АНТИТЕЛА К РЕЦЕПТОРУ IGF-I Российский патент 2011 года по МПК C07K16/28 C07K19/00 C12N5/18 C12N15/63 C12N15/13 A61K39/395 A61P35/00 

Текст описания приведен в факсимильном виде.

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии. Предложены варианты антител, каждое из которых специфически связывается с IGF-IR, ингибирует его активность и является его антагонистом, не обладая по существу агонистической активностью по отношению к IGF-IR. Каждое из антител характеризуется, по крайней мере, наличием вариабельной области тяжелой и легкой цепи. Описаны: конъюгаты антитела с цитотоксическими агентами, а также варианты фармацевтической композиции для диагностики и терапии рака, способы лечения и диагностики рака, реагент для диагностики рака - на основе антител. Раскрыты: способ получения антител; нуклеиновая кислота (НК), кодирующая антитело; вектор экспрессии, включающий НК. Предложена гибридома ЕМ 164, продуцирующая антитело по изобретению, депонированная в АТСС под номером РТА-4457, а также использование антитела для связывания IGF-IR. Использование изобретения обеспечивает антитела, которые позволяют ингибировать рост клеток MCF примерно в 12 раз, что примерно в 5 раз выше, чем при использовании антитела IR3, и могут быть использованы для диагностики и лечения опухолей, экспрессирующих повышенные уровни рецептора IGF-I, таких, как рак груди, рак толстого кишечника, рак легкого, рак простаты, рак яичников, синовиальная карцинома и рак поджелудочной железы. 34 н. и 24 з.п. ф-лы, 28 ил., 10 табл.

1. Антитело или его фрагмент, специфически связывающееся с рецептором инсулин-подобного ростового фактора I (IGF-IR), являющиеся антагонистами данного рецептора и, по существу, не обладающие агонистической активностью по отношению к данному рецептору, и содержащие по крайней мере шесть областей, определяющих комплементарность, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1-6.

2. Антитело или его фрагмент по п.1, которые являются поверхностно-перестроенными.

3. Антитело или его фрагмент по п.1, которые являются антителом или фрагментом антитела человека или являются гуманизированными.

4. Антитело или его фрагмент по п.1, содержащие по крайней мере одну тяжелую цепь и по крайней мере одну легкую цепь, причем тяжелая цепь включает три последовательные области, определяющие комплементарность, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:1-3, а легкая цепь включает три последовательные области, определяющие комплементарность, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:4-6.

5. Антитело или его фрагмент по п.1, тяжелая цепь которого имеет аминокислотную последовательность, которая обнаруживает по крайней мере 90%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7.

6. Антитело или его фрагмент по п.5, тяжелая цепь которого имеет аминокислотную последовательность, которая обнаруживает по крайней мере 95%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7.

7. Антитело или его фрагмент по п.5, тяжелая цепь которого имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:7.

8. Антитело или его фрагмент по п.1, легкая цепь которого имеет аминокислотную последовательность, которая обнаруживает по крайней мере 90%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8.

9. Антитело или его фрагмент по п.8, легкая цепь которого имеет аминокислотную последовательность, которая обнаруживает по крайней мере 95%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8.

10. Антитело или его фрагмент по п.8, легкая цепь которого имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:8.

11. Антитело или его фрагмент по п.1, где указанный рецептор инсулин-подобного ростового фактора I (IGF-IR) представляет собой IGF-IR человека.

12. Антитело или его фрагмент по п.1, обладающие по крайней мере одним свойством, выбранным из группы, включающей:
а) ингибирование клеточной функции IGF-IR без активации IGF-IR;
б) ингибирование роста опухолевых клеток в присутствии сыворотки по крайней мере на 80%;
в) связывание с IGF-IR с К_D 0,3·10^-9 М или менее;
г) ингибирование связывания IGF-I с IGF-IR;
д) ингибирование опосредованной IGF-I клеточной передачи сигнала посредством IGF-IR;
е) ингибирование индуцированного IGF-I фосфорилирования IGF-IR;
ж) ингибирование опосредованных IGF-I и IGF-II роста и выживаемости клеток;
з) связывание с клетками африканской зеленой мартышки, но не с клетками мыши, китайского хомячка или IGF-IR козы и
и) ингибирование активации IRS-1, Akt и Erk 1/2.

13. Антитело или его фрагмент по п.12, обладающие всеми указанными свойствами.

14. Антитело или его фрагмент по п.1, представляющие собой
а) иммуноглобулин (Ig) Gl-4, IgM, IgA1-2, IgD или IgE или происходящие из Ig;
б) одноцепочечное антитело, фрагмент одноцепочечного антитела (scFvs), Fab-фрагмент, F(ab)₂ - фрагмент или фрагмент, содержащий по крайней мере три CDRs.

15. Антитело или его фрагмент по п.1, способные ингибировать рост раковых клеток более чем на 80% в присутствии стимуляторов роста, выбранных из группы, включающей сыворотку, инсулин-подобный ростовой фактор I и инсулин-подобный ростовой фактор II.

16. Антитело по п.15, отличающееся тем, что указанные клетки являются раковыми клетками человека.

17. Антитело или его фрагмент, специфически связывающиеся с рецептором инсулин-подобного ростового фактора I (IGF-IR), содержащие вариабельный участок легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO:9-12, и вариабельный уасток тяжелой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:13.

18. Антитело или его фрагмент, специфически связывающиеся с рецептором инсулин-подобного ростового фактора I (IGF-IR), предназначенные для связывания его эпитопов, содержащие по крайней мере одну тяжелую цепь и по крайней мере одну легкую цепь, причем тяжелая цепь включает три последовательные области, определяющие комплементарность, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:1-3, а легкая цепь включает три последовательные области, определяющие комплементарность, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO:4-6.

19. Антитело или его фрагмент, специфически связывающиеся с рецептором инсулин-подобного ростового фактора I (IGF-IR), предназначенные для связывания его эпитопов, содержащие по крайней мере одну тяжелую цепь и одну легкую цепь, тяжелая цепь которого имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:7, или которая обнаруживает по крайней мере 90%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7.

20. Антитело или его фрагмент по п.19, тяжелая цепь которого имеет аминокислотную последовательность, которая обнаруживает по крайней мере 95%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:7.

21. Применение антитела или его фрагмента, содержащего по крайней мере одну тяжелую цепь и одну легкую цепь, легкая цепь которого имеет аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO:8, или которая обнаруживает по крайней мере 90%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8, для связывания и ингибирования рецептора инсулин-подобного ростового фактора I (IGF-IR).

22. Применение по п.21, при котором легкая цепь антитела или его фрагмента имеет аминокислотную последовательность, которая обнаруживает по крайней мере 95%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:8.

23. Фармацевтическая композиция для терапии и диагностики рака, содержащая антитело или его фрагмент по п.1 в фармацевтически приемлемой дозе и фармацевтически приемлемый носитель.

24. Конъюгат, применимый в терапии и диагностике рака, состоящий из антитела или его фрагмента по п.1, связанных с цитотоксическим агентом.

25. Конъюгат по п.24, в котором цитотоксический агент выбран из группы, включающей мэйтанзиноид, малое лекарственное соединение, пролекарство, таксоид, СС-1065 и аналог СС-1065.

26. Фармацевтическая композиция для терапии и диагностики рака, содержащая конъюгат по п.24 в фармацевтически приемлемой дозе и фармацевтически приемлемый носитель.

27. Реагент для диагностики рака, содержащий композицию по п.23 или 26, причем антитело или его фрагмент являются меченными.

28. Реагент по п.27, где метка выбрана из группы, включающей радиоактивную метку, флуорофор, хромофор, агент, создающий изображение, и ион металла.

29. Способ ингибирования роста раковых клеток, включающий контактирование указанных клеток с антителом или его фрагментом по п.1.

30. Способ лечения больного раком, включающий введение указанному больному эффективного количества антитела или его фрагмента по п.1.

31. Способ по п.29, дополнительно включающий введение указанному больному терапевтического агента.

32. Способ по п.30, в котором указанный терапевтический агент представляет собой цитотоксический агент.

33. Способ по п.29, в котором раковое заболевание выбрано из группы, включающей рак груди, рак толстого кишечника, рак яичников, остеосаркому, рак шейки матки, рак простаты, рак легкого, синовиальную карциному и рак поджелудочной железы.

34. Способ лечения больного раком, включающий введение указанному больному эффективного количества конъюгата по п.23.

35. Способ диагностики рака у пациента, включающий введение указанному пациенту диагностического реагента по п.27 и выявление распределения указанного реагента в организме пациента.

36. Способ по п.35, в котором раковое заболевание выбрано из группы, включающей рак груди, рак толстого кишечника, рак яичников, остеосаркому, рак шейки матки, рак простаты, рак легкого, синовиальную карциному и рак поджелудочной железы.

37. Антитело или его фрагмент, которые специфически связываются с рецептором инсулин-подобного ростового фактора I, полученные путем
а) получения ДНК, кодирующей антитело или его фрагмент, содержащих по крайней мере одну последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO:1-8,
б) введения по крайней мере одной нуклеотидной мутации, делеции или инсерции в указанную ДНК таким образом, что аминокислотная последовательность указанного антитела или его фрагмента, кодируемые указанной ДНК, изменяется;
в) обеспечения экспрессии указанного антитела или его фрагмента:
г) скрининга экспрессированного антитела или его фрагмента на увеличение аффинности связывания с рецептором IGF-I по сравнению с антителом на этапе а) с получением улучшенных в этом отношении антитела или его фрагмента.

38. Антитело или его фрагмент по п.37, в которых по крайней мере одна указанная нуклеотидная мутация, делеция или инсерция создана методом, выбранным из группы, включающей опосредованный олигонуклеотидами сайт-направленный мутагенез, кассетный мутагенез, введение ошибок с помощью PCR, "перетасовка" ДНК или получение штаммов-мутаторов Е. coli.

39. Полинуклеотид, кодирующий антитело или его фрагмент по любому из пп.18 или 19.

40. Полинуклеотид, кодирующий легкую цепь антитела или его фрагмента по п.18.

41. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.39 и представляющий собой вектор экспрессии, способный экспрессировать указанные антитело или его фрагмент.

42. Вектор, содержащий полинуклеотид по п.40 и представляющий собой вектор экспрессии, способный экспрессировать указанные антитело или его фрагмент.

43. Антитело мыши ЕМ 164, продуцируемое гибридомной клеточной линией, депонированной в Американской коллекции типовых культур под номером РТА-4457, или его эпитоп-связывающий фрагмент, специфически связывающиеся с рецептором инсулин-подобного ростового фактора I, являющиеся антагонистами данного рецептора и, по существу, не обладающие агонистической активностью по отношению к данному рецептору.

44. Гуманизированное или поверхностно-перестроенное антитело, полученное из антитела ЕМ 164, продуцируемого гибридомной клеточной линией, депонированной в Американской коллекции типовых культур под номером РТА-4457, или его эпитоп-связывающий фрагмент, специфически связывающиеся с рецептором инсулин-подобного ростового фактора I, являющиеся антагонистами данного рецептора и, по существу, не обладающие агонистической активностью по отношению к данному рецептору.

45. Гибридомная клеточная линия ЕМ 164, продуцирующая антитело мыши ЕМ 164, депонированная в Американской коллекции типовых культур под номером РТА-4457.

46. Способ индуцирования апоптоза в раковой клетке, включающий контактирование указанной клетки с антителом или его фрагментом по п.1.

47. Способ индуцирования апоптоза в раковой клетке, включающий контактирование указанной клетки с антителом или его фрагментом по п.43.

48. Способ индуцирования апоптоза в раковой клетке, включающий контактирование указанной клетки с антителом или его фрагментом по п.44.

49. Клетка-хозяин, экспрессирующая полипептиды, содержащая вектор по п.41.

50. Клетка-хозяин, экспрессирующая полипептиды, содержащая вектор по п.42.

51. Способ получения антитела к IGF-IR или его фрагмента, включающий культивирование клетки-хозяина по п.49 в условиях, подходящих для экспрессии антитела к IGF-IR или его фрагмента, и выделение указанного антитела к IGF-IR или его фрагмента.

52. Способ получения антитела к IGF-IR или его фрагмента, включающий культивирование клетки-хозяина по п.50 в условиях, подходящих для экспрессии антитела к IGF-IR или его фрагмента, и выделение указанного антитела к IGF-IR или его фрагмента.

53. Применение антитела или его фрагмента, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NOS:1, 54, 3, 4, 5 и 6, для связывания и ингибирования рецептора инсулин-подобного ростового фактора I (IGF-IR).

54. Антитело или его фрагмент, специфически связывающиеся с рецептором инсулин-подобного ростового фактора I (IGF-IR), содержащие аминокислотную последовательность, включающую SEQ ID NOS: 1, 54, 3, 4, 5 и 6.

55. Антитело или его фрагмент, специфически связывающиеся с рецептором инсулин-подобного ростового фактора I (IGF-IR), содержащие легкую и тяжелую цепи антитела или фрагмента антитела, включающие область, определяющую комплементарность, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID NOS: 1, 54, 3, 4, 5 и 6, причем тяжелая цепь включает три области, определяющие комплементарность, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NOS: 1, 54 и 3, и легкая цепь включает три области, определяющие комплементарность, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NOS:4, 5 и 6.

56. Антитело или его фрагмент, специфически связывающиеся с рецептором инсулин-подобного ростового фактора I (IGF-IR), содержащие по крайней мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по крайней мере одну вариабельную область легкой цепи, причем вариабельная область тяжелой цепи содержит три области, определяющие комплементарность, включающие SEQ ID NOS: 1, 54, 3, и вариабельная область легкой цепи содержит три области, определяющие комплементарность, включающие SEQ ID NOS: 4, 5 и 6.

57. Антитело или его фрагмент, специфически связывающиеся с рецептором инсулин-подобного ростового фактора I (IGF-IR), содержащие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем вариабельная область тяжелой цепи содержит области, определяющие комплементарность, включающие SEQ ID NOS: 1, 54, 3, и вариабельная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.

58. Антитело или его фрагмент, специфически связывающиеся с рецептором инсулин-подобного ростового фактора I (IGF-IR), содержащие по крайней мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по крайней мере одну вариабельную область легкой цепи, причем вариабельная область тяжелой цепи содержит три области, определяющие комплементарность, включающие аминокислотные последовательности SEQ ID NOS: 1, 54, 3, входящие в состав последовательности SEQ ID NO: 7, и вариабельная область легкой цепи содержит три области, определяющие комплементарность, включающие аминокислотные последовательности SEQ ID NOS: 4, 5 и 6.