0,1 мкг ДНК на пробирку, и инкубируют планшет при встряхивании в течение 30 минут при комнатной температуре, после чего троекратно промывают парамагнитные частицы раствором, содержащим 20 мМ трис-HCl рН 7,5, 300 мМ хлорида натрия с применением прибора Bio-Plex Pro II Wash Station (Bio-Rad, США).

После полного удаления промывочного раствора в лунки планшета разносят по 50 мкл однократный буферный раствор для эндонуклеазы рестрикции Sac I, содержащий фермент Sac I в концентрации 50 ед/мл. Планшет инкубируют при 37°С в течение 1 часа, помещают планшет на магнитную плату и переносят супернатант из лунок планшета в пробирки для ПЦР. К 1/10 отобранного супернатанта добавляют смесь для ПЦР-амплификации в режиме реального времени.

Пример 5. Проведение ПЦР-амплификации с флюоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени для определения протективного антигена сибирской язвы способом иммунодетекции, сопряженной с ПЦР-амплификацией.

Для проведения ПЦР-амплификации в режиме реального времени в пробирки для ПЦР, содержащие по 5 мкл продуктов рестрикции ДНК-матрицы, отобранных с парамагнитных частиц, обработанных рестриктазой Sac I, разносят по 50 мкл 1х реакционную смесь для амплификации (Реакционная смесь 2,5х для проведения ПЦР-РВ, "Синтол", Россия), содержащую по 300 нМ каждого из праймеров для амплификации, 1 единицу рекомбинантной Taq-полимеразы и 200 нМ зонда TaqMan (фиг.3). Реакцию амплификации проводят на приборе для ПЦР амплификации в режиме реального времени MiniOpticon Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, США) с использованием следующего протокола:

Шаг Время Температура 1 10 минут 95°С 2 15 секунд 95°С 4 1 минута 57°С 5 Регистрация флюоресценции   6 Перейти к шагу 2 49 раз   8 Постоянное охлаждение пробы 10°С

Регистрацию нарастания флюоресценции ведут при длине волны 520 нм. Пробы, содержащие протективный антиген сибирской язвы, показывают нарастание флюоресценции с 5 по 30 цикл реакции амплификации (фиг.5). Нарастания флюоресценции в контрольных пробах в этом диапазоне циклов реакции не обнаруживают. Применив калибровочную кривую, построенную на основании зависимости номера цикла, на котором начинает регистрироваться изменение флюоресценции, от значений концентрации белка протективного антигена в контрольных образцах, определяют концентрацию белка протективного антигена в исследуемых пробах.

Изобретение относится к области биотехнологии, медицинской биохимии, диагностической медицинской микробиологии, прикладной иммунохимии и разработке диагностических тест-систем. Разработан новый способ определения протективного антигена сибирской язвы на основе иммунодетекции, сопряженной с полимеразной цепной реакцией. Способ обладает высокой чувствительностью и специфичностью, позволяющими быстро провести диагностику накопления белка протективного антигена сибирской язвы на ранних стадиях инфекции. 5 ил., 4 пр.

Способ определения протективного антигена сибирской язвы на основе иммунодетекции, сопряженной с полимеразной цепной реакцией, включающий адсорбцию белка протективного антигена на парамагнитных частицах или хроматографических матрицах, несущих иммобилизованный белок G бактерий семейства Streptococcus, при помощи специфического моноклонального антитела, связывание иммобилизованного белка протективного антигена при помощи биотинилированного моноклонального антитела, узнающего другой эпитоп белка протективного антигена, детекцию комплекса белка протективного антигена с биотинилированным антителом посредством нековалентного конъюгата фрагментов ДНК с нейтравидином, освобождение ДНК-матрицы из образованного твердофазного комплекса при помощи эндонуклеазы рестрикции с последующим проведением ее ПЦР-амплификации с флюоресцентной детекцией сигнала в режиме реального времени и регистрацией присутствия протективного антигена в исследуемых образцах по изменению уровня флюоресценции в соответствующих лунках планшета или пробирках стрипа против контрольных.