Данная заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США № 62/858949, поданной 7 июня 2019 года, содержание которой включено посредством ссылки во всей своей полноте.
Перечень последовательностей
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и настоящим включен посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная копия в формате ASCII, созданная 3 июня 2020 года, имеет название 1160430o001813.txt и размер 92322 байт.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится, среди прочего, к антителам к кластеру дифференцировки 3 (CD3), в том числе к мультиспецифическим антителам и их функциональным фрагментам, а также к способам и реагентам для их идентификации, выделения, получения и применения.
Предпосылки к созданию изобретения
Клеточные пролиферативные нарушения, такие как рак, характеризуются неконтролируемым ростом субпопуляций клеток. Они являются основной причиной смерти в развитом мире и второй по значимости причиной смерти в развивающихся странах, при этом ожидается, что общее число новых случаев рака в год к 2030 году вырастет до 23,6 миллиона. По оценкам Национального института рака в США будет диагностировано почти 2 миллиона новых случаев рака, и более 600000 американцев умрут от рака в 2018 году. Таким образом, онкологическая помощь представляет собой значительную и постоянно возрастающую нагрузку на общество.
Идея использования цитотоксической способности Т-клеток для уничтожения опухолевых клеток путем применения биспецифических антител, целенаправленно воздействующих на CD3, возникла в середине 1980-х годов. (Staerz et al. Nature 1985 314: 628-32). Многие биспецифические антитела, разработанные на сегодняшний день, содержат первый сайт связывания, специфичный в отношении CD3, для рекрутинга и активации Т-клеток, и второй сайт связывания для целевого антигена, ассоциированного с заболеванием, такого как антиген, вырабатываемый опухолевой клеткой. Биспецифические антитела к CD3 активируют поверхностный рецептор CD3 на Т-клетках путем связывания со своим вторым белком-мишенью, экспрессируемым на опухолях, так что доступные Т-клетки могут связываться с экспрессирующими мишень клетками посредством связывания биспецифическим антителом к CD3, независимо от специфичности пептида/МНС их Т-клеточного рецептора. (См., например, Bassan, 2012, Blood 120:5094-95). Связывание Т-клеток и опухолевых клеток с помощью биспецифических антител к CD3 может вызвать резкую регрессию злокачественных новообразований на поздних стадиях и, в некоторых случаях, привести к полной ремиссии. В настоящее время более 25 различных биспецифических антител к CD3 находятся в стадии клинической разработки для лечения гематологических злокачественных новообразований или видов солидного рака путем целенаправленного воздействия на CD19, CD20, CD33 и CD123 или EpCAM, HER2, PSMA и CEA соответственно. (См., например, Liu et al. Front Immunol 2017 8:38).
Хотя биспецифические антитела продемонстрировали значительные преимущества по сравнению с моноспецифическими антителами в отношении лечения и выявления рака, широкому коммерческому применению биспецифических антител препятствует отсутствие эффективных/недорогих способов получения, отсутствие стабильности биспецифических полипептидов и отсутствие длительного периода полужизни в организме человеке. За последние несколько десятилетий было разработано огромное количество способов получения биспецифических моноклональных антител. Однако многие кандидатные биспецифические антитела с исключительной селективностью и высокой эффективностью в отношении представляющей интерес мишени часто имеют проблемы при последующей разработке и в отношении показателей клинической эффективности, включая полиспецифическое связывание (или «полиспецифичность»); нецелевое связывание; неспецифическое связывание; низкие уровни или профили экспрессии в эукариотических клетках-хозяевах, таких как клетки-хозяева млекопитающих и дрожжевые клетки; неудовлетворительные химические и физические свойства, такие как неудовлетворительная стабильность при хранении (например, неудовлетворительная/низкая стабильность в течение срока годности), неудовлетворительная (низкая) растворимость, неудовлетворительная (высокая) вязкость, предрасположенность к агрегации и т.п.; и неудовлетворительные клинические и биофизические профили, такие как неудовлетворительные фармакокинетические профили, неудовлетворительные фармакодинамические профили, быстрая или неудовлетворительная скорость выведения in vivo, короткий период полужизни в кровотоке, некоторые из которых приводят к прекращению их разработки.
Существуют определенные методики и анализы для оценки многих из вышеупомянутых характеристик разрабатываемости для обнаруженных антител в контексте последующих мероприятий по разработке («антитела после обнаружения»), такие как CIC, SIC, BVP-ELISA, TMA и другие анализы; однако такие анализы обычно не подходят для высокопроизводительных форматов на платформах раннего обнаружения антител. Кроме того, для оценки этих свойств, как правило, требуются количества белка от миллиграммов до граммов, таким образом, зачастую налагается фактическое ограничение на целый ряд лидерных продуктов, которые, с прагматической точки зрения, можно рассматривать при разработке, и, следовательно, снижается вероятность успеха программы. Вследствие этого, значительные ресурсы зачастую тратятся на попытки усовершенствования лидерных продуктов-кандидатов с неудовлетворительным поведением с помощью небольшого числа запасных вариантов, доступных на более поздних стадиях разработки.
В уровне техники известны различные антитела к CD3, включая форматы моноклональных и биспецифических антител. См., например, патенты США №№ 7262276; 7635472; 7862813; 9587021 и 10174124. Однако многие из этих антител к CD3 имеют проблемы разрабатываемости, такие как описанные выше, и/или обладают недостаточно высокой аффинностью связывания с CD3 для конкретного мультиспецифического формата или формата химерного антигенного рецептора (CAR), подхода к доставке или тому подобного. Соответственно, существует неудовлетворенная потребность в области биспецифических антител в отношении антител к CD3, которые демонстрируют необходимые профили разрабатываемости и обладают высокой аффинностью к CD3, для применения в лечении рака.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к антителам к CD3 и способам их применения, причем эти антитела характеризуются особенно высокой аффинностью к CD3, например моновалентной KD, составляющей приблизительно 250 пикомолей или менее.
В настоящем изобретении предусмотрено антитело и/или антигенсвязывающий фрагмент к CD3, содержащий определяющий комплементарность участок (CDR) в вариабельном участке легкой цепи, CDRL3, где CDRL3 содержит аминокислотную последовательность X1QSYFRRT (SEQ ID NO: 1), где X1 представляет собой K, A, T или V. В некоторых вариантах осуществления X1 представляет собой A, T или V. В определенных вариантах осуществления CDRL3 содержит AQSYFRRT (SEQ ID NO: 2); TQSYFRRT (SEQ ID NO: 3); VQSYFRRT (SEQ ID NO: 4) или KQSYFRRT (SEQ ID NO: 5).
В некоторых вариантах осуществления антитело и/или антигенсвязывающий фрагмент к CD3 дополнительно содержит определяющий комплементарность участок (CDR) в вариабельном участке тяжелой цепи, CDRH3, где CDRH3 содержит аминокислотную последовательность X3RDAYGX4YFYDV (SEQ ID NO: 6), где X3 представляет собой A или V, и X4 представляет собой R или Q. В определенных вариантах осуществления X3 представляет собой A.
В других вариантах осуществления антитело и/или антигенсвязывающий фрагмент к CD3 дополнительно содержит определяющий комплементарность участок (CDR) в вариабельном участке легкой цепи, CDRL1, где CDRL1 содержит аминокислотную последовательность KSSQSLLNARTX5KNYLA (SEQ ID NO: 7), где X5 представляет собой G, M, N или R. В определенных вариантах осуществления X5 представляет собой G или R. В некоторых вариантах осуществления CDRL1 может содержать KSSQSLLNARTGKNYLA (SEQ ID NO: 8) или KSSQSLLNARTRKNYLA (SEQ ID NO: 9).
В некоторых вариантах осуществления антитело и/или антигенсвязывающий фрагмент к CD3 дополнительно содержит определяющий комплементарность участок (CDR) в вариабельном участке легкой цепи, CDRL2, где CDRL2 содержит аминокислотную последовательность WASTRES (SEQ ID NO: 10) или WASTRSS (SEQ ID NO: 11).
В некоторых вариантах осуществления антитело и/или антигенсвязывающий фрагмент к CD3 дополнительно содержит определяющий комплементарность участок (CDR) в вариабельном участке тяжелой цепи, CDRH1, где CDRH1 содержит аминокислотную последовательность FNX6KDYYX7H (SEQ ID NO: 12), где X6 представляет собой I, N или V, и X7 представляет собой M или I. В определенных вариантах осуществления X6 представляет собой I, и/или X7 представляет собой M. В определенных вариантах осуществления CDRH1 содержит FNIKDYYMH (SEQ ID NO: 13).
В некоторых вариантах осуществления антитело и/или антигенсвязывающий фрагмент к CD3 дополнительно содержит определяющий комплементарность участок (CDR) в вариабельном участке тяжелой цепи, CDRH2, где CDRH2 содержит аминокислотную последовательность WIDLX8NANTVYDX9KX10QG (SEQ ID NO: 14), где X8 представляет собой E или N, X9 представляет собой A, H или T, и X10 представляет собой F или L. В определенных вариантах осуществления X8 представляет собой E, и/или X9 представляет собой A, и/или X10 представляет собой F. В определенных вариантах осуществления CDRH2 содержит WIDLENANTVYDAKFQG (SEQ ID NO: 15) или WIDLENANTIYDAKFQG (SEQ ID NO: 16).
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрено антитело к CD3 и/или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий один или более из CDRL1, CDRL2 и CDRL3. Такое антитело в некоторых вариантах осуществления дополнительно содержит CDRH1, CDRH2 и CDRH3.
В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, характеризуются аффинностью связывания (KD), составляющей приблизительно 500 пМ или меньше. В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты характеризуются аффинностью связывания (KD), составляющей приблизительно 250 пМ или меньше. В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты характеризуются аффинностью связывания (KD), составляющей приблизительно 100 пМ или меньше.
Более того, настоящее изобретение в целом относится к антителу или антигенсвязывающему фрагменту антитела к кластеру дифференцировки три («CD3»), где указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат: a. полипептид вариабельного участка тяжелой цепи (VH), содержащий: i. CDR1 VH (CDRH1) с FNIKDYYMH (SEQ ID NO: 13); ii. CDR2 VH (CDRH2) с WIDLENANTVYDAKFQG (SEQ ID NO: 15); iii. CDR3 VH (CDRH3) с ARDAYGRYFYDV (SEQ ID NO: 103); и/или b. полипептид вариабельного участка легкой цепи (VL), содержащий: i. CDR1 VL (CDRL1) с KSSQSLLNARTGKNYLA (SEQ ID NO: 8); ii. CDR2 VL (CDRL2) с WASTRX1S (SEQ ID NO: 133); и iii. CDR3 VL (CDRL3) с X2QSYFRRT (SEQ ID NO: 134); каждый из X1 и X2 независимо представляет собой любую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления X1 представляет собой E или S; и/или X2 представляет собой K или V. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела содержат CDRL2 с SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11 и/или CDRL3 с SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 выбраны из группы, состоящей из: a. тех, которые содержат CDR1 цепи VH (CDRH1) с FNIKDYYMH (SEQ ID NO: 13), CDR2 цепи VH (CDRH2) с WIDLENANTVYDAKFQG (SEQ ID NO: 15) и CDR3 цепи VH (CDRH3) с ARDAYGRYFYDV (SEQ ID NO: 103) и/или CDR1 цепи VL (CDRL1) с KSSQSLLNARTGKNYLA (SEQ ID NO: 8), CDR2 цепи VL (CDRL2) с WASTRES (SEQ ID NO: 10) и CDR3 цепи VL (CDRL3) с KQSYFRRT (SEQ ID NO: 5); и b. тех, которые содержат CDR1 цепи VH (CDRH1) с FNIKDYYMH (SEQ ID NO: 13), CDR2 цепи VH (CDRH2) с WIDLENANTVYDAKFQG (SEQ ID NO: 15) и CDR3 цепи VH (CDRH3) с ARDAYGRYFYDV (SEQ ID NO: 103) и/или CDR1 цепи VL (CDRL1) с KSSQSLLNARTGKNYLA (SEQ ID NO: 8), CDR2 цепи VL (CDRL2) с WASTRSS (SEQ ID NO: 11) и CDR3 цепи VL (CDRL3) с VQSYFRRT (SEQ ID NO: 4).
В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VL, содержащий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VL, содержащий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VL, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VH, содержащий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VH, содержащий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат цепь VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VL, содержащий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 34; и полипептид цепи VH, содержащий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VL, содержащий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 34; и полипептид цепи VH, содержащий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VL, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 34; и цепь VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VL, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18; и цепь VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VL, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34; и цепь VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17.
В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 связываются с CD3 с константой диссоциации (KD), составляющей приблизительно 500 пМ или меньше, приблизительно 450 пМ или меньше, приблизительно 400 пМ или меньше, приблизительно 350 пМ или меньше, приблизительно 300 пМ или меньше, приблизительно 250 пМ или меньше, приблизительно 200 пМ или меньше, приблизительно 150 пМ или меньше или приблизительно 100 пМ или меньше, где необязательно указанный CD3 является человеческим и/или яванского макака, где еще более необязательно указанная аффинность связывания измерена при помощи поверхностного плазмонного резонанса. В некоторых вариантах осуществления указанная KD представляет собой моновалентную KD, и/или указанная KD измерена с использованием scFv-фрагмента указанных антитела или фрагмента антитела к CD3.
В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела вызывают активацию Т-клеток или T-клеточный цитолиз, демонстрируя при этом сниженную предрасположенность вызывать продуцирование цитокинов до уровней, способных индуцировать синдром высвобождения цитокинов. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела предусматривает мультиспецифическое антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела предусматривает биспецифическое антитело. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела предусматривает scFv. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела содержит по меньшей мере второй антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с целевым антигеном онкологического заболевания; целевым антигеном иммуноонкологического заболевания; целевым антигеном нейродегенеративного заболевания; целевым антигеном аутоиммунного нарушения; целевым антигеном инфекционного заболевания; целевым антигеном метаболического заболевания; целевым антигеном когнитивного нарушения; целевым антигеном гематоэнцефалического барьера или целевым антигеном заболевания крови. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела содержит по меньшей мере второй антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с антигеном, выбранным из группы, состоящей из: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-кето-PGFla, 8-изо-PGF2a, 8-оксо-dG, аденозинового рецептора A1, A33, ACE, ACE-2, активина, активина A, активина AB, активина B, активина C, активина RIA, активина RIA ALK-2, активина RIB ALK-4, активина RIIA, активина RUB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM 15, ADAM 17/T ACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, адрессинов, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, альфа-1-антитрипсина, антагониста альфа-V/бета-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, артемина, антиидиотипа, ASPARTIC, предсердного натрийуретического фактора, интегрина av/b3, Ax1, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, стимулятора B-лимфоцитов (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bel, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BFM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, остеогенина BMP-3, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, бомбезина, костного нейротрофического фактора, BPDE, BPDE-DNA, BTC, фактора 3 комплемента (C3), C3a, C4, C5, C5a, CIO, CA125, CAD-8, кальцитонина, cAMP, раково-эмбрионального антигена (CEA), ассоциированного с карциномой антигена, катепсина A, катепсина B, катепсина C/DPPI, катепсина D, катепсина E, катепсина H, катепсина L, катепсина O, катепсина S, катепсина V, катепсина X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL 14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (белки p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, токсина Clostridium botulinum, токсина Clostridium perfringens, CKb8-l, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, цитокератинового опухолеассоциированного антигена, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, стимулятора гемолиза, дез(l-3)-IGF-I (IGF-1 головного мозга), Dhh, дигоксина, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, EN A, эндотелинового рецептора, энкефалиназы, eNOS, Eot, эотаксина l, EpCAM, эфрина B2/ EphB4, EPO, ERCC, E-селектина, ET-1, фактора Ila, фактора VII, фактора VIIIc, фактора IX, белка активации фибробластов (FAP), Fas, FcRl, FEN-1, ферритина, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, фибрина, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, фолликулостимулирующего гормона, фракталкина, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (миостатин), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-альфа 1, GFR-альфа 2, GFR-альфа 3, GITR, глюкагона, Glut 4, гликопротеина I1b/IIIa (GP I1b/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, соматотропин-рилизинг-фактора, гаптена (NP-cap или NIP-cap), HB-EGF, HCC, гликопротеина оболочки gB HCMV, гликопротеина оболочки gH HCMV, HCMV UL, гемопоэтического фактора роста (HGF), Hep B gp120, гепараназы, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), гликопротеина gB вируса простого герпеса (HSV), гликопротеина gD HSV, HGFA, высокомолекулярного меланома-ассоциированного антигена (HMW-MAA), HIV gpl20, V3-петли gp 120 HIV IIIB, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, сердечного миозина человека, цитомегаловируса человека (HCMV), гормона роста человека (HGH), HVEM, 1-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, рецептора IgA, IgE, IGF, IGF-связывающих белков, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, альфа-интерферона (INF), INF-бета, INF-гамма, ингибина, iNOS, А-цепи инсулина, B-цепи инсулина, инсулиноподобного фактора роста 1, альфа-2-интегрина, альфа-3-интегрина, альфа-4-интегрина, альфа-4/бета-l-интегрина, альфа-4/бета-7-интегрина, альфа-5(альфа-V)-интегрина, альфа-5/бета-l-интегрина, альфа-5/бета-3-интегрина, альфа-6-интегрина, бета-l-интегрина, бета-2-интегрина, гамма-интерферона, IP-10, 1-TAC, JE, калликреина 2, калликреина 5, калликреина 6, калликреина 11, калликреина 12, калликреина 14, калликреина 15, калликреина LI, калликреина L2, калликреина L3, калликреина L4, KC, KDR, фактора роста кератиноцитов (KGF), ламинина 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), латентного TGF-1, bpl латентного TGF-1, LBP, LDGF, LECT2, Lefty, антигена Lewis-Y, Lewis-Y-родственного антигена, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, липопротеинов, LIX, LKN, Lptn, L-селектина, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, легочного сурфактанта, лютеинизирующего гормона, рецептора бета-лимфотоксина, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, металлопротеазы, рецептора MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-альфа, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, муцина (Mucl), MUC18, антимюллерова гормона, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-кадгерина, NCA 90, NCAM, NCAM, неприлизина, нейротрофина-3, -4 или -6, нейротурина, фактора роста нейронов (NGF), NGFR, NGF-бета, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, pl50, p95, PADPr, паратиреоидного гормона, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-кадгерина, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, щелочной фосфатазы плаценты (PLAP), PIGF, PLP, PP14, проинсулина, прорелаксина, C-белка, PS, PSA, PSCA, простат-специфического мембранного антигена (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, А-цепи релаксина, B-цепи релаксина, ренина, F респираторного синцитиального вируса (RSV), RSV Fgp, Ret, ревматоидных факторов, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, сывороточного альбумина, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (опухолеассоциированный гликопротеин-72), TARC, TCA-3, T-клеточных рецепторов (например, T-клеточного рецептора альфа/бета), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, PLAP-подобной щелочной фосфатазы семенников, TfR, TGF, TGF-альфа, TGF-бета, полиспецифического TGF-бета, RI TGF-бета (ALK-5), RII TGF-бета, R11b TGF-бета, RIII TGF-бета, TGF-бета 1, TGF-бета 2, TGF-бета 3, TGF-бета 4, TGF-бета 5, тромбина, Ck-1 тимуса, тиреотропного гормона, Tie, TIMP, TIQ, тканевого фактора, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-альфа, TNF-альфа/бета, TNF-бета 2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL Rl Apo-2, DR4), TNFRSFIOB (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcRl, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSFllB (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF 18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSFIA (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSFIB (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF 5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL Rl TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (лиганд TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (лиганд ODF TRANCE/RANK, лиганд OPG), TNFSF12 (лиганд TWEAK Apo-3, лиганд DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (лиганд LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TLIA/VEGI), TNFSF18 (лиганд GITR, лиганд AITR, TL6), TNFSFIA (конектин TNF-a, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (лиганд gp34 OX40, TXGP1), TNFSF5 (лиганд CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (Fas-лиганд, лиганд Apo-1, лиганд APT1), TNFSF7 (лиганд CD27 CD70), TNFSF8 (лиганд CD30 CD153), TNFSF9 (лиганд 4-1BB CD137), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, рецептора трансферрина, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, опухолеассоциированного антигена CA 125, опухолеассоциированного антигена, характеризующегося экспрессией углеводного антигена, родственного Lewis Y, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, урокиназы, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-кадгерина, VE-кадгерина-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VFM, вирусных антигенов, VLA, VLA-1, VLA-4, интегрина VNR, фактора фон Виллебранда, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, CTLA4 (антиген 4 цитотоксического Т-лимфоцита), PD1 (белок запрограммированной гибели клеток 1), PD-L1 (лиганд 1 белка запрограммированной гибели клеток), LAG-3 (ген активации лимфоцитов 3), TIM-3 (белок 3, содержащий домены T-клеточного иммуноглобулина и муцина), рецепторов гормонов и факторов роста.
В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела содержит по меньшей мере второй антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с антигеном, выбранным из группы, состоящей из: BCMA, CTLA4 (антиген цитотоксического Т-лимфоцита 4), PD1 (белок запрограммированной гибели клеток 1), PD-L1 (лиганд 1 белка запрограммированной гибели клеток), LAG-3 (ген активации лимфоцитов 3), TIM-3, CD20, CD2, CD19, Her2, EGFR, EpCAM, FcyRIIIa (CD16), FcyRIIa (CD32a), FcyRIIb (CD32b), FcyRI (CD64), Toll-подобных рецепторов (TLR), TLR4, TLR9, цитокинов, IL-2, IL-5, IL-13, IL-6, IL-17, IL-12, IL-23, TNFa, TGFb, рецепторов цитокинов, IL-2R, хемокинов, рецепторов хемокинов, факторов роста, VEGF и HGF. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела содержится в химерном антигенном рецепторе (CAR), который необязательно содержит по меньшей мере один трансмембранный домен и по меньшей мере один внутриклеточный домен от Т-клеточного рецептора, необязательно субъединицу CD3ζ, и по меньшей мере один костимулирующий домен. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела содержит scFv2-Fc2 и/или scFv-IgG. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела содержит константный домен IgG. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела содержит по меньшей мере второй антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с антигеном, где указанное антитело имеет мультиспецифический формат, выбранный из группы, состоящей из: Fab-Fc-scFv, «открывалки для бутылок», Mab-scFv, Mab-Fv, Dual scFv, центрального Fv, центрального scFv, центрального scFv с одним плечом, Fab-Fab, Fab-Fv, mAb-Fv, mAb-Fab, DART, BiTE, IgG с общей легкой цепью, TandAb, Cross-Mab, SEED, BEAT, TrioMab и DuetMab. Более того, настоящее изобретение в целом относится к выделенной или рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, описанные в данном документе. Кроме того, настоящее изобретение в целом относится к вектору экспрессии, содержащему выделенную или рекомбинантную последовательность нуклеиновой кислоты, описанную в данном документе. Кроме того, настоящее изобретение в целом относится к клетке-хозяину, трансфицированной, трансформированной или трансдуцированной последовательностью нуклеиновой кислоты, необязательно к клетке млекопитающего или дрожжей, или вектору, содержащему указанную последовательность нуклеиновой кислоты, описанную в данном документе.
Более того, настоящее изобретение в целом относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, описанные в данном документе; и фармацевтически приемлемый носитель и/или вспомогательное вещество.
Кроме того, настоящее изобретение в целом относится к способу лечения нарушения у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, где нарушение предусматривает пролиферативное нарушение, онкологическое нарушение, иммуноонкологическое нарушение, неврологическое нарушение, нейродегенеративное нарушение или аутоиммунное нарушение, предусматривающему введение эффективного количества одного или более антител или фрагментов антител, описанных в данном документе, или клетки-хозяина, которая экспрессирует одно из указанных антител или фрагментов антител, описанных в данном документе, необязательно иммунной клетки, более того необязательно Т- или NK-клетки. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно предусматривает введение млекопитающему дополнительного терапевтического средства, необязательно, где млекопитающее является человеком.
Более того, настоящее изобретение в целом относится к антителу или фрагменту антитела к кластеру дифференцировки три («CD3»), где указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат один или более CDR любого одного или более из Ab1-Ab50. Кроме того, настоящее изобретение в целом относится к антителу или фрагменту антитела к кластеру дифференцировки три («CD3»), где указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат одну или более цепей VH и/или VL, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей в таблице 4.
Подробное описание изобретения
Если не определено иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понятно рядовому специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Используемый в данном документе термин «приблизительно» при использовании в отношении конкретного указанного числового значения означает, что данное значение может отличаться от указанного значения не более чем на 1%. Например, используемое в данном документе выражение «приблизительно 100» включает 99 и 101 и все значения между ними (например, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4 и т.д.).
Следует понимать, что аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения, описанного в данном документе, включают «содержащий», «состоящий» и «фактически состоящий из» аспектов и вариантов осуществления.
В данном документе предусмотрены антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, которые характеризуются высокой аффинностью (KD) в отношении CD3. В некоторых вариантах осуществления KD антитела к CD3 составляет приблизительно 500 пМ или меньше. В некоторых вариантах осуществления KD составляет приблизительно 250 пМ или меньше. В некоторых вариантах осуществления KD составляет приблизительно 100 пМ или меньше. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 связываются с CD3 с константой диссоциации (KD), составляющей приблизительно 500 пМ или больше, приблизительно 500 пМ или меньше, приблизительно 470 пМ или меньше, приблизительно 450 пМ или меньше, приблизительно 400 пМ или меньше, приблизительно 350 пМ или меньше, приблизительно 300 пМ или меньше, приблизительно 250 пМ или меньше, приблизительно 200 пМ или меньше, приблизительно 150 пМ или меньше или приблизительно 100 пМ или меньше, где необязательно указанный CD3 является человеческим и/или яванского макака, где еще более необязательно указанная аффинность связывания измерена при помощи поверхностного плазмонного резонанса. В некоторых вариантах осуществления указанная KD представляет собой моновалентную KD, и/или указанная KD измерена с использованием scFv-фрагмента указанных антитела или фрагмента антитела к CD3. В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты содержат определенные мотивы последовательностей CDR. В некоторых вариантах осуществления мотив последовательности CDR включает CDRL3, содержащую SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3 обладают подходящими профилями разрабатываемости.
Иллюстративные высокоаффинные антитела к CD3 и их антигенсвязывающие фрагменты
«Кластер дифференцировки 3» или «CD3» в целом относится к любому нативному CD3 из любого позвоночного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди) и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иное, включая, например, цепи CD3ε, CD3γ, CD3α и CD3β. Данный термин охватывает «полноразмерный», непроцессированный CD3 (например, непроцессированный или немодифицированный CD3ε или CD3γ), а также любую форму CD3, которая возникает в результате процессинга в клетке. Данный термин также охватывает встречающиеся в природе варианты CD3, в том числе, например, сплайс-варианты или аллельные варианты. CD3 включает, например, белок CD3ε человека (№ эталонной последовательности в NCBI NP-000724), длина которого составляет 207 аминокислот, и белок CD3γ человека (№ эталонной последовательности в NCBI NP-000064), длина которого составляет 182 аминокислоты. Термин также относится к белку CD3-эпсилон либо человека, либо яванского макака, аминокислотная последовательность которого представляет собой SEQ ID NO: 131 и 132 соответственно (таблица 7). «CD3εN27» и «CD3εN13» означают соответственно 27 N-концевых аминокислот и 13 N-концевых аминокислот CD3, и они необязательно содержат химические модификации или с ними осуществлены конъюгации.
Выражение «антитело к CD3» относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способному связываться с CD3, например CD3ε и/или CD3γ, например CD3ε и/или CD3γ человека, с достаточной аффинностью и/или специфичностью, такой, что антитело полезно в качестве диагностического и/или терапевтического средства для целенаправленного воздействия на CD3. Описанные в данном документе антитела к CD3 и их антигенсвязывающие фрагменты характеризуются особенно высокой аффинностью к CD3.
Термин «высокая аффинность» относится к тем антителам, которые обладают аффинностью связывания с CD3, выраженной как KD. В некоторых вариантах осуществления KD составляет приблизительно 5 x 10-10 M или меньше. В некоторых вариантах осуществления KD составляет приблизительно 2,5 x 10-10 M или меньше. В некоторых вариантах осуществления KD составляет приблизительно 1 x 10-11 M или меньше. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 связываются с CD3 с константой диссоциации (KD), составляющей приблизительно 500 пМ или больше, приблизительно 500 пМ или меньше, приблизительно 470 пМ или меньше, приблизительно 450 пМ или меньше, приблизительно 400 пМ или меньше, приблизительно 350 пМ или меньше, приблизительно 300 пМ или меньше, приблизительно 250 пМ или меньше, приблизительно 200 пМ или меньше, приблизительно 150 пМ или меньше или приблизительно 100 пМ или меньше, где необязательно указанный CD3 является человеческим и/или яванского макака, где еще более необязательно указанная аффинность связывания измерена при помощи поверхностного плазмонного резонанса. В некоторых вариантах осуществления KD измеряют при помощи поверхностного плазмонного резонанса, например BIACORE, путем измерений интерферометрии биослоев с использованием, например, прибора FORTEBIO Octet HTX (Pall Life Sciences) или путем определения аффинности в растворе способом ELISA. В некоторых вариантах осуществления KD измеряют с использованием scFv-фрагмента антитела к CD3. В некоторых вариантах осуществления измеряют моновалентную KD.
В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 связывается с CD3 с константой диссоциации (KD), составляющей менее чем приблизительно 500 пМ (5 x 10-10 M). В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 связывается с CD3 с константой диссоциации (KD), составляющей менее чем приблизительно 250 пМ. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 связывается с CD3 с константой диссоциации (KD), составляющей приблизительно 100 пМ. В определенных вариантах осуществления антитело к CD3 связывается с эпитопом CD3, который является консервативным для CD3 от разных видов, например, обеспечивающим перекрестную реактивность для человека и яванского макака.
KD можно измерить с помощью анализов, хорошо известных квалифицированному специалисту, включая без ограничения: интерферометрию биослоев (BLI), поверхностный плазмонный резонанс (SPR), анализы кинетического исключения на основе равновесия в растворе, анализ прямой ассоциации KinExA, анализы с применением инструментов и реагентов FORTEBIO, как, например, Octet RED 384, и инструментов на основе HTX BLI, твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA) или радиоммунологический анализ (RIA). Измерение KD может быть выполнено с использованием интактного антитела к CD3 или его антигенсвязывающего фрагмента, например, scFv, при помощи анализа поверхностного плазмонного резонанса BIACORE®.
Хотя молекулы, связывающие CD3 с высокой аффинностью, были ассоциированы с активацией синдрома высвобождения цитокинов (CRS) или содействием ему, аффинность связывания антитела с CD3 не является единственным определяющим фактором CRS. Например, высокоаффинное антитело к CD3 (с KD в нМ в пределах ~низкого однозарядного числа), используемое в биспецифическом формате, успешно продемонстрировало сильную Т-клеточную цитотоксичность в отношении опухолевых клеток-мишеней с ограниченным высвобождением цитокинов (IFNγ, IL-6, TNFα) (см., например, Mol Cancer Ther. 2016 Sep; 15(9); 2155-65 и стендовый доклад APTEVO AACR о доклинических исследованиях APOV436, представленный 16 апреля 2018 г.). Без привязки к теории, высокоаффинное антитело к CD3 может быть особенно полезным для обеспечения специфического целенаправленного воздействия и минимального риска CRS в мультиспецифических антителах с определенными форматами (например, scFv2-Fc2 или scFv-IgG или другими подобными полимерными форматами) или химерных антигенных рецепторах с различными компонентами, собранными в разном порядке.
Термин «синдром высвобождения цитокинов» (или «CRS») относится к провоспалительной петле положительной обратной связи между цитокинами и иммунными клетками, ведущей к чрезмерному или неконтролируемому высвобождению провоспалительных цитокинов клетками иммунной системы (см., например, Lee et al., Blood, Vol. 124, pages 188-195 (2014) и Tisoncik et al., Microbiol Mol Biol Rev, Vol. 76, pages 16-32 (2012). После стимуляции и активации Т-клетки высвобождают ряд цитокинов до уровня и степени, которые вызывают нежелательные биологические/физиологические эффекты различной степени и тяжести, включая острое воспаление, характеризующееся, например, покраснением (краснотой), припухлостью или отеком, жаром (повышенной температурой), болью (болевыми ощущениями) и нефункциональностью (нарушением функции). При локализации в коже или другой ткани биологические/физиологические эффекты включают усиление кровотока, позволяющее лейкоцитам сосудов и белкам плазмы крови достигать внесосудистых участков повреждения, повышение локальной температуры и возникновение боли, отека тканей и внесосудистого давления, а также снижение перфузии тканей. Другие биологические/физиологические эффекты включают дисфункцию органов и систем, такую как сердечная дисфункция, респираторный дистресс-синдром взрослых, неврологическая токсичность, почечная и/или печеночная недостаточность и диссеминированное внутрисосудистое свертывание. Повышенные уровни IFNγ, IL-6, TNFα, TGF-бета, IL-2, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF), IL-10, IL-8, IL-5 и/или фракталкина являются прогностическим фактором и/или причиной CRS или склонности вызывать CRS при стимуляции Т-клеток.
В определенных вариантах осуществления антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, изменяют и/или модифицируют для снижения вероятности или тяжести CRS, индуцированного антителом. Неограничивающие иллюстративные модификации могут включать молчащие Fc-участки (например, полное удаление Fc или изменение Fc-участка для уменьшения или устранения эффекторной функции) и/или маскирование (например, полипептидная маска, расположенная так, что она снижает или ингибирует способность антитела или его антигенсвязывающего фрагмента специфически связывать CD3).
В данном документе термин «антитело» используется в наиболее широком смысле и охватывает различные структуры антитела, в том числе без ограничения моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и/или фрагменты антитела (предпочтительно те фрагменты, которые проявляют требуемую активность связывания антигена).
Термин «моноклональное антитело» или «mAb» относится к антителу, полученному из группы фактически однородных антител, т.е. индивидуальных антител, составляющих группу антител, которые являются идентичными и/или связывают один и тот же эпитоп, за исключением возможных вариантов антител (например, содержащих встречающиеся в природе мутации или мутации, возникающие в ходе получения препарата моноклональных антител), при этом такие варианты обычно присутствуют в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, содержат разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклональных антител направлено на одну детерминанту на антигене.
Что касается мультиспецифических антител, то такие антитела содержат по меньшей мере два различных антигенсвязывающих домена, которые распознают и специфически связываются с по меньшей мере двумя различными антигенами. Что касается биспецифических антител, то такие антитела содержат два различных антигенсвязывающих домена, которые распознают и специфически связываются с по меньшей мере двумя различными антигенами. «Отличный антиген» может относиться к различным и/или отдельным белкам, полипептидам или молекулам; а также к различным и/или отдельным эпитопам, при этом такие эпитопы могут содержаться в пределах одного белка, полипептида или другой молекулы.
Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте, которая взаимодействует со специфическим антигенсвязывающим сайтом в вариабельном участке молекулы антитела, известном как паратоп. Один антиген может иметь более одного эпитопа. Таким образом, разные антитела могут связываться с разными областями антигена и могут оказывать разные биологические эффекты. Термин «эпитоп» также относится к сайту на антигене, на который реагируют B- и/или T-клетки. Он также относится к участку антигена, который связывается антителом. Эпитопы могут быть определены как структурные или функциональные. Функциональные эпитопы в целом представляют собой подгруппу структурных эпитопов и содержат остатки, которые напрямую вносят вклад в аффинность взаимодействия. Эпитопы также могут быть конформационными, то есть состоять из нелинейно расположенных аминокислот. В определенных вариантах осуществления эпитопы могут включать детерминанты, которые представляют собой химически активные поверхностные группы молекул, таких как аминокислоты, сахарные боковые цепи, фосфорильные группы или сульфонатные группы, и в определенных вариантах осуществления могут обладать специфическими характеристиками трехмерной структуры и/или специфическими характеристиками заряда.
В некоторых случаях антитело содержит четыре полипептидных цепи: две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные дисульфидными связями. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них можно дополнительно разделить на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам иммуноглобулинов, соответственно называются α, δ, ε, γ и μ.
В других случаях антитело может вместо этого содержать его мультимеры (например, IgM) или его антигенсвязывающие фрагменты. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельного участка тяжелой цепи («VH») и константного участка тяжелой цепи («CH»), которая состоит из доменов CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельного участка легкой цепи («VL») и константного участка легкой цепи («CL»). Участки VH и VL можно дополнительно разделить на участки гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность участками (CDR), чередующиеся с более консервативными участками, называемыми каркасными участками (FR). Каждый VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения FR антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) могут быть идентичны последовательностям зародышевой линии человека или могут быть модифицированы естественным или искусственным путем. Аминокислотная консенсусная последовательность может быть определена на основе анализа расположенных рядом друг с другом двух или более CDR. Соответственно, CDR в тяжелой цепи обозначаются как «CDRH1», «CDRH2» и «CDRH3» соответственно, а CDR в легкой цепи обозначаются как «CDRL1», «CDRL2» и «CDRL3».
Если конкретно не указано иное, то используемый в данном документе термин «антитело» охватывает молекулы, содержащие две тяжелые цепи иммуноглобулина и две легкие цепи иммуноглобулина (т.e. «молекулы полного антитела» или «интактные антитела»), а также их антигенсвязывающие фрагменты.
Термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится к части интактного антитела, которая связывает антиген, с которым связывается интактное антитело (в данном случае CD3). Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «цельное антитело» или подобные используются в данном документе взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, которая фактически аналогична структуре нативного антитела.
Антигенсвязывающий фрагмент антитела включает любой встречающийся в природе, получаемый ферментативным путем, синтетический или полученный с помощью методик генной инженерии полипептид или гликопротеин, который специфически связывает антиген с образованием комплекса. Иллюстративные фрагменты антитела включают без ограничения Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv или только домены VH или VL) и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающие фрагменты антител к CD3, описанные в данном документе, представляют собой scFv.
Как и в случае с молекулами полных антител, антигенсвязывающие фрагменты могут быть моноспецифическими или мультиспецифическими (например, биспецифическими). Мультиспецифический антигенсвязывающий фрагмент антитела, как правило, будет содержать по меньшей мере два отличающихся вариабельных домена, где каждый вариабельный домен способен специфически связываться с отдельным антигеном или с отличающимся эпитопом на одном и том же антигене. В контексте описанного в данном документе антигенсвязывающего фрагмента антитела к CD3 можно использовать различные форматы мультиспецифических антител. Неограничивающие примеры мультиспецифических и биспецифических форматов включают, например, Fab-Fc-scFv («открывалка для бутылок») (XENCOR), Mab-scFv (XENCOR), Mab-Fv (XENCOR), Dual scFv (XENCOR), центральный Fv (XENCOR), центральный scFv(XENCOR), одноплечевой центральный scFv (XENCOR), Fab-Fab (XENCOR), Fab-Fv (XENCOR), mAb-Fv (XENCOR), mAb-Fab (XENCOR), DART (MacroGenics), BiTE (Amgen/Micromet), KiTE, IgG с универсальной легкой цепью (Genentech), TandAb (SFFIMED) Cross-Mab (Roche), SEED (EMD Serono), BEAT (Glenmark), TrioMab (Trion Pharma/Fresenius Biotech), DuetMab (MedImmune), и другие, которые раскрыты, например, в WO 95/09917; WO 2008/119566; WO 2008/119567; WO2011/121110; WO 2010/037835; WO 2007/042261; WO 2007/110205; WO 2011/121110; WO 2012/055961; WO 2012/16067; WO 2016/086189; WO 2016/182751; WO 2015/006749; WO 2014/049003; WO 2013/177101; WO 2015/128509; US 7951917; US 2009/0252729; US 2014/0348839; US 7183076; Mazor et al., Mabs, Vol. 7, pages 377-389 (2015); Muda et al., Protein Engineering, Design, & Selection, Vol. 24, pages 447-454 (2011); и Del Bano et al., Antibodies, Vol. 5, pages 1-23 (2016). В некоторых вариантах осуществления фрагменты scFv к CD3, описанные в данном документе, содержат один или более вариабельных доменов мультиспецифического (например, биспецифического) антитела.
В определенных вариантах осуществления антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, содержатся в мультиспецифическом антителе, в частности в биспецифическом антителе, которое обладает специфичностью связывания со вторым антигеном. Такой второй антиген может быть совершенно другой мишенью, в отличие от первой мишени, или другим эпитопом, присутствующим на той же мишени. В некоторых вариантах осуществления специфичность связывания относится к двум различным эпитопам CD3 (например, CD3ε или CD3γ). В других вариантах осуществления одна из специфичностей связывания предусматривает связывание с CD3 (например, CD3ε или CD3γ), а другая предусматривает связывание с другой биологической молекулой (например, антигеном клеточной поверхности, например опухолевым антигеном).
Неограничивающие примеры второго антигена, по отношению к которому активно биспецифическое антитело, содержащее антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, включают мишени, выбранные из группы, состоящей из: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-кето-PGFla, 8-изо-PGF2a, 8-оксо-dG, аденозинового рецептора A1, A33, ACE, ACE-2, активина, активина A, активина AB, активина B, активина C, активина RIA, активина RIA ALK-2, активина RIB ALK-4, активина RIIA, активина RUB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM 15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, адрессинов, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, альфа-1-антитрипсина, антагониста альфа-V/бета-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, артемина, антиидиотипа, ASPARTIC, предсердного натрийуретического фактора, интегрина av/b3, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, стимулятора B-лимфоцитов (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bel, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, остеогенина BMP-3, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, бомбезина, костного нейротрофического фактора, BPDE, BPDE-DNA, BTC, фактора 3 комплемента (C3), C3a, C4, C5, C5a, CIO, CA125, CAD-8, кальцитонина, cAMP, раково-эмбрионального антигена (CEA), ассоциированного с карциномой антигена, катепсина A, катепсина B, катепсина C/DPPI, катепсина D, катепсина E, катепсина H, катепсина L, катепсина O, катепсина S, катепсина V, катепсина X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL 14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (белки p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, токсина Clostridium botulinum, токсина Clostridium perfringens, CKb8-l, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, цитокератинового опухолеассоциированного антигена, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, стимулятора гемолиза, дез(l-3)-IGF-I (IGF-1 головного мозга), Dhh, дигоксина, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, EN A, эндотелинового рецептора, энкефалиназы, eNOS, Eot, эотаксина l, EpCAM, эфрина B2/ EphB4, EPO, ERCC, E-селектина, ET-1, фактора Ila, фактора VII, фактора VIIIc, фактора IX, белка активации фибробластов (FAP), Fas, FcRl, FEN-1, ферритина, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, фибрина, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, фолликулостимулирующего гормона, фракталкина, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (миостатин), GDF-9, GDF- 15 (MIC-1), GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-альфа 1, GFR-альфа 2, GFR-альфа 3, GITR, глюкагона, Glut 4, гликопротеина Ilb/IIIa (GP Ilb/IIIa), GM-CSF, gpl30, gp72, GRO, соматотропин-рилизинг-фактора, гаптена (NP-cap или NIP-cap), HB-EGF, HCC, гликопротеина оболочки gB HCMV, гликопротеина оболочки gH HCMV, HCMV UL, гемопоэтического фактора роста (HGF), Hep B gpl20, гепараназы, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), гликопротеина gB вируса простого герпеса (HSV), гликопротеина gD HSV, HGFA, высокомолекулярного меланома-ассоциированного антигена (HMW-MAA), HIV gpl20, V3-петли gp 120 HIV IIIB, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, сердечного миозина человека, цитомегаловируса человека (HCMV), гормона роста человека (HGH), HVEM, 1-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, рецептора IgA, IgE, IGF, IGF-связывающих белков, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, альфа-интерферона (INF), INF-бета, INF-гамма, ингибина, iNOS, А-цепи инсулина, B-цепи инсулина, инсулиноподобного фактора роста 1, альфа-2-интегрина, альфа-3-интегрина, альфа-4-интегрина, альфа-4/бета-1-интегрина, альфа-4/бета-7-интегрина, альфа-5(альфа-V)-интегрина, альфа-5/бета-1-интегрина, альфа-5/бета-3-интегрина, альфа-6-интегрина, бета-1-интегрина, бета-2-интегрина, гамма-интерферона, IP-10, 1-TAC, JE, калликреина 2, калликреина 5, калликреина 6, калликреина 11, калликреина 12, калликреина 14, калликреина 15, калликреина LI, калликреина L2, калликреина L3, калликреина L4, KC, KDR, фактора роста кератиноцитов (KGF), ламинина 5, LAMP, LAP, LAP (TGF- 1), латентного TGF-1, bpl латентного TGF-1, LBP, LDGF, LECT2, Lefty, антигена Lewis-Y, Lewis-Y-родственного антигена, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, липопротеинов, LIX, LKN, Lptn, L-селектина, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, легочного сурфактанта, лютеинизирующего гормона, рецептора бета-лимфотоксина, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, металлопротеаз, рецептора MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-альфа, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, муцина (Mucl), MUC18, антимюллерова гормона, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-кадгерина, NCA 90, NCAM, NCAM, неприлизина, нейротрофина-3, -4 или -6, нейротурина, фактора роста нейронов (NGF), NGFR, NGF-бета, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, pl50, p95, PADPr, паратиреоидного гормона, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-кадгерина, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, щелочной фосфатазы плаценты (PLAP), PIGF, PLP, PP14, проинсулина, прорелаксина, C-белка, PS, PSA, PSCA, простат-специфического мембранного антигена (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, А-цепи релаксина, B-цепи релаксина, ренина, F респираторного синцитиального вируса (RSV), RSV Fgp, Ret, ревматоидных факторов, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, сывороточного альбумина, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (опухолеассоциированный гликопротеин-72), TARC, TCA-3, T-клеточных рецепторов (например, T-клеточного рецептора альфа/бета), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, PLAP-подобной щелочной фосфатазы семенников, TfR, TGF, TGF-альфа, TGF-бета, полиспецифического TGF-бета, RI TGF-бета (ALK-5), RII TGF-бета, Rllb TGF-бета, RIII TGF-бета, TGF-бета l, TGF-бета 2, TGF-бета 3, TGF-бета 4, TGF-бета 5, тромбина, Ck-1 тимуса, тиреотропного гормона, Tie, TIMP, TIQ, тканевого фактора, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-альфа, TNF-альфа/бета, TNF-бета 2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL Rl Apo-2, DR4), TNFRSFIOB (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcRl, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSFllB (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF 18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSFIA (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSFIB (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF 5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL Rl TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (лиганд TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (лиганд TRANCE/RANK ODF, лиганд OPG), TNFSF12 (лиганд TWEAK Apo-3, лиганд DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (лиганд LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TLIA/VEGI), TNFSF18 (лиганд GITR, лиганд AITR, TL6), TNFSFIA (конектин TNF-a, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (лиганд OX40 gp34, TXGP1), TNFSF5 (лиганд CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (Fas-лиганд, лиганд Apo-1, лиганд APT1), TNFSF7 (лиганд CD27 CD70), TNFSF8 (лиганд CD30 CD153), TNFSF9 (лиганд 4-1BB, лиганд CD137), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, рецептора трансферрина, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, опухолеассоциированного антигена CA 125, опухолеассоциированного антигена, характеризующегося экспрессией углеводного антигена, родственного Lewis Y, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, урокиназы, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-кадгерина, VE-кадгерина-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VFM, вирусных антигенов, VLA, VLA-1, VLA-4, интегрина VNR, фактора фон Виллебранда, WIF- 1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, CTLA4 (антиген 4 цитотоксического Т-лимфоцита), PD1 (белок запрограммированной гибели клеток 1), PD-L1 (лиганд 1 белка запрограммированной гибели клеток), LAG-3 (ген активации лимфоцитов 3), TIM-3 (белок 3, содержащий домены T-клеточного иммуноглобулина и муцина), рецепторов гормонов и факторов роста.
Мультиспецифические средства, содержащие антитела и антигенсвязывающие фрагменты к CD3, раскрытые в данном документе, могут быть получены с помощью различных методик, включая без ограничения рекомбинантную совместную экспрессию двух пар тяжелая цепь - легкая цепь иммуноглобулина с разной специфичностью (см. Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829 и Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), конструирование типа «выступ-во-впадину» (см., например, патент США № 5731168); технологию кроссовера иммуноглобулинов (также известного как обмен Fab-доменов или формат CrossMab) (см., например, WO 2009/080253; Schaefer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108:11187-11192 (2011)); конструирование Fc-гетеродимерных молекул антител с использованием эффекта электростатического взаимодействия (WO 2009/089004 A1); перекрестное связывание двух или более антител или фрагментов (см., например, патент США № 4676980 и Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); лейциновые застежки (см., например, Kostelny et al., J. Immunol, 148(5):1547-1553 (1992)); технологию «диатела» (см., например, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); димеры одноцепочечных Fv (sFv) (см., например, Gruber et al., J. ImmunoL, 152:5368 (1994)) и триспецифические антитела, описанные, например, в Tutt et al. J. ImmunoL 147: 60 (1991).
Настоящее изобретение также предусматривает модификацию антител к CD3, раскрытых в данном документе, при этом такие модификации предусматривают одну или более аминокислотных замен, вставок и/или делеций в участках FR и/или CDR вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей. После получения такие производные антитела и/или антигенсвязывающие фрагменты можно протестировать в отношении одного или более требуемых свойств, таких как улучшенная специфичность связывания, повышенная аффинность связывания, улучшенная разрабатываемость и т.д.
В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты содержат последовательность тяжелой цепи (HC), последовательность легкой цепи (LC), последовательность CDRH3, последовательность CDRH2, последовательность CHRH1, последовательность CDRL3, последовательность CDRL2, последовательность CDRL1 и/или каркасную последовательность. В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты характеризуются идентичностью аминокислотной последовательности с соответствующими последовательностями антител к CD3, раскрытых в таблице 4 (Ab1-Ab50), составляющей по меньшей мере приблизительно 100%, по меньшей мере приблизительно 99%, по меньшей мере приблизительно 98%, по меньшей мере приблизительно 97%, по меньшей мере приблизительно 96%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 94%, по меньшей мере приблизительно 93%, по меньшей мере приблизительно 92%, по меньшей мере приблизительно 91%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 89%, по меньшей мере приблизительно 88%, по меньшей мере приблизительно 87%, по меньшей мере приблизительно 86%, по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 84%, по меньшей мере приблизительно 83%, по меньшей мере приблизительно 82%, по меньшей мере приблизительно 80% и/или все промежуточные значения процента идентичности. В некоторых вариантах осуществления процент идентичности измеряют с помощью любого хорошо известного алгоритма идентичности последовательностей, такого как FASTA, BLAST или GAP.
В некоторых вариантах осуществления положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами. «Консервативная аминокислотная замена» представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток заменен на другой аминокислотный остаток с боковой цепью (R-группой) с аналогичными химическими свойствами (например, зарядом или гидрофобностью). В целом консервативная аминокислотная замена фактически не будет изменять функциональные свойства белка. В тех случаях, когда две или более аминокислотных последовательностей отличаются друг от друга консервативными заменами, процент или степень сходства можно скорректировать в сторону увеличения, с учетом консервативной природы замены. Средства для осуществления данной корректировки хорошо известны специалистам в данной области. (См., например, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331). Примеры групп аминокислот, которые имеют боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают 1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; 2) алифатические гидроксильные боковые цепи: серин и треонин; 3) амидсодержащие боковые цепи: аспарагин и глутамин; 4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; 5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; 6) кислотные боковые цепи: аспартат и глутамат и 7) серосодержащие боковые цепи: цистеин и метионин. В некоторых вариантах осуществления группы консервативных аминокислотных замен представляют собой: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин-глутамин. В качестве альтернативы в некоторых вариантах осуществления консервативная замена включает в себя любое изменение, характеризующееся положительным значением в матрице логарифмического правдоподобия PAM250, раскрытой в Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45. В некоторых вариантах осуществления «умеренно консервативное» замещение предусматривает любое изменение, характеризующееся неотрицательным значением в матрице логарифмического правдоподобия PAM250.
Также возможна замена одного или более остатков в CDR или удаление одного или более CDR. В научной литературе описаны антитела, в которых можно перенести один или два CDR для изменения связывания. Padlan et al. (1995 FASEB J. 9:133-139) проанализировали контактные участки между антителами и их антигенами, исходя из опубликованных кристаллических структур, и сделали вывод о том, что только от приблизительно одной пятой до одной трети остатков в CDR действительно контактируют со своим ассоциированным антигеном. Padlan также обнаружил множество антител, у которых один или два CDR не содержали аминокислот, вступающих в контакт с антигеном (см. также Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320:415-428). Остатки CDR, не вступающие в контакт с антигеном, могут быть идентифицированы на основании предыдущих исследований (например, остатки H60 - H65 в CDRH2 зачастую не являются необходимыми), на основе участков CDR по Kabat, лежащих за пределами CDR по Chothia, с помощью молекулярного моделирования и/или эмпирическим путем. Если исключен CDR или его остаток(остатки), то он обычно заменен аминокислотой, занимающей соответствующее положение в другой последовательности человеческого антитела, или консенсусной последовательностью для таких последовательностей. Положения для замены в пределах CDR и аминокислоты для замены также могут быть выбраны эмпирическим путем.
В определенных вариантах осуществления замены, вставки или делеции могут встречаться в пределах одного или более CDR антител к CD3, описанных в данном документе, при условии, что такие изменения практически не снижают способность антитела к связыванию его антигена. Например, в CDR можно выполнять консервативные изменения (например, консервативный замены, представленные в данном документе), которые практически не снижают аффинность связывания. Такие изменения, например, могут находиться в CDR за пределами остатков, контактирующих с антигеном. В определенных вариантах осуществления вариантов последовательностей VH и VL, представленных выше, каждый CDR является неизмененным или содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.
Применимый способ идентификации остатков или участков антитела, на которые может быть нацелен мутагенез, называется «аланин-сканирующий мутагенез», как описано в Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. В данном способе идентифицируют остаток или группу целевых остатков (например, заряженных остатков, таких как arg, asp, his, lys и glu) и замещают нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланин или полиаланин), чтобы определить, воздействует ли это на взаимодействие антитела с антигеном. В положения аминокислот, демонстрирующие функциональную чувствительность к исходным заменам, могут быть введены дополнительные замены. В качестве альтернативы или дополнения для идентификации точек контакта между антителом и антигеном определяют кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело. Такие контактные остатки и соседние остатки могут выступать в качестве кандидатов для замены, на которые оказывают целенаправленное воздействие или которые устраняют. Варианты могут быть подвергнуты скринингу для определения того, обладают ли они требуемыми свойствами.
Вставки в аминокислотной последовательности включают амино- и/или карбокси-концевые слияния, варьирующиеся по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сотню или более остатков, а также вставки одного или более аминокислотных остатков внутри последовательности. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым метиониловым остатком. Другие варианты вставок в молекулу антитела включают слияние N- или C-конца антитела с ферментом (например, в случае ADEPT) или полипептидом, который увеличивает время полужизни антитела в сыворотке крови.
Как описано по всему тексту данного документа, антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, представленные в данном документе, характеризуются благоприятной разрабатываемостью и, таким образом, считаются относительно разрабатываемыми.
Термин «пригодный к разработке» относится к степени, в которой один или более полипептидов из совокупности полипептидов обладает требуемыми характеристиками, такими как, например, требуемая экспрессия, например в клетках млекопитающих; растворимость; вязкость; агрегация; химическая и/или физическая стабильность; требуемый «срок хранения»; температура плавления; фармакокинетические профили; время полужизни в кровотоке и характеристики выведения. Такие характеристики могут выступать в качестве независимых признаков, в качестве комбинаций подмножеств таких признаков или все вместе для определения вероятности того, что такой один или более полипептидов могут подвергаться успешной разработке в качестве терапевтического кандидата и, в конечном итоге, одобренного лекарственного средства. Соответственно, из уровня техники в целом понятно, что полипептиды с требуемыми характеристиками разрабатываемости обладают, например, относительно высокой растворимостью, относительно низкой вязкостью, относительно низкой предрасположенностью к агрегации, относительно высокой химической стабильностью, относительно высокой физической стабильностью, относительно продолжительным «сроком хранения», относительно высокой температурой плавления, относительно длительным периодом полужизни в кровотоке, относительно длительным временем выведения и т.п. Полипептиды с нежелательными характеристиками разрабатываемости обладают, например, относительно низкой растворимостью, относительно высокой вязкостью, относительно высокой предрасположенностью к агрегации, относительно неудовлетворительной химической стабильностью, относительно неудовлетворительной физической стабильностью, относительно коротким «сроком хранения», относительно низкой температурой плавления, относительно коротким периодом полужизни в кровотоке, относительно коротким временем выведения и т.п.
Способы и анализы, которые можно использовать для определения степени, в которой полипептиды, такие как антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, обладают требуемыми свойствами разрабатываемости, доступны в уровне техники и включают, например, анализы на основе ПЦР (WO 2014/179363 и Xu et al., Protein Eng Des Sol, Vol. 26, pages 663-670 (2013)); анализы с SMP и SCP и т.п.; хроматографию перекрестного взаимодействия (CIC); хроматографию самовзаимодействия (SIC); динамическое светорассеяние; эксклюзионную хроматографию (SEC), спектроскопию с динамическим светорассеянием (DLS); фотонно-корреляционную спектроскопию; квазиупругое светорассеяние, круговой дихроизм (CD), измерения вязкости; связывание цельных клеток; методики с применением микропанелей тканей; анализы на основе ELISA с BVP; анализы AC-SINS (Liu et al; MAbs, Vol. 6, pages 483-492 (2014); дифференциальную сканирующую калориметрию и т.п. (см., например, He et al., J. Pharm. Sci., Vol. 100(4), pp. 1330-1340 (2011); Wagner et al., Pharm. Develop. & Technol (опубликовано в сети Интернет в 2012 г.; протокол передачи гипертекста: informahealthcare.com/doi/abs/10.3109/10837450.2011.649851); Hotzel et al., mAbs, Vol. 4(6), pages 753-7601 (2012); Weiqiang et al., J. Pharm. Sci., Vol. 101(5), pp. 1701-1720 (2012); Banks et al., J. Pharm. Sci., Vol. 101(8), pp. 2720-2732 (2012); Lie et al., J. Pharm. Sci., Vol. 94(9), pp. 1928-1948 (2005) и Payne et al., Biopolymers, Vol. 85(5), pp. 527-533 (2006)).
В некоторых вариантах осуществления антитела, которые идентифицированы как характеризующиеся сниженной разрабатываемостью, считаются такими благодаря их взаимодействию с реагентом полиспецифичности («PSR») и, собственно, называются «полиспецифическими» полипептидами. Такие полиспецифические антитела могут называться относительно «не подлежащими разработке» или считаться антителами с относительно «не возможной разработкой».
«Профиль разрабатываемости» относится к индексу, который может быть присвоен антителам при оценке их разрабатываемости. Профиль разрабатываемости является оценкой или мерой, посредством которой можно оценить, сравнить и/или ранжировать разрабатываемость антител к CD3. Такие профили разрабатываемости служат в качестве оценки степени взаимодействия молекул, связывающих CD3, и содержащих их антител. Степень взаимодействия можно оценить с помощью любого из ряда средств, доступных в уровне техники, которые обеспечивают выходное значение, коррелирующее с силой или аффинностью полипептида в отношении фрагмента, с которым он связывается. Иллюстративные средства включают средства на основе проточной цитометрии, такие как FACS; ELISA; количественные анализы иммунной аффинности или анализы иммунопреципитации; двугибридные анализы с клетками млекопитающих или двугибридные анализы с дрожжевыми клетками и т.п. В контексте FACS, как продемонстрировано в разделе «Примеры», степень взаимодействия между полипептидами из совокупности и PSR можно определять путем получения средней интенсивности флуоресценции (MFI) для каждого выявляемого взаимодействия полипептид-PSR и последующего расположения MFI либо в возрастающем, либо в убывающем порядке, ранжируя тем самым полипептиды из совокупности в соответствии с относительной степенью взаимодействия между каждым выявленным полипептидом и PSR. Такое ранжирование обеспечивает ранжирование полипептидов из совокупности таким образом, что легко определить полипептиды, которые характеризуются улучшенной разрабатываемостью, а также полипептиды, которые характеризуются сниженной разрабатываемостью.
Профиль разрабатываемости также может принимать форму нормализованной оценки, например, путем нормализации разрабатываемости антител к CD3, описанных в данном документе, до разрабатываемости стандартного (или контрольного) антитела, например, антитела к HEL.
В определенных вариантах осуществления домены, связывающие CD3, и содержащие их антитела по настоящему изобретению могут быть дополнительно модифицированы так, чтобы они содержали дополнительные небелковые фрагменты, которые известны из уровня техники и являются легкодоступными. Фрагменты, подходящие для дериватизации антитела, включают без ограничения водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают без ограничения полиэтиленгликоль (PEG), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (или гомополимеры, или статистические сополимеры), а также декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры полипропиленгликоля, сополимеры полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Полиэтиленгликоль-пропиональдегид может иметь преимущества в производстве, которые обусловлены его стабильностью в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Число полимеров, присоединенных к антителу, может варьировать, и в случае присоединения более одного полимера они могут представлять собой одинаковые или разные молекулы. Обычно число и/или тип полимеров, применяемых для дериватизации, можно определять, исходя из факторов, включающих без ограничения конкретные свойства или функции антитела, подлежащие усилению, будет ли производное антитела применяться в терапии при определенных условиях и т.д.
В определенных вариантах осуществления представлены домены, связывающие CD3, и содержащие их антитела по настоящему изобретению, которые демонстрируют улучшенный профиль разрабатываемости. Профиль разрабатываемости антител к CD3 получают, выполняя один или более из анализа с PSR; анализа с SCP; AC-SINS; ELISA; анализа DSF; анализа Tm; анализа HIC; анализа CIC или их комбинации.
В других вариантах осуществления антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, демонстрируют показатель для реагента полиспецифичности (PSR), составляющий от приблизительно 0,0 до приблизительно 0,45; от приблизительно 0,0 до приблизительно 0,4; от приблизительно 0,0 до приблизительно 0,35; от приблизительно 0,0 до приблизительно 0,3; от приблизительно 0,0 до приблизительно 0,25; от приблизительно 0,0 до приблизительно 0,2; от приблизительно 0,0 до приблизительно 0,15; или от приблизительно 0,0 до приблизительно 0,1. Показатель 0,0-0,1 означает «чистый PSR». Показатель от 0,1 до 0,33 означает «низкий PSR». Показатель от 0,33 до 0,66 означает «средний PSR». Показатель 0,66-1,00 означает «высокий PSR». Высокий показатель PSR свидетельствует о пониженной (или неудовлетворительной) разрабатываемости. Как правило, чем ниже показатель PSR, тем благоприятнее профиль разрабатываемости антитела.
В других вариантах осуществления антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, демонстрируют показатель HIC, составляющий менее чем приблизительно 10,5 минуты (показатель HIC от чистого до низкого); от приблизительно 10,5 минуты до 11,5 минуты (средний показатель HIC) или более чем приблизительно 11,5 минуты (высокий показатель HIC). Как правило, чем ниже показатель HIC, тем благоприятнее профиль разрабатываемости антитела.
В еще других вариантах осуществления антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, демонстрируют показатель SEC, составляющий менее чем приблизительно 95%, что указывает на то, что антитело является мономером, то есть не агрегируется.
В еще других вариантах осуществления антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, демонстрируют Tm, составляющую менее чем приблизительно 65°C.
В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, могут быть дополнительно модифицированы для сведения к минимуму эффекторной функции, например молчащий Fc.
«Эффекторная функция» относится к тем видам биологической активности, которые связаны с Fc-участком антитела, который изменяется в зависимости от изотипа антитела. К иллюстративным эффекторным функциям относятся: связывание C1q и комплемент-зависимая цитотоксичность (CDC); связывание с Fc-рецептором; антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; подавление рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора В-клеток) и активация В-клеток.
«Fc-участок» представляет собой C-концевой участок тяжелой цепи иммуноглобулина, который содержит по меньшей мере часть константного участка, включая Fc-участки с нативной последовательностью и вариантные Fc-участки. Fc-участок тяжелой цепи IgG человека может распространяться от Cys226 или от Pro230 до карбокси-конца тяжелой цепи. Однако C-концевой лизин (Lys447) Fc-участка может присутствовать или может отсутствовать. Если в данном документе не указано иное, то нумерация аминокислотных остатков в Fc-участке или константном участке соответствует системе нумерации EU, также называемой индексом EU, как описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991.
В определенных вариантах осуществления в Fc-участок антитела к CD3 по настоящему изобретению может быть введена одна или более аминокислотных модификаций с получением тем самым варианта Fc-участка (см., например, US 2012/0251531). Вариант Fc-участка может содержать последовательность Fc-участка человека (например, Fc-участок IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека), содержащую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или более аминокислотных положений.
В определенных вариантах осуществления в настоящем изобретении предусмотрен вариант антитела к CD3, обладающий некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его подходящим кандидатом для вариантов применения, в которых важен период полужизни антитела in vivo, в то время как некоторые эффекторные функции (такие как система комплемента и ADCC) являются необязательными или вредными. Для подтверждения снижения/устранения активности CDC и/или ADCC можно проводить in vitro и/или in vivo анализы цитотоксичности. Например, можно проводить анализы связывания с Fc-рецептором (FcR), чтобы убедиться в том, что антитело не проявляет связывания с FcγR (следовательно, вероятно, у него отсутствует активность ADCC), но сохраняет способность к связыванию с FcRn. Первичные клетки, опосредующие ADCC (например, NK-клетки), экспрессируют только FcγRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Экспрессия FcR на гемопоэтических клетках обобщена в таблице 3 на странице 464 в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Неограничивающие примеры in vitro анализов для оценки активности ADCC у представляющей интерес молекулы описаны в патенте США № 5500362 (см., например Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) и Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); патент США № 5821337 (см. Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). В качестве альтернативы можно использовать способы анализов без применения радиоактивных веществ (см., например, ACTI™ нерадиоактивный анализ цитотоксичности с применением проточной цитометрии (Cell Technology, Inc., Маунтин-Вью, штат Калифорния, США) и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96® (Promega, Медисон, штат Висконсин, США)). Применимые эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) и клетки природные киллеры (NK). В качестве альтернативы или дополнения активность ADCC у представляющей интерес молекулы можно оценивать in vivo, например, на животной модели, такой, которая раскрыта в Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Также можно проводить анализы связывания с C1q, чтобы подтвердить, что антитело не способно к связыванию с C1q, и, следовательно, у него отсутствует активность CDC. См., например, ELISA для связывания C1q и C3c в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации системы комплемента можно осуществлять анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro et al. J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M. S. et al. Blood. 101:1045-1052 (2003); и Cragg, M. S. and M. J. Glennie Blood. 103:2738-2743 (2004)). Связывание с FcRn и определение in vivo выведения/периода полужизни также можно осуществлять с применением способов, известных из уровня техники (см., например, Petkova, S. B. et al. Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)).
В некоторых вариантах осуществления антитела со сниженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или более остатков 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 Fc-участка (патенты США №№ 6737056 и 8219149). В некоторых вариантах осуществления такие Fc-мутанты включают Fc-мутантов с заменами в двух или более аминокислотных положениях 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемого Fc-мутанта «DANA» с заменой остатков 265 и 297 на аланин (патенты США №№ 7332581 и 8219149).
В других вариантах осуществления антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, дополнительно модифицированы для включения маскирующего средства, например полипептидной маски, присоединенной посредством расщепляемого линкера.
В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, конъюгированы с терапевтическим фрагментом, с получением таким образом иммуноконъюгата. «Иммуноконъюгат» представляет собой антитело, конъюгированное с одной или более гетерологичными молекулами, такими как, например, антибиотик, второе антитело к CD3, вакцина или токсоид или любой другой терапевтический фрагмент.
В определенных вариантах осуществления антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, изменяют для повышения или уменьшения степени, в которой антитело является гликозилированным. Добавление или удаление сайтов гликозилирования в антитело к CD3 по настоящему изобретению можно легко осуществлять путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, чтобы создавать или удалять один или более сайтов гликозилирования.
Более того, настоящее изобретение в целом относится к антителу или фрагменту антитела к CD3, где указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат: a. полипептид вариабельного участка тяжелой цепи (VH), содержащий: i. CDR1 VH (CDRH1) с FNIKDYYMH (SEQ ID NO: 13); ii. CDR2 VH (CDRH2) с WIDLENANTVYDAKFQG (SEQ ID NO: 15); iii. CDR3 VH (CDRH3) с ARDAYGRYFYDV (SEQ ID NO: 103); и/или b. полипептид вариабельного участка легкой цепи (VL), содержащий: i. CDR1 VL (CDRL1) с KSSQSLLNARTGKNYLA (SEQ ID NO: 8); CDR2 VL (CDRL2) с WASTRX1S (SEQ ID NO: 133) и CDR3 VL (CDRL3) с X2QSYFRRT (SEQ ID NO: 134); где каждый из X1 и X2 независимо представляет собой любую аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления X1 представляет собой E или S. В некоторых вариантах осуществления X2 представляет собой K или V. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела содержат CDRL2 с SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела содержат CDRL3 с SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 4.
В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела содержат CDR1 цепи VH (CDRH1) с FNIKDYYMH (SEQ ID NO: 13), CDR2 цепи VH (CDRH2) с WIDLENANTVYDAKFQG (SEQ ID NO: 15) и CDR3 цепи VH (CDRH3) с ARDAYGRYFYDV (SEQ ID NO: 103) и/или CDR1 цепи VL (CDRL1) с KSSQSLLNARTGKNYLA (SEQ ID NO: 8), CDR2 цепи VL (CDRL2) с WASTRES (SEQ ID NO: 10) и CDR3 цепи VL (CDRL3) с KQSYFRRT (SEQ ID NO: 5). В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела содержат CDR1 цепи VH (CDRH1) с FNIKDYYMH (SEQ ID NO: 13), CDR2 цепи VH (CDRH2) с WIDLENANTVYDAKFQG (SEQ ID NO: 15) и CDR3 цепи VH (CDRH3) с ARDAYGRYFYDV (SEQ ID NO: 103) и/или CDR1 цепи VL (CDRL1) с KSSQSLLNARTGKNYLA (SEQ ID NO: 8), CDR2 цепи VL (CDRL2) с WASTRSS (SEQ ID NO: 11) и CDR3 цепи VL (CDRL3) с VQSYFRRT (SEQ ID NO: 4). В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 может содержать любой один или более CDR антитела, называемого Ab1, и/или любой один или более CDR антитела, называемого Ab13. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3 может связываться с таким же или практически аналогичным эпитопом или эпитопами CD3, как Ab1 и/или Ab13.
В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VL, содержащий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VL, содержащий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VL, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VH, содержащий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VH, содержащий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат цепь VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17.
В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VL, содержащий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 34; и полипептид цепи VH, содержащий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 90% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VL, содержащий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 34; и полипептид цепи VH, содержащий аминокислотную последовательность, которая обладает по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VL, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 34; и цепь VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VL, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 18; и цепь VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат полипептид цепи VL, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34; и цепь VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17.
В некоторых вариантах осуществления указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 связываются с CD3 с константой диссоциации (KD), составляющей приблизительно 500 пМ или меньше, приблизительно 470 пМ или меньше, приблизительно 450 пМ или меньше, приблизительно 400 пМ или меньше, приблизительно 350 пМ или меньше, приблизительно 300 пМ или меньше, приблизительно 250 пМ или меньше, приблизительно 200 пМ или меньше, приблизительно 150 пМ или меньше или приблизительно 100 пМ или меньше, где необязательно указанный CD3 является человеческим и/или яванского макака, где еще более необязательно указанная аффинность связывания измерена при помощи поверхностного плазмонного резонанса. В некоторых вариантах осуществления указанная KD представляет собой моновалентную KD, и/или указанная KD измерена с использованием scFv-фрагмента указанных антитела или фрагмента антитела к CD3.
Более того, настоящее изобретение в целом относится к антителу или фрагменту антитела к кластеру дифференцировки три («CD3»), где указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат один или более CDR любого одного или более из Ab1-Ab50 и/или связывается с тем же самым эпитопом(эпитопами), что и любое одно или более из Ab1-Ab50. Кроме того, настоящее изобретение в целом относится к антителу или фрагменту антитела к кластеру дифференцировки три («CD3»), где указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела к CD3 содержат одну или более цепей VH и/или VL, содержащих аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей в таблице 4.
Получение антител к CD3 и их антигенсвязывающих фрагментов
Антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с применением рекомбинантных методик. Например, представлены выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело к CD3, описанное в данном документе. Такие нуклеиновые кислоты могут кодировать аминокислотную последовательность, предусматривающую VL, и/или аминокислотную последовательность, предусматривающую VH антитела (например, легкую и/или тяжелую цепи антитела). В дополнительном варианте осуществления представлены один или более векторов (например, векторы экспрессии), содержащих такие нуклеиновые кислоты. В дополнительном варианте осуществления представлена клетка-хозяин, содержащая такие нуклеиновые кислоты. В одном таком варианте осуществления клетка-хозяин содержит (например, была трансформирована с помощью): (1) вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует аминокислотную последовательность, предусматривающую VL антитела, и аминокислотную последовательность, предусматривающую VH антитела, или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, предусматривающую VL антитела, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, предусматривающую VH антитела. В одном варианте осуществления клетка-хозяин является эукариотической, например, клеткой яичников китайского хомячка (CHO) или лимфоидной клеткой (например, клеткой Y0, NS0, Sp20). В одном варианте осуществления представлен способ получения антитела к CD3, где способ предусматривает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую представленное выше антитело, при условиях, подходящих для экспрессии антитела, и необязательно извлечение антитела из клетки-хозяина (или культуральной среды клетки-хозяина).
Термин «клетка-хозяин» относится к клеткам, в которые была введена последовательность экзогенной нуклеиновой кислоты, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева предусматривают трансформантов и трансформированные клетки, которые включают первичную трансформированную клетку и полученное от нее потомство без учета количества пассажей.
В случае рекомбинантного получения антитела к CD3 нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело, например, описанное выше, выделяют и вставляют в один или более векторов для дальнейшего клонирования в клетку-хозяина и/или экспрессии в ней. Такие нуклеиновые кислоты можно легко выделять и секвенировать с применением традиционных процедур (например, с применением олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела).
Подходящие клетки-хозяева для клонирования и/или экспрессии векторов, кодирующих антитело, включают прокариотические или эукариотические клетки. Например, антитела могут быть получены в бактериях, в частности, если не требуется гликозилирование и эффекторная функция Fc. Касательно экспрессии фрагментов антитела и полипептидов в бактериях см., например, патенты США №№ 5648237, 5789199 и 5840523. (См. также Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp. 245-254, где описана экспрессия фрагментов антитела в E. coli). После экспрессии антитело может быть выделено из массы бактериальных клеток в виде растворимой фракции и может быть подвергнуто дополнительной очистке. Помимо прокариот, подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, являются эукариотические микроорганизмы, такие как мицелиальные грибы или дрожжи, включая грибы и штаммы дрожжей, пути гликозилирования которых были подвергнуты «гуманизации», что приводит к продуцированию антител с частично или полностью человеческим паттерном гликозилирования. См., например, Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) и Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006); WO 2009/036379; WO 2010/105256 и WO 2012/009568. В качестве хозяев также можно использовать культуры клеток растений. См., например, патенты США № 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описывающие технологию PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных растениях). В качестве хозяев также можно использовать клетки позвоночных организмов. Например, можно применять линии клеток млекопитающих, которые адаптированы для роста в суспензии. Другими примерами применимых линий клеток-хозяев, представляющих собой клетки млекопитающих, являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированная с помощью SV40 (COS-7); линия почки эмбриона человека (293 или клетки 293, описанные, например, в Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); клетки почки новорожденного хомяка (BHK); клетки Сертоли мыши (клетки TM4, описанные, например, в Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK; клетки печени крысы линии buffalo (BRL 3A); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); опухоль молочной железы мыши (MMT 060562); клетки TRI, описанные, например, в Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); клетки MRC 5 и клетки FS4. Другие полезные линии клеток-хозяев, представляющих собой клетки млекопитающих, включают клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая клетки DHFR-CHO (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); и линии клеток миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Для обзора некоторых линий клеток-хозяев, представляющих собой клетки млекопитающих, подходящих для получения антител, см., например, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), pp. 255-268 (2003).
Антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты можно идентифицировать, подвергнуть скринингу, отобрать или охарактеризовать по их физическим/химическим свойствам и/или биологическим активностям с помощью различных анализов, известных в уровне техники, например ELISA, вестерн-блоттинг и т.д., или можно применять анализы конкурентного связывания для идентификации антитела, которое конкурирует с антителом к CD3 по настоящему изобретению за связывание с CD3. В иллюстративном анализе конкурентного связывания иммобилизованный CD3 инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с CD3, и второе немеченое антитело, которое подлежит тестированию в отношении его способности конкурировать с первым антителом за связывание с CD3. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный CD3 инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не содержащем второе немеченое антитело. После инкубации при условиях, которые допускают связывание первого антитела с CD3, избыток несвязавшегося антитела удаляют и измеряют количество метки, ассоциированной с иммобилизованным CD3. Если количество метки, ассоциированной с иммобилизированным CD3, в значительной степени снижено в тестовом образце по сравнению с контрольным образцом, тогда это указывает на то, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с CD3. См., например, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).
Антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, характеризующиеся биологической активностью, можно идентифицировать с использованием стандартных подходов. Биологическая активность может предусматривать, например, связывание с CD3 на поверхности T-клетки, или in vivo, или in vitro, или ex vivo. В случае мультиспецифического антитела к CD3 (такого как биспецифическое антитело с одним плечом, которое связывается с CD3, и другим плечом, которое связывается с другой мишенью, например антигеном клеточной поверхности, например опухолевым антигеном) биологическая активность также может включать активацию эффекторных клеток (такую как активация CD8+ и/или CD4+ T-клеток), рост популяции эффекторных клеток (т.е. увеличение количества T-клеток), снижение популяции целевых клеток (т.е. уменьшение популяции клеток, экспрессирующих вторую биологическую молекулу на своей клеточной поверхности) и/или уничтожение целевых клеток.
Диагностическое и терапевтическое применения антител к CD3 и их антигенсвязывающих фрагментов
Описанные в данном документе антитела и/или антигенсвязывающие фрагменты к CD3 можно применять для диагностики и/или выявления. Используемый в данном документе термин «выявление» охватывает количественное или качественное выявление. В одном варианте осуществления предусмотрен способ выявления присутствия CD3 в биологическом образце. Такой способ включает (i) приведение биологического образца в контакт с антителом к CD3, описанным в данном документе, при условиях, которые допускают связывание антитела к CD3 с CD3, и (ii) выявление, образуется ли комплекс между антителом к CD3 и CD3. Такой способ может представлять собой способ in vitro или in vivo. В определенных вариантах осуществления биологический образец содержит клетку или ткань(ткани).
В определенных вариантах осуществления представлены меченые антитела к CD3. Антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, включают метку или фрагмент, которые выявляются непосредственно (например, флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки) или косвенно (например, ферменты или лиганды). Неограничивающие иллюстративные метки включают радиоизотопы, такие как 32P, 14C, 125I, 3H и 131I; флуорофоры, такие как хелаты редкоземельных элементов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люцериферазы, например люцифераза светляка и бактериальная люцифераза (патент США № 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидаза хрена (HRP), щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, сахаридоксидазы, например глюкозооксидаза, галактозооксидаза и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа; гетероциклические оксидазы, такие как уриказа и ксантиноксидаза, сопряженные с ферментом, который использует пероксид водорода для окисления красителя-предшественника, таким как HRP, лактопероксидаза или микропероксидаза; биотин/авидин; спиновые метки; метки на основе бактериофагов; стабильные свободные радикалы и тому подобное.
Антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, а также фармацевтические композиции таких антител могут использоваться в терапевтических способах. В одном варианте осуществления антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, или фармацевтические композиции, содержащие такие антитела, можно использовать для лечения или замедления прогрессирования клеточного пролиферативного нарушения или аутоиммунного нарушения.
«Нарушение» относится к любому состоянию или заболеванию, лечение которых будет приводить к положительному результату, включая без ограничения хронические и острые нарушения или заболевания, в том числе такие патологические состояния, которые провоцируют рассматриваемое нарушение у млекопитающего.
Термины «клеточное пролиферативное нарушение» и «пролиферативное нарушение» относятся к нарушениям, которые ассоциированы с нарушенной до определенной степени пролиферацией клеток. Клеточные пролиферативные нарушения включают рак, например опухоль.
Используемый в данном документе термин «опухоль» относится к росту и пролиферации всех неопластических клеток, независимо от того, являются они злокачественными или доброкачественными, и ко всем предраковым и раковым клеткам и тканям.
«Рак» относится к физиологическому состоянию у млекопитающих, характеризующемуся нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака включают без ограничения карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз или злокачественные новообразования лимфоидной ткани; при этом более конкретные примеры включают плоскоклеточный рак (например, эпителиальный плоскоклеточный рак), рак легкого, включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, желудочный рак или рак желудка, включая гастроинтестинальный рак и гастроинтестинальный стромальный рак, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак мочевыводящих путей, гепатому, рак молочной железы, рак толстого кишечника, рак прямой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки или почечный рак, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени, карциному анального канала, карциному полового члена, меланому, поверхностно распространяющуюся меланому, меланому типа злокачественного лентиго, виды акральной лентигинозной меланомы, виды узловатой меланомы, множественную миелому и B-клеточную лимфому (включая низкой степени злокачественности/фолликулярную неходжкинскую лимфому (NHL); мелкоклеточную лимфоцитарную (SL) NHL; промежуточной степени злокачественности/фолликулярную NHL; диффузную NHL промежуточной степени злокачественности; иммунобластную NHL высокой степени злокачественности; лимфобластную NHL высокой степени злокачественности; мелкоклеточную NHL с нерассеченными ядрами высокой степени злокачественности; генерализованную NHL; лимфому из клеток мантийной зоны; лимфому, ассоциированную со СПИДом; и макроглобулинемию Вальденстрема); хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL); острый лимфобластный лейкоз (ALL); волосатоклеточный лейкоз; хронический миелобластный лейкоз и посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение (PTLD), а также аномальную сосудистую пролиферацию, ассоциированную с факоматозами, отек (такой как ассоциированный с опухолями головного мозга), синдром Мейгса, рак головного мозга, а также рак головы и шеи и ассоциированные с ними метастазы. В определенных вариантах осуществления виды рака, которые поддаются лечению антителами по настоящему изобретению, включают рак молочной железы, колоректальный рак, рак прямой кишки, немелкоклеточный рак легкого, глиобластому, неходжкинскую лимфому (NHL), почечно-клеточный рак, рак предстательной железы, рак печени, рак поджелудочной железы, саркому мягких тканей, саркому Капоши, карциноидную карциному, рак головы и шеи, рак яичника, мезотелиому и множественную миелому. В некоторых вариантах осуществления рак выбран из мелкоклеточного рака легкого, глиобластомы, видов нейробластомы, меланомы, карциномы молочной железы, рака желудка, колоректального рака (CRC) и гепатоцеллюлярной карциномы. При этом в некоторых вариантах осуществления рак выбран из немелкоклеточного рака легкого, колоректального рака, глиобластомы и карциномы молочной железы, в том числе метастатических форм этих видов рака. В других вариантах осуществления рак выбран из класса видов зрелого B-клеточного рака за исключением лимфомы Ходжкина, но включая DLBCL B-клеточного типа из герминативного центра (GCB), активную DLBCL B-клеточного типа (ABC), фолликулярную лимфому (FL), лимфому из клеток мантийной зоны (MCL), острый миелоидный лейкоз (AML), хронический лимфоидный лейкоз (CLL), лимфому из клеток маргинальной зоны (MZL), мелкоклеточный лимфоцитарный лейкоз (SLL), лимфоплазмацитарную лимфому (LL), макроглобулинемию Вальденстрема (WM), лимфому центральной нервной системы (CNSL), лимфому Беркитта (BL), B-клеточный пролимфоцитарный лейкоз, лимфому из клеток маргинальной зоны селезенки, волосатоклеточный лейкоз, лимфому/лейкоз селезенки, неклассифицируемую диффузную B-мелкоклеточную лимфому из красной пульпы селезенки, вариант волосатоклеточного лейкоза, макроглобулинемию Вальденстрема, болезни тяжелых цепей, болезнь тяжелых цепей, болезнь тяжелой γ-цепи, болезнь тяжелой μ-цепи, плазмаклеточную миелому, солитарную плазмацитому кости, внекостную плазмацитому, экстранодальную лимфому из клеток маргинальной зоны лимфоидной ткани слизистых оболочек (MALT-лимфому), узловую лимфому из клеток маргинальной зоны, узловую лимфому из клеток маргинальной зоны у детей, фолликулярную лимфому у детей, первичную кожную лимфому из клеток фолликулярного центра, B-крупноклеточную лимфому, богатую Т-клетками/гистиоцитами, первичную DLBCL ЦНС, первичную кожную DLBCL, ножного типа, EBV-положительную DLBCL у лиц пожилого возраста, DLBCL, ассоциированную с хроническим воспалением, лимфоматоидный гранулематоз, первичную средостенную (тимическую) B-крупноклеточную лимфому, интраваскулярную B-крупноклеточную лимфому, ALK-положительную B-крупноклеточную лимфому, плазмобластную лимфому, B-крупноклеточную лимфому, возникающую при HHV8-ассоциированной многоочаговой болезни Кастлемана, первичную выпотную лимфому: B-клеточную лимфому, неклассифицируемую, с признаками, промежуточными между диффузной B-крупноклеточной лимфомой и лимфомой Беркитта, и B-клеточную лимфому, неклассифицируемую, с признаками, промежуточными между диффузной B-крупноклеточной лимфомой и классической лимфомой Ходжкина.
Используемое в данном документе «лечение», или «лечить», или «осуществлять лечение» относятся к клиническому вмешательству в попытке изменить естественное течение заболевания у подлежащего лечения индивидуума, и его можно проводить либо для профилактики, либо во время клинического исследования. Требуемые эффекты лечения включают без ограничения предупреждение возникновения или рецидива заболевания, облегчение симптомов, снижение любых непосредственных или опосредованных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, уменьшение тяжести или облегчение болезненного состояния, а также ремиссию или улучшение прогноза.
Используемые в данном документе термины «предупреждать», «осуществление предупреждения» и «предупреждение» относятся к предупреждению или подавлению развития или возникновения нарушения или заболевания.
Используемые в данном документе термины «уменьшение тяжести» и «облегчение» относятся к уменьшению или снижению тяжести состояния или любого из его симптомов.
В некоторых вариантах осуществления антитела по настоящему изобретению применяют для замедления развития нарушения или заболевания или для замедления прогрессирования нарушения или заболевания. Используемое в данном документе «замедление прогрессирования» нарушения или заболевания означает задерживание, препятствование, уменьшение скорости, замедление, стабилизацию и/или отсрочивание развития заболевания или нарушения (например, клеточного пролиферативного нарушения, например рака). Данное замедление может варьировать по времени в зависимости от анамнеза заболевания и/или индивидуума, подлежащего лечению.
Эффективное количество такого антитела или композиции можно вводить индивидууму, страдающему раком или артритом, ревматоидным артритом, колитом, воспалительным заболеванием кишечника, аутоиммунным диабетом I типа и т.д. «Эффективное количество» раскрытого в данном документе антитела к CD3 или композиции (например, фармацевтической композиции), содержащей такое антитело, представляет собой по меньшей мере минимальное количество, необходимое для достижения требуемого терапевтического или профилактического результата, например измеримого улучшения или предупреждения конкретного нарушения, например клеточного пролиферативного нарушения, например рака, предпочтительно с минимальными токсическими или вредными эффектами или без них. Эффективное количество может варьироваться, среди прочего, в зависимости от болезненного состояния, возраста, пола и веса пациента, а также способности антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) вызывать требуемый ответ у индивидуума и, в некоторых случаях, путем совместного введения одного или более дополнительных терапевтических средств.
В некоторых вариантах осуществления антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, можно применять для усиления иммунной функции у индивидуума, страдающего клеточным пролиферативным нарушением или аутоиммунным нарушением. После введения такое антитело или композиция могут усиливать иммунную функцию у индивидуума, имеющего клеточное пролиферативное нарушение или аутоиммунное нарушение, путем активации эффекторных клеток (например, Т-клеток, например, CD8+ и/или CD4+ Т-клеток, включая Treg), расширения (увеличения) популяции эффекторных клеток, уменьшения популяции целевых клеток (например, клетки, экспрессирующей вторую биологическую молекулу, распознаваемую антителом к CD3 по настоящему изобретению, таким как биспецифическое антитело) и/или уничтожения целевой клетки (например, целевой опухолевой клетки).
Антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, раскрытые в данном документе, можно применять для лечения нарушений, в том числе без ограничения пролиферативного нарушения, онкологического нарушения, иммуноонкологического нарушения, неврологического нарушения, когнитивного нарушения, нейродегенеративного нарушения, аутоиммунного нарушения. В одном варианте осуществления эффективное количество такого антитела к CD3 можно вводить отдельно или в комбинации с по меньшей мере одним дополнительным средством индивидууму, страдающему таким нарушением. Таким «индивидуумом» может быть млекопитающее и, в частности, человек.
Неограничивающие иллюстративные дополнительные терапевтические средства включают химиотерапевтическое средство, конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC) и/или биологический модификатор. Химиотерапевтические средства могут быть выбраны из циклофосфамида, доксорубицина, винкристина и преднизолона (CHOP). ADC может быть выбран из конъюгата антитела к CD79b и лекарственного средства (такого как антитело к CD79b-MC-vc-PAB-MMAE или конъюгат антитела к CD79b и лекарственного средства, описанный в любом из патента США № 8088378 и/или US 2014/0030280, или полатузумаб-ведотин), конъюгата антитела к CD19 и лекарственного средства, конъюгата антитела к CD22 и лекарственного средства, конъюгата антитела к CD45 и лекарственного средства и конъюгата антитела к CD32 и лекарственного средства. Биологический модификатор может быть выбран из ингибитора BCL-2 (такого как GDC-0199/ABT-199), леналидомида (Revlimid®), ингибитора PI3K-дельта (такого как иделалисиб (Zydelig®)), антагониста связывания PD-1-оси, агониста, например антитела-агониста, направленного против активирующей костимулирующей молекулы, например CD40, CD226, CD28, OX40 (например, AgonOX), GITR, CD137 (также известного как TNFRSF9, 4-1 BB или ILA), CD27 (например, CDX-1127), HVEM или CD127, антагониста, например антитела-антагониста, направленного против ингибирующей костимулирующей молекулы, например CTLA-4 (также известной как CD152), PD-1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3, B7-H3, B7-H4, IDO (например, 1-метил-D-триптофан (также известного как 1-D-MT)), TIGIT, MICA/B, GITR (например, TRX518) или аргиназы, ипилимумаба (также известного как MDX-010, MDX-101 или Yervoy®), тремелимумаба (также известного как тицилимумаб или CP-675206), урелумаба (также известного как BMS-663513), MGA271, антагониста, направленного против TGF-бета, например метелимумаба (также известного как CAT-192), фрезолимумаба (также известного как GC1008), LY2157299k, и адаптивного переноса T-клетки (например, цитотоксической T-клетки или CTL), экспрессирующей химерный антигенный рецептор (CAR), например адаптивного переноса T-клетки, содержащей доминантно-негативный рецептор TGF-бета, например доминантно-негативный рецептор TGF-бета II типа.
Антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, раскрытые в данном документе, можно применять для усиления иммунной функции у индивидуума, например человека, имеющего такое нарушение, индивидуума, имеющего такое нарушение. В одном варианте осуществления способ усиления иммунной функции предусматривает введение индивидууму эффективного количества антитела к CD3 для активации эффекторных клеток (например, T-клеток, например CD8+ и/или CD4+ T-клеток), роста (увеличения) популяции эффекторных клеток, снижения популяции целевых клеток и/или уничтожения целевой клетки (например, целевой опухолевой клетки).
В дополнительном аспекте также предусмотрены фармацевтические составы, содержащие антитела и/или антигенсвязывающие фрагменты к CD3, описанные в данном документе, например, для применения в любом из вышеперечисленных терапевтических способов. «Фармацевтический состав» относится к препарату в такой форме, чтобы обеспечивать эффективность биологической активности содержащегося в нем активного ингредиента, такого как антитела к CD3, описанные в данном документе, и который предпочтительно не содержит дополнительных компонентов, которые являются недопустимо токсичными для субъекта, которому будут вводить состав.
В одном варианте осуществления фармацевтический состав содержит любое из антител к CD3, раскрытых в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. «Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтическом составе, который не является активным ингредиентом и нетоксичен для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает без ограничения буфер, вспомогательное вещество, стабилизатор или консервант. В другом варианте осуществления фармацевтический состав содержит любое из антител к CD3, представленных в данном документе, и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство.
Антитела по настоящему изобретению можно применять либо отдельно, либо в комбинации с другими средствами в терапии, например антитело к CD3 и/или его антигенсвязывающий фрагмент можно вводить совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим средством. В определенных вариантах осуществления дополнительное терапевтическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство, средство, ингибирующее рост, цитотоксическое средство, средство, применяемое в лучевой терапии, антиангиогенное средство, апоптическое средство, противотубулиновое средство или другое средство, такое как антагонист рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) (например, ингибитор тирозинкиназы), ингибитор HER1/EGFR (например, эрлотиниб (Tarceva™)), ингибитор фактора роста тромбоцитов (например, Gleevec™ (иматиниба мезилат)), ингибитор COX-2 (например, целекоксиб), интерферон, цитокин, антитело, отличное от антитела к CD3 по настоящему изобретению, такое как антитело, которое связывается с одной или более из следующих мишеней: ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-бета, BIyS, APRIL, BCMA VEGF или рецептором(ами) VEGF, TRAIL/Apo2, PD-1, PD-L1, PD-L2 или другим биологически активным или органическим химическим средством.
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлен способ, где дополнительное терапевтическое средство представляет собой глюкокортикоид. В одном варианте осуществления глюкокортикоид представляет собой дексаметазон.
Такие виды комбинированной терапии, отмеченные выше, охватывают комбинированное введение (при котором два или более терапевтических средства включают в один и тот же или в отдельные составы) и раздельное введение, в случае которого введение антитела по настоящему изобретению может происходить до введения дополнительного терапевтического средства или средств, одновременно с ним и/или после него. В одном варианте осуществления введение антитела к CD3 и введение дополнительного терапевтического средства происходит в пределах приблизительно одного месяца, или в пределах приблизительно одной, двух или трех недель, или в пределах приблизительно одного, двух, трех, четырех, пяти или шести дней относительно друг друга. Антитела к CD3 по настоящему изобретению (например, биспецифические антитела к CD3 по настоящему изобретению, которые связываются с CD3 и второй биологической молекулой, например антигеном клеточной поверхности, например опухолевым антигеном, таким как TDB-антитело по настоящему изобретению или его вариант) также можно применять в комбинации с лучевой терапией.
Антитело по настоящему изобретению (и/или любое дополнительное терапевтическое средство) может быть введено с помощью любых подходящих способов, включая парентеральное, внутрилегочное и интраназальное и, если это требуется для местного лечения, внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. В некоторых вариантах осуществления антитело вводят с помощью подкожного введения. В некоторых вариантах осуществления антитело к CD3, введенное с помощью подкожной инъекции, проявляет менее токсичный ответ у пациента, чем то же антитело к CD3, вводимое с помощью внутривенной инъекции. Введение дозы может осуществляться с помощью любого подходящего пути введения, например, посредством инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, отчасти в зависимости от того, является ли введение краткосрочным или хроническим. В данном документе подразумеваются различные схемы введения доз, включая без ограничения однократное или множественное введения через различные моменты времени, болюсное введение и импульсную инфузию.
Антитела по настоящему изобретению будут составлять, разделять на дозы и вводить в соответствии с надлежащей медицинской практикой. Факторы, рассматриваемые в данном контексте, включают конкретное подлежащее лечению нарушение, конкретного подлежащего лечению млекопитающего, клиническое состояние отдельного пациента, причину нарушения, участок для доставки средства, способ введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Антитело не должно, но необязательно может быть составлено с одним или более средствами, применяемыми в настоящее время для предупреждения или лечения рассматриваемого нарушения. Эффективное количество таких других средств зависит от количества антитела, присутствующего в составе, типа нарушения или лечения, и других факторов, рассмотренных выше. Их обычно применяют в таких же дозах и путях введения, которые описаны в данном документе, или в дозах, составляющих от приблизительно 1 до 99% от доз, описанных в данном документе, или в любой дозе и посредством любого пути, которые эмпирически/клинически определены как подходящие.
В случае предупреждения или лечения заболевания подходящая доза антитела по настоящему изобретению (применяемого отдельно или в комбинации с одним или более другими дополнительными терапевтическими средствами) будет зависеть от типа подлежащего лечению заболевания, типа антитела, тяжести и течения заболевания, от того, вводится ли антитело в профилактических или терапевтический целях, предшествующей терапии, клинического анамнеза пациента и ответа на антитело, а также решения лечащего врача. Антитело соответствующим образом вводят пациенту за один раз или в течение серии обработок.
В качестве общего предложения терапевтически эффективное количество антитела к CD3, вводимое человеку, будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,01 до приблизительно 100 мг/кг массы тела пациента, независимо от того, вводится ли оно за одно или более введений. В некоторых вариантах осуществления, например, применяемое антитело вводят из расчета от приблизительно 0,01 до приблизительно 45 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 40 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 35 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 30 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 25 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 20 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 15 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 10 мг/кг, от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 мг/кг или от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 мг/кг ежедневно. В одном варианте осуществления антитело к CD3, описанное в данном документе, вводят человеку в дозе, составляющей приблизительно 100 мг, приблизительно 200 мг, приблизительно 300 мг, приблизительно 400 мг, приблизительно 500 мг, приблизительно 600 мг, приблизительно 700 мг, приблизительно 800 мг, приблизительно 900 мг, приблизительно 1000 мг, приблизительно 1100 мг, приблизительно 1200 мг, приблизительно 1300 мг или приблизительно 1400 мг в день 1 циклов продолжительностью 21 день. Дозу можно вводить в виде однократной дозы или в виде множественных доз (например, 2 или 3 доз), таких как инфузии. В случае повторных введений через несколько дней или более, в зависимости от состояния, лечение обычно будет поддерживаться до проявления требуемого подавления симптомов заболевания. Одна иллюстративная доза антитела будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг. Таким образом, пациенту могут вводить одну или более доз, составляющих приблизительно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любая их комбинация). Такие дозы можно вводить с перерывами, например, через неделю или через три недели (например, так, чтобы пациент получил от приблизительно двух до приблизительно двадцати или, например, приблизительно шесть доз антитела к CD3). Можно вводить начальную более высокую ударную дозу с последующими одной или более низкими дозами. Прогресс данной терапии легко отслеживать с помощью традиционных методик и анализов.
В некоторых вариантах осуществления способы по настоящему изобретению могут дополнительно предусматривать дополнительную терапию. Дополнительная терапия может представлять собой лучевую терапию, оперативное вмешательство, химиотерапию, генную терапию, ДНК-терапию, вирусную терапию, РНК-терапию, иммунотерапию, трансплантацию костного мозга, нанотерапию, терапию моноклональными антителами или комбинацию вышеуказанных. Дополнительная терапия может быть представлена в форме адъювантной или неоадъювантной терапии. В некоторых вариантах осуществления дополнительная терапия представляет собой введение низкомолекулярного ферментативного ингибитора или противометастатического средства. В некоторых вариантах осуществления дополнительная терапия представляет собой введение средств, ограничивающих побочные эффекты (например, средств, предназначенных для уменьшения частоты возникновения и/или тяжести побочных эффектов лечения, таких как противорвотные средства и т.д.). В некоторых вариантах осуществления дополнительная терапия представляет собой лучевую терапию. В некоторых вариантах осуществления дополнительная терапия представляет собой хирургическое вмешательство. В некоторых вариантах осуществления дополнительная терапия представляет собой комбинацию лучевой терапии и хирургического вмешательства. В некоторых вариантах осуществления дополнительная терапия представляет собой облучение гамма-лучами. В некоторых вариантах осуществления дополнительная терапия может представлять собой отдельное введение одного или более терапевтических средств, описанных выше.
В другом аспекте настоящего изобретения представлено изделие, содержащее материалы, применимые для лечения, предупреждения и/или диагностики описанных выше нарушений. Изделие предусматривает контейнер и этикетку или листок-вкладыш на контейнере, или они ассоциированы с ним. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы, шприцы, мешки для IV-растворов и т.д. Контейнеры могут быть образованы из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая собственно сама находится в нем или объединена с другой композицией, эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностики состояния, и он может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой мешок для внутривенных растворов или флакон, имеющий пробку, которая протыкается с помощью иглы для подкожных инъекций). По меньшей мере одним активным средством в композиции является антитело по настоящему изобретению. Этикетка или листок-вкладыш указывают на то, что композицию применяют для лечения выбранного состояния. Более того, изделие может содержать (a) первый контейнер с композицией, содержащейся в нем, где композиция содержит антитело по настоящему изобретению; и (b) второй контейнер с композицией, содержащейся в нем, где композиция содержит дополнительное цитотоксическое средство или иное терапевтическое средство. В данном варианте осуществления настоящего изобретения изделие может дополнительно содержать листок-вкладыш указывающий на то, что композиции могут применяться для лечения конкретного состояния. В качестве альтернативы или дополнения изделие может дополнительно содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), забуференный фосфатом солевой раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно может дополнительно включать другие материалы, требуемые с коммерческой позиции и пользовательской точки зрения, включающие другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Соответственно, также предполагается производство и/или получение фармацевтической композиции, содержащей антитела к CD3 и/или антигенсвязывающие фрагменты, раскрытые в данном документе. Композицию можно применять отдельно или в комбинации с другими активными средствами для лечения клеточного пролиферативного нарушения (например, рака) или аутоиммунного нарушения (например, артрита, ревматоидного артрита, колита, воспалительного заболевания кишечника, аутоиммунного диабета I типа и т.д.).
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, содержащие антитела к CD3 и/или их антигенсвязывающие фрагменты, описанные в данном документе, получают, например, путем смешивания такого антитела, имеющего требуемую степень чистоты, с одним или более необязательными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) в форме лиофилизированных составов или водных растворов, необязательно приготовленных для модифицированного (например, длительного) высвобождения. Иллюстративные лиофилизированные составы на основе антитела описаны в патенте США № 6267958. Водные составы на основе антитела включают составы, описанные в патенте США № 6171586 и WO2006/044908, составы, описанные во втором документе, содержат гистидинацетатный буфер.
Фармацевтически приемлемые носители обычно нетоксичны для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают без ограничения буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид; бензетония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирты; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее чем приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; металлосодержащие комплексы (например Zn-белковые комплексы) и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (PEG). В данном документе иллюстративные фармацевтически приемлемые носители дополнительно включают средства для диспергирования лекарственных средств в межклеточном пространстве, такие как растворимые нейтрально-активные гиалуронидазные гликопротеины (sHASEGP), например человеческие растворимые PH-20 гиалуронидазные гликопротеины, такие как rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Определенные иллюстративные sHASEGP и способы применения, предусматривающие rHuPH20, описаны в публикации заявки на патент США №№ 2005/0260186 и 2006/0104968.
Такие составы могут содержать более одного активного ингредиента, если это необходимо для конкретного показания, подлежащего лечению, предпочтительно ингредиенты c комплементарными активностями, которые не оказывают отрицательного воздействия друг на друга и присутствуют в количествах, эффективных для предполагаемой цели. Например, кроме того, может быть необходимым обеспечить дополнительное терапевтическое средство (например, химиотерапевтическое средство, цитотоксическое средство, средство, ингибирующее рост, и/или антигормональное средство).
Активные ингредиенты могут быть заключены в микрокапсулы, полученные, например, с помощью методик коацервации или с помощью полимеризации на границе раздела фаз, например, в гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и микрокапсулы из поли-(метилметацилата) соответственно, в коллоидные системы для доставки лекарственного средства (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики раскрыты в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Примеры
Таблица 1. Данные о связывании иллюстративных высокоаффинных антител к CD3 в биспецифическом формате
Jurkat CD3+ человека Кратность по сравнению с фоном (FOB)
Jurkat CD3+ яванского макака Кратность по сравнению с фоном (FOB)
Таблица 2. Профиль разрабатываемости антител к CD3 в биспецифическом формате
Таблица 3. Измерения термостабильности для иллюстративных антител к CD3
Материалы и способы
В дополнение к описанию, представленному выше, в примерах использовали следующие материалы и способы.
Способы FACS-отбора с давлением аффинности. Вкратце, клетки дрожжей (по меньшей мере ~2 x 107 клеток/параметр мечения) инкубировали с достаточным объемом биотинилированного антигена, чтобы обеспечить стехиометрический избыток относительно среднего числа презентирования IgG. Параметры мечения альбумина представляют собой 100-1 нМ в равновесных условиях; как правило, мечение проводили в течение от 20 мин. до нескольких часов при комнатной температуре в буфере для промывки FACS (забуференный фосфатом солевой раствор (PBS)/0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA)). Затем после трехкратной промывки с помощью буфера для промывки, дрожжи окрашивали с помощью вторичных реагентов, конъюгата антитела к легкой цепи человека с FITC (LC-FITC), разбавленного 1:100, и либо стрептавидина-633 (SA-633), разбавленного 1:500, либо экстравидина-фикоэритрина (EA-PE), разбавленного 1:50, в течение 15 мин. при 4°C. После двукратной промывки с помощью ледяного буфера для промывки клеточные осадки ресуспендировали в буфере для промывки в типичном объеме, составляющем по меньшей мере 1 мл на 1 x 107 дрожжей и переносили в пробирки для сортировки, закрытые защелкивающейся крышкой с ситом. Сортировку проводили с применением сортера FACS ARIA (BD Biosciences) и определяли сортировочные гейты для отбора связывающих молекул. После последнего раунда сортировки дрожжи высевали и отдельные колонии отбирали для определения характеристик.
Способы FACS-отбора с термическим давлением. Исходное антитело подвергали диверсификации с помощью ПЦР сниженной точности с получением библиотеки оптимизации в дрожжах. Вначале данную дрожжевую библиотеку подвергали раунду положительного отбора с антигеном, чтобы отобрать клетки, экспрессирующие связывающие молекулы, с применением CD3εN27. Затем данную обогащенную популяцию пропускали через ряд параметров термического давления в диапазоне от ~50°C до 65°C включительно в течение 10 мин. с применением в качестве контроля комнатной температуры. Оптимальные параметры давления гейтировали по презентации LC (антитело к лямбда-цепи человека, конъюгированное с PE) и связыванию антигена (SA-APC), что отражает остаточный свернутый IgG, компетентный для связывания реагентов отбора. Отсортированные клетки осаждали и плазмиды экстрагировали с применением коммерческого набора для очистки плазмид дрожжей (Zymo Research), при этом клеточные стенки дрожжей разрушали с помощью зимолазы, а ДНК впоследствии очищали с помощью миниколонки для очистки ДНК. Затем плазмидную ДНК трансформировали в E. coli для амплификации с последующим выделением минипрепов плазмидной ДНК с помощью набора для очистки плазмид E. coli (Qiagen). Затем плазмидную ДНК готовили для трансформации в соответствующий штамм дрожжей для последующих циклов отбора или секвенирования и продуцирования IgG.
Оптимизация с помощью ПЦР сниженной точности. С помощью мутагенеза тяжелой цепи (VH) и/или легкой цепи (VL) на основе ПЦР сниженной точности с применением стандартных методик молекулярной биологии вводили случайное разнообразие. Вкратце, мутагенные аналоги нуклеотидов dPTP и 8-оксо-dGTP вводили в процесс амплификации VH и VL при концентрации 1 мкМ для повышения частоты ошибки включения основания до приблиз. 0,01 п. о. Мутированный ПЦР-продукт рекомбинировали in situ с помощью гомологичной рекомбинации с линеаризованным вектором, содержащий последовательности константного участка HC или LC. Это, как правило, давало библиотеку с разнообразием 1 x 107–8. Давление аффинности и экспрессии использовали совместно путем инкубации комплекса антиген-антитело-дрожжевая клетка при уменьшающихся концентрациях антигена (равновесное давление) или конкуренции с исходным Fab (равновесное и кинетическое давление) различное количество раз для отбора антител с наивысшей аффинностью в FACS на протяжении последовательных раундов отбора.
Мутагенез CDR H3 на основе олигонуклеотидных праймеров. Выявленные или ранее оптимизированные антитела можно усовершенствовать посредством дальнейшей оптимизации с помощью введения разнообразия в последовательность CDR H3. Для этого вариабельный участок легкой цепи начального антитела подвергают ПЦР-амплификации, а затем с применением дрожжевой гомологичной рекомбинации вводят в штамм дрожжей, содержащий пустой вектор для легкой цепи. Он представляет собой штамм дрожжей с исходной легкой цепью. Тяжелую цепь начального антитела используют в качестве исходного материала для ПЦР в комбинации с праймерами, специфическими в отношении генов зародышевой линии, что дает ПЦР-продукт, который содержит тяжелую цепь от каркасного участка 1 до каркасного участка три. Данную амплификацию осуществляют с применением мутагенного нуклеотида 8-оксо-dGTP для обеспечения дополнительных низких уровней мутагенеза в амплифицированном участке тяжелой цепи. С целью создания сконструированного разнообразия в участке CDR H3 начального антитела создавали/заказывали библиотеку олигонуклеотидов CDR H3 (т.е. из IDT). Пул олигонуклеотидов амплифицировали с помощью праймеров, содержащих 5’-хвосты, которые обеспечивают рекомбинацию, специфическую в отношении генов зародышевой линии, с амплифицированным участком FW1-FW3 и пустым вектором. Для FW4 используют универсальный 3’-праймер. В качестве альтернативы можно осуществлять мутагенную ПЦР, которая вводит 8-оксо-dGTP в реакцию ПЦР, с использованием 5’-праймеров, специфических в отношении генов зародышевой линии, универсального 3’-праймера и ДНК VH. После того, как были получены исходные материалы в виде штамма с LC, FW1-FW3 HC и диверсифицированного CDR H3-FW4, проводят тройную трансформацию путем введения двух компонентов HC вместе с пустым вектором для HC в штамм с LC. Затем клетки выращивали в условиях давления отбора, чтобы убедиться в присутствии компонентов HC и LC.
Продуцирование антитела в дрожжах и его очистка. Клоны дрожжей выращивали до насыщения, а затем индуцировали в течение 48 ч. при 30°C со встряхиванием. После индукции клетки дрожжей осаждали и супернатанты собирали для очистки. IgG очищали с использованием колонки с белком A и элюировали с помощью уксусной кислоты, pH 2,0. Fab-фрагменты получали с помощью расщепления под действием папаина и очищали путем пропускания через KappaSelect или CaptureSelect IgG-CH1 (GE Healthcare LifeSciences).
Продуцирование антитела в HEK и его очистка. Экспрессию IgG в клетках млекопитающих выполняли путем субклонирования антител в новый вектор экспрессии с последующими временной трансфекцией и экспрессией в HEK293ADI1, моноклональной линией клеток, полученной из HEK293 (DSMZ), выбранной из-за роста без образования скоплений, скорости роста и трансфицируемости. Вкратце, векторы экспрессии, содержащие представляющее интерес антитело, трансфицировали путем образования комплекса с реагентом для трансфекции с последующим воздействием на клетки HEK в течение одного часа, после чего следовало разбавление питательной средой до конечной плотности, составляющей 4 миллиона клеток на мл. Затем клетки культивировали в течение 7 дней с подпиткой свежей средой через каждые 48 часов. Через 7 дней супернатант собирали после центрифугирования и проводили очистку с применением белка A. При необходимости добавочно использовали очистку на колонке CHT для достижения >95% мономеров.
Измерения KD с помощью ForteBio (интерферометрия биослоя; BLI). Измерения аффинности с помощью ForteBio проводили в целом так, как это описано ранее (Estep, P., et al., High throughput solution-based measurement of antibody-antigen affinity and epitope binning. MAbs, 2013. 5(2): p. 270-8). Вкратце, измерения аффинности с помощью ForteBio проводили путем загрузки IgG в рабочем режиме на сенсоры AHQ. Сенсоры уравновешивали в холостом режиме с помощью буфера для анализа в течение 30 мин., а затем отслеживали в рабочем режиме в течение 60 секунд для установки исходных значений. Сенсоры с загруженными IgG подвергали воздействию 100 нМ антигена в течение 5 мин., после чего их переносили в буфер для анализа на 5 мин. для измерения скорости диссоциации. Кинетику анализировали с применением модели связывания 1:1.
Измерения KD с помощью BiaCore (поверхностный плазмонный резонанс; SPR). Биосенсорный анализ проводили при 25°C в буферной системе HBS-EP (10 мМ HEPES, pH 7,3, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% поверхностно-активного вещества P20) с применением оптического биосенсора Biacore 8K, прикрепленного к сенсорному чипу CM5 (GE Healthcare, Марлборо, штат Массачусетс, США). Образец поддерживали при 10°C. Антитело для захвата, представляющее собой антитело козы к IgG человека (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., Вест-Гроув, штат Пенсильвания, США; 109-005-098), иммобилизировали (11700 +/- 400 RU) на обеих проточных ячейках сенсорного чипа с применением стандартной химии иммобилизации по аминогруппе. Данный тип поверхности обеспечивает формат для повторяемого захвата свежего анализируемого антигена после каждой стадии регенерации. Проточную ячейку 2 использовали для анализа захваченного антигена (35,7 +/- 0,8 RU), в то время как проточную ячейку 1 использовали в качестве эталонной проточной ячейки. В проточном буфере готовили Fab в концентрациях в диапазоне от 100 до 0,412 нМ (3-кратные разбавления). Каждую из концентраций образца Fab прогоняли в виде одной повторности. Также прогоняли два холостых ввода (буфер) и их использовали для оценки и вычитания артефактов системы. Фазы ассоциации и диссоциации для всех концентраций Fab отслеживали в течение 180 с каждая при расходе, составляющем 30 мкл/мин. Поверхность регенерировали с помощью 10 мМ глицина, pH 1,5, в течение 30 с при расходе 30 мкл/мин. Данные выравнивали, учитывали два эталона и аппроксимировали с применением программного обеспечения для оценки Biacore 8K, версии 1.0.
Эпитоп-специфическая сортировка/блокирование лиганда с помощью Octet Red384. Эпитоп-специфическую сортировку/блокирование лиганда проводили с применением стандартного анализа перекрестного блокирования в «сэндвич»-формате. Контрольные IgG к мишени загружали на сенсоры AHQ и незанятые сайты связывания Fc на сенсоре блокировали с помощью нерелевантного IgG1-антитела человека. Затем на сенсоры воздействовали с помощью 100 нМ целевого антигена, а затем вторым антителом к мишени или лигандом. Данные обрабатывали с применением программного обеспечения для анализа данных ForteBio 7.0. Дополнительное связывание вторым антителом или лигандом после ассоциации с антигеном указывает на незанятый эпитоп (неконкурирующая молекула), в то время как отсутствие связывания указывает на блокирование эпитопа (конкурирующая молекула или блокирование лиганда).
Эксклюзионная хроматография. Колонку TSKgel SuperSW mAb HTP (22855) применяли для быстрого SEC-анализа mAb, продуцируемых в клетках дрожжей и млекопитающих, при расходе 0,4 мл/мин. c длительностью цикла, составляющей 6 мин./прогон. В качестве подвижной фазы применяли 200 мМ фосфат натрия и 250 мМ хлорид натрия.
Динамическая сканирующая флуориметрия (DSF). 10 мкл 20x Sypro Orange добавляли к 20 мкл 0,2-1 мг/мл раствора mAb или Fab. Устройство для RT-PCR (BioRad CFX96 RT PCR) применяют для линейного увеличения температуры планшета с образцами от 40 до 95°C при шаге 0,5°C с уравновешиванием в течение 2 мин. при каждом значении температуры. Отрицательное значение первой производной для исходных данных используют для извлечения Tm.
Получение PSR. Реагент полиспецифической реактивности (PSR) получали так, как это описано, например, в WO 2014/179363 и Xu et al., mAbs, 2013. Вкратце, 2,5 литра клеток CHO-S применяли в качестве начального материала. Клетки осаждали при 2400 x g в течение 5 мин. в 500-мл центрифужных бутылях, заполненных до 400 мл. Клеточные осадки объединяли, а затем ресуспендировали в 25 мл буфера B и осаждали при 2400 x g в течение 3 мин. Буфер декантировали и промывку повторяли еще раз. Клеточные осадки ресуспендировали в 3x объеме осадка буфера B, содержащего 1x ингибиторы протеаз (Roche, Complete, без EDTA), с применением гомогенизатора Polytron, при этом клетки выдерживали на льду. Затем гомогенат центрифугировали при 2400 x g в течение 5 мин. и супернатант выдерживали и дополнительно однократно осаждали (2400 x g/5 мин.) с тем, чтобы обеспечить удаление неразрушенных клеток, клеточного дебриса и ядер; полученный супернатант представляет собой препарат общего белка. Затем супернатант переносили в две 45-мл центрифужные пробирки Nalgene Oak Ridge и осаждали при 40000 x g в течение 40 мин при 4°C. Затем супернатанты, содержащие отделенные цитозольные белки (SCP), переносили в чистые пробирки Oak Ridge и дополнительно однократно центрифугировали при 40 000 x g. Параллельно осадки, содержащие мембранную фракцию (EMF), выдерживали и центрифугировали при 40000 в течение 20 мин. для удаления остаточного супернатанта. Затем осадки с EMF ополаскивали с помощью буфера B. Затем 8 мл буфера B добавляли к осадкам, содержащим мембраны, для разрыхления осадков и их переносили в гомогенизатор Даунса. После гомогенизации осадков их переносили в 50-мл коническую пробирку, и они представляли собой конечный препарат EMF.
Один миллиард клеток млекопитающих (например, CHO, HEK293, Sf9) при концентрации ~106 - 107 клеток/мл переносили из среды культивирования тканей в 4x 250 мл конические пробирки и осаждали при 550 x g в течение 3 мин. Все последующие стадии проводили при 4°C или на льду с ледяными буферами. Клетки промывали с помощью 100 мл PBSF (1x PBS + 1 мг/мл BSA) и объединяли в одной конической пробирке. После удаления супернатанта далее клеточный осадок ресуспендировали в 30 мл буфера B (50 мМ HEPES, 0,15 M NaCl, 2 мМ CaCl2, 5 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 10% глицерина, pH 7,2) и осаждали при 550 x g в течение 3 мин. Супернатант из буфера B декантировали и клетки ресуспендировали в 3x объеме осадка буфера B с 2,5x ингибитором протеаз (Roche, Complete, без EDTA). С этого момента и далее в буфер B включены ингибиторы протеаз. Клетки гомогенизировали четыре раза на протяжении 30-секундных импульсов (гомогенизатор Polytron, PT1200E) и мембранную фракцию осаждали при 40000 x g в течение 1 часа при 4°C. Осадок ополаскивали с помощью 1 мл буфера B; супернатант выдерживали, и он представляет собой. Осадок переносили в гомогенизатор Даунса с 3 мл буфера B и ресуспендировали путем медленного подъема и опускания пестика в ходе 30-35 движений. Обогащенную мембранную фракцию (EMF) переносили в новую пробирку для сбора, промывая пестик для сбора всего возможного белка. Концентрацию белка в очищенной EMF определяли с применением набора для анализа белка Dc (BioRad). Чтобы солюбилизировать EMF, ее переносили в буфер для солюбилизации (50 мМ HEPES, 0,15 M NaCl, 2 мМ CaCl2, 5 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 1% н-додецил-b-D-мальтопиранозида (DDM), 1x ингибитор протеаз, pH 7,2) с получением конечной концентрации 1 мг/мл. Смесь перемешивали в течение ночи при 4°C путем вращения с последующим центрифугированием в пробирке объемом 50 мл Oak Ridge (Fisher Scientific, 050529-ID) при 40 000 x g в течение 1 часа. Собирали супернатант, который представляет собой растворимые мембранные белки (SMP), и количественно оценивали выход белка так, как это описано выше.
Для биотинилирования готовили исходный раствор NHS-LC-биотина в соответствии с протоколом производителя (Pierce, Thermo Fisher). Вкратце, 20 мкл реагента биотина добавляли на каждый 1 мг образца EMF и инкубировали при 4°C в течение 3 часов при аккуратном перемешивании. Объем доводили до 25 мл с помощью буфера B и переносили в центрифужную пробирку Oak Ridge. Биотинилированную EMF (b-EMF) осаждали при 40000 x g в течение 1 часа и дважды промывали с помощью 3 мл буфера C (буфер B без глицерина), не нарушая целостность осадка. Остаточный раствор удаляли. Осадок ресуспендировали с помощью гомогенизатора Даунса в 3 мл буфера C так, как это описано ранее. Теперь ресуспендированный осадок представлял собой биотинилированную EMF (b-EMF). Проводили солюбилизацию, как это описано выше, для получения b-SMP.
Анализы связывания PSR. Анализы проводили в целом так, как это описано, например, в Xu et al. Чтобы охарактеризовать профиль PSR моноклональных антител, презентированных на дрожжах, два миллиона дрожжей, презентирующих IgG, переносили в 96-луночный аналитический планшет и осаждали при 3000 x g в течение 3 мин для удаления супернатанта. Осадок ресуспендировали в 50 мкл свежеприготовленного разбавления 1:10 исходных растворов b-PSR и инкубировали на льду в течение 20 минут. Клетки дважды промывали с помощью 200 мкл холодного PBSF и осадок ресуспендировали в 50 мкл смеси для вторичного мечения (экстравидин-R-PE, антитело к LC человека, конъюгированное с FITC, и йодид пропидия). Смесь инкубировали на льду в течение 20 минут с последующими двумя промывками с помощью 200 мкл ледяного PBSF. Клетки ресуспендировали в 100 мкл ледяного PBSF и планшет прогоняли на FACSCanto (BD Biosciences) с применением устройства для ввода образцов HTS. Данные проточной цитометрии анализировали в отношении средней интенсивности флуоресценции в канале R-PE и нормализовали относительно надлежащих контролей для оценки неспецифического связывания. Ранее были описаны многочисленные способы презентации или отображения антител или фрагментов антител на поверхности дрожжей, все из которых соответствуют данному протоколу (Blaise et al., 2004, Boder and Wittrup, 1997, Kuroda and Ueda, 2011, Orcutt and Wittrup, 2010, Rakestraw et al., 2011, Sazinsky et al., 2008, Tasumi et al., 2009, Vasquez et al., 2009).
Кинетический анализ с помощью ForteBio. Устройства FortBio Octet HTX применяли в 12-канальном режиме (8 сенсоров на канал, 96 сенсоров на эксперимент) с одним из сенсоров AHC, SA или AHQ. Устройством управляли посредством программного обеспечения, поставляемого производителем (версии 8.2 и 9.0). Названия образцов и концентрации вводили на страницу данных о планшете, а белки, ассоциированные с сенсором, идентифицировали в колонке «информация» на странице данных сенсора. Данные экспериментов по кинетике собирали на 90 или 180 с исходного уровня, 180 с фазы ассоциации и 180 с фазы диссоциации. Данные экспериментов по сортировке собирали на 5 стадиях: 90 с исходного уровня 1, 90 с проверки связывания сенсора со вторичной связывающей молекулой, 90 с исходного уровня 2, 180 с ассоциации и 180 с диссоциации в лунке, содержащей вторичное mAb. Все файлы сохраняли на сетевой диск общего пользования согласно правилу формирования названий, которые идентифицируют формат эксперимента.
HIC. Образцы IgG1 подвергали замене буфера на 1 M сульфат аммония и 0,1 M фосфат натрия при pH 6,5 с применением 0,5-мл спин-колонки Zeba 40 кДа (Thermo Pierce, № по кат. 87766). Градиент солей устанавливали на колонке Dionex ProPac HIC-10 от 1,8 M сульфата аммония, 0,1 M фосфата натрия при pH 6,5 до таких же параметров без аммония сульфата. Градиент пропускали на 17 мин. при расходе 0,75 мл/мин. В конце прогона добавляли стадию промывки ацетонитрилом для удаления всего оставшегося белка, а колонку снова уравновешивали посредством 7 объемов колонки перед следующим циклом введения. Значения времени удерживания пиков отслеживали при поглощении A280 и концентрации сульфата аммония при элюировании рассчитывали на основе градиента и расхода.
LCMS. Образцы mAb восстанавливали с помощью DTT с последующей передачей анализа LCMS вниз на масс-спектрометр Bruker maXis4G, соединенный с Agilent 1100 HPLC (Agilent). Для удаления соли из образцов применяли колонку для обращенно-фазовой хроматографии POROS R2 10 мкм (2,1 x 30 мм). Быстрый поток LC при 2 мл/мин. обеспечивает разделение между образцом и солью, и элюирование образцов и регенерацию колонки завершали в пределах цикла 2,1 мин. T-образное соединение применяли для доставки только 0,15 мл/мин. потока образца в масс-спектрометр для анализа образца. Масс-спектрометр Bruker Maxis 4G прогоняли в режиме положительных ионов с выявлением в диапазоне 750-2500 масса/заряд. Остальные параметры источника устанавливали следующим образом: капилляр был установлен на 5500В, распылитель на 4,0 бар, сушильный газ из расчета 4,0 л/мин. и температуру сушки устанавливали на 200°C.
MS-спектры анализировали с применением программы для анализа данных Bruker версии 4.1, а деконволюцию осуществляли с применением максимально энтропийной деконволюции с массой в диапазоне 20-30 кДа.
Неофициальный перечень последовательностей представлен в таблице 4. В неофициальном перечне последовательностей представлена аминокислотная последовательность вариабельного участка тяжелой цепи («НС») с подчеркнутыми CDR каждого из вариабельных участков тяжелой цепи и вариабельного участка легкой цепи («LC») с подчеркнутыми CDR каждого из вариабельных участков легкой цепи.
Таблица 4. Неофициальный перечень последовательностей
Таблица 5. Информация о последовательности VH антитела
Таблица 6. Информация о последовательности VL антитела
Таблица 7. Последовательности CD3ε человека и яванского макака
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБЫ ПРОВЕДЕНИЯ ИММУНОТЕРАПИИ ХИМЕРНЫМ РЕЦЕПТОРОМ АНТИГЕНА В КОМБИНАЦИИ С АГОНИСТОМ 4-1BB | 2019 |
|
RU2788524C2 |
| ХИМЕРНЫЙ АНТИГЕННЫЙ РЕЦЕПТОР С КОСТИМУЛИРУЮЩИМ ДОМЕНОМ 4-1BB | 2020 |
|
RU2830540C2 |
| НЕ РЕСТРИКТИРОВАННЫЕ ПО HLA T-КЛЕТОЧНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2019 |
|
RU2812917C2 |
| АНТИ-ICOS АНТИТЕЛА | 2017 |
|
RU2764548C2 |
| РЕЖИМ ДОЗИРОВАНИЯ ДЛЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА GP100-СПЕЦИФИЧНЫЙ ПЕРЕНАПРАВЛЯЮЩИЙ TCR-АНТИ-CD3 SCFV | 2017 |
|
RU2766119C2 |
| ЛЕЧЕНИЕ РАКА С ПОМОЩЬЮ ХИМЕРНОГО АНТИГЕННОГО РЕЦЕПТОРА К CD33 | 2015 |
|
RU2747384C2 |
| МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА ЧЕЛОВЕКА К БЕЛКУ ПРОГРАММИРУЕМОЙ СМЕРТИ 1 (PD-1) И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ РАКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИ-PD-1-АНТИТЕЛ САМОСТОЯТЕЛЬНО ИЛИ В КОМБИНАЦИИ С ДРУГИМИ ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМИ СРЕДСТВАМИ | 2013 |
|
RU2599417C2 |
| Субстраты матриксной металлопротеиназы и другие расщипляемые фрагменты и способы их использования | 2014 |
|
RU2715232C2 |
| PD-L1 специфические антитела | 2017 |
|
RU2756236C2 |
| Анти-PD-L1 и IL-2 цитокины | 2017 |
|
RU2769282C2 |
Изобретение относится к области биохимии, в частности к анти-CD3 антителу или антигенсвязывающему фрагменту антитела. Также раскрыты нуклеиновая кислота, кодирующая указанное антитело, экспрессирующий вектор, клетка-хозяин для экспрессии указанного антитела, фармацевтическая композиция, содержащая указанное антитело, анти-CD3 химерный антигенный рецептор CAR. Раскрыт способ лечения нарушения у млекопитающего с помощью указанного антитела. Изобретение позволяет эффективно лечить нарушения у млекопитающего с помощью указанного антитела. 19 н. и 32 з.п. ф-лы, 1 пр., 7 табл.
1. Анти-CD3 антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где указанные VH и VL содержат аминокислотные последовательности согласно:
(i) SEQ ID NOS: 17 и 34 соответственно;
(ii) SEQ ID NOS: 22 и 23 соответственно;
(iii) SEQ ID NOS: 29 и 23 соответственно;
(iv) SEQ ID NOS: 49 и 23 соответственно;
(v) SEQ ID NOS: 58 и 23 соответственно;
(vi) SEQ ID NOS: 59 и 23 соответственно;
(vii) SEQ ID NOS: 70 и 23 соответственно;
(viii) SEQ ID NOS: 24 и 25 соответственно;
(ix) SEQ ID NOS: 17 и 47 соответственно;
(x) SEQ ID NOS: 17 и 25 соответственно;
(xi) SEQ ID NOS: 55 и 25 соответственно;
(xii) SEQ ID NOS: 20 и 21 соответственно;
(xiii) SEQ ID NOS: 54 и 36 соответственно;
(xiv) SEQ ID NOS: 31 и 36 соответственно;
(xv) SEQ ID NOS: 67 и 68 соответственно;
(xvi) SEQ ID NOS: 17 и 36 соответственно;
(xvii) SEQ ID NOS: 59 и 36 соответственно;
(xviii) SEQ ID NOS: 30 и 18 соответственно;
(xix) SEQ ID NOS: 31 и 18 соответственно; или
(xx) SEQ ID NOS: 50 и 18 соответственно.
2. Анти-CD3 антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где VH и VL содержат аминокислотные последовательности согласно SEQ ID NOS: 17 и 34 соответственно.
3. Анти-CD3 антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, которые представлены scFv, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, диателом, scFv2-Fc2 или scFv-IgG.
4. Анти-CD3 антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3, которые содержат:
(A) тяжелую цепь, содержащую VH и константную область тяжелой цепи (CH); и
(B) легкую цепь, содержащую VL и константную область легкой цепи (CL).
5. Анти-CD3 антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 4, которые представляют собой молекулу иммуноглобулина, содержащую две указанные тяжелые цепи и две указанные легкие цепи, соединенные между собой дисульфидныи связями, или мультимер указанной молекулы иммуноглобулина.
6. Анти-CD3 антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 4 или 5, которые являются или представляют собой антитело IgG, IgA, IgD, IgE или IgM.
7. Анти-CD3 антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 4 или 5, которые являются или представляют собой антитело IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2.
8. Анти-CD3 антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-7, которые содержат константный домен IgG.
9. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая анти-CD3 антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8.
10. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 9.
11. Клетка-хозяин для экспрессии анти-CD3 антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-8, которая трансфицирована, трансформирована или трансдуцирована нуклеиновой кислотой по п. 9.
12. Клетка-хозяин для экспрессии анти-CD3 антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-8, которая трансфицирована, трансформирована или трансдуцирована экспрессирующим вектором по п. 10.
13. Клетка-хозяин по п. 11 или 12, которая является эукариотической клеткой.
14. Клетка-хозяин по п. 11 или 12, которая является клеткой млекопитающего или дрожжей.
15. Клетка-хозяин по п. 11 или 12, которая является клеткой яичников китайского хомячка (CHO), клеткой почки эмбриона человека (HEK) или лимфоидной клеткой.
16. Клетка-хозяин по п. 11 или 12, которая является прокариотической клеткой.
17. Клетка-хозяин по п. 11 или 12, которая является клеткой бактерий.
18. Фармацевтическая композиция для усиления иммунной функции, содержащая анти-CD3 антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела по любому из пп. 1-8 и фармацевтически приемлемый носитель и/или вспомогательное вещество.
19. Анти-CD3 химерный антигенный рецептор (CAR), который содержит анти-CD3 антигенсвязывающий фрагмент антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где указанные VH и VL содержат аминокислотные последовательности согласно:
(i) SEQ ID NOS: 17 и 34 соответственно;
(ii) SEQ ID NOS: 22 и 23 соответственно;
(iii) SEQ ID NOS: 29 и 23 соответственно;
(iv) SEQ ID NOS: 49 и 23 соответственно;
(v) SEQ ID NOS: 58 и 23 соответственно;
(vi) SEQ ID NOS: 59 и 23 соответственно;
(vii) SEQ ID NOS: 70 и 23 соответственно;
(viii) SEQ ID NOS: 24 и 25 соответственно;
(ix) SEQ ID NOS: 17 и 47 соответственно;
(x) SEQ ID NOS: 17 и 25 соответственно;
(xi) SEQ ID NOS: 55 и 25 соответственно;
(xii) SEQ ID NOS: 20 и 21 соответственно;
(xiii) SEQ ID NOS: 54 и 36 соответственно;
(xiv) SEQ ID NOS: 31 и 36 соответственно;
(xv) SEQ ID NOS: 67 и 68 соответственно;
(xvi) SEQ ID NOS: 17 и 36 соответственно;
(xvii) SEQ ID NOS: 59 и 36 соответственно;
(xviii) SEQ ID NOS: 30 и 18 соответственно;
(xix) SEQ ID NOS: 31 и 18 соответственно; или
(xx) SEQ ID NOS: 50 и 18 соответственно.
20. Анти-CD3 CAR по п. 19, содержащий по меньшей мере один трансмембранный домен и по меньшей мере один внутриклеточный домен от Т-клеточного рецептора и по меньшей мере один костимулирующий домен.
21. Анти-CD3 CAR по п. 20, где по меньшей мере один трансмембранный домен представляет собой субъединицу CD3ζ.
22. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая анти-CD3 CAR по любому из пп. 19-21.
23. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 22.
24. Клетка-хозяин для экспрессии анти-CD3 CAR по любому из пп. 19-21, которая трансфицирована, трансформирована или трансдуцирована нуклеиновой кислотой по п. 22.
25. Клетка-хозяин для экспрессии анти- CD3 CAR по любому из пп. 19-21, которая трансфицирована, трансформирована или трансдуцирована экспрессирующим вектором по п. 23.
26. Клетка-хозяин по п. 24 или 25, которая является клеткой млекопитающего или дрожжей.
27. Клетка-хозяин по п. 24 или 25, которая является лимфоидной клеткой.
28. Фармацевтическая композиция для усиления иммунной функции, содержащая анти-CD3 CAR по любому из пп. 19-21 и фармацевтически приемлемый носитель и/или вспомогательное вещество.
29. Биспецифическое антитело или фрагмент антитела, которое специфически связывается с CD3 и вторым антигеном, который является антигеном клеточной поверхности, где биспецифическое антитело или фрагмент антитела содержат:
(А) первый антигенсвязывающий домен, который специфически связывается с CD3, и
(В) второй антигенсвязывающий домен, который специфически связывает второй антиген,
и где первый антигенсвязывающий домен содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где указанные VH и VL содержат аминокислотные последовательности согласно:
(i) SEQ ID NOS: 17 и 34 соответственно;
(ii) SEQ ID NOS: 22 и 23 соответственно;
(iii) SEQ ID NOS: 29 и 23 соответственно;
(iv) SEQ ID NOS: 49 и 23 соответственно;
(v) SEQ ID NOS: 58 и 23 соответственно;
(vi) SEQ ID NOS: 59 и 23 соответственно;
(vii) SEQ ID NOS: 70 и 23 соответственно;
(viii) SEQ ID NOS: 24 и 25 соответственно;
(ix) SEQ ID NOS: 17 и 47 соответственно;
(x) SEQ ID NOS: 17 и 25 соответственно;
(xi) SEQ ID NOS: 55 и 25 соответственно;
(xii) SEQ ID NOS: 20 и 21 соответственно;
(xiii) SEQ ID NOS: 54 и 36 соответственно;
(xiv) SEQ ID NOS: 31 и 36 соответственно;
(xv) SEQ ID NOS: 67 и 68 соответственно;
(xvi) SEQ ID NOS: 17 и 36 соответственно;
(xvii) SEQ ID NOS: 59 и 36 соответственно;
(xviii) SEQ ID NOS: 30 и 18 соответственно;
(xix) SEQ ID NOS: 31 и 18 соответственно; или
(xx) SEQ ID NOS: 50 и 18 соответственно.
30. Биспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 29, где VH и VL первого антигенсвязывающего домена содержат аминокислотные последовательности согласно SEQ ID NOS: 17 и 34 соответственно.
31. Биспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент по п. 29 или 30, которые содержат:
(I) scFv, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, диатело, scFv2-Fc2 или scFv-IgG;
(II) (A) тяжелую цепь, содержащую VH и константную область тяжелой цепи (CH), и (B) легкую цепь, содержащую VL и константную область легкой цепи (CL);
(III) молекулу иммуноглобулина, содержащую две указанные тяжелые цепи и две указанные легкие цепи, соединенные между собой дисульфидныи связями, или мультимер указанной молекулы иммуноглобулина;
(IV) антитело IgG, IgA, IgD, IgE или IgM; и/или
(V) антитело IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 или IgA2.
32. Биспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 29-31, где второй антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с целевым антигеном онкологического заболевания; целевым антигеном иммуноонкологического заболевания; целевым антигеном нейродегенеративного заболевания; целевым антигеном аутоиммунного нарушения; целевым антигеном инфекционного заболевания; целевым антигеном метаболического заболевания; целевым антигеном когнитивного нарушения; целевым антигеном гематоэнцефалического барьера или целевым антигеном заболевания крови.
33. Биспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 29-32, где второй антигенсвязывающий домен, специфически связывающийся с антигеном, выбранным из группы, состоящей из: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-кето-PGFla, 8-изо-PGF2a, 8-оксо-dG, аденозинового рецептора A1, A33, ACE, ACE-2, активина, активина A, активина AB, активина B, активина C, активина RIA, активина RIA ALK-2, активина RIB ALK-4, активина RIIA, активина RUB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM 15, ADAM 17/T ACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, адрессинов, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, альфа-1-антитрипсина, антагониста альфа-V/бета-1, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, артемина, антиидиотипа, ASPARTIC, предсердного натрийуретического фактора, интегрина av/b3, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, стимулятора B-лимфоцитов (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bel, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BFM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, остеогенина BMP-3, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, бомбезина, костного нейротрофического фактора, BPDE, BPDE-DNA, BTC, фактора 3 комплемента (C3), C3a, C4, C5, C5a, CIO, CA125, CAD-8, кальцитонина, cAMP, раково-эмбрионального антигена (CEA), ассоциированного с карциномой антигена, катепсина A, катепсина B, катепсина C/DPPI, катепсина D, катепсина E, катепсина H, катепсина L, катепсина O, катепсина S, катепсина V, катепсина X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL 14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CDlla, CDllb, CDllc, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (белки p67), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, токсина Clostridium botulinum, токсина Clostridium perfringens, CKb8-l, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, цитокератинового опухолеассоциированного антигена, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, стимулятора гемолиза, дез(l-3)-IGF-I (IGF-1 головного мозга), Dhh, дигоксина, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, EN A, эндотелинового рецептора, энкефалиназы, eNOS, Eot, эотаксина l, EpCAM, эфрина B2/ EphB4, EPO, ERCC, E-селектина, ET-1, фактора Ila, фактора VII, фактора VIIIc, фактора IX, белка активации фибробластов (FAP), Fas, FcRl, FEN-1, ферритина, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, фибрина, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, фолликулостимулирующего гормона, фракталкина, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas 6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (миостатин), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-альфа 1, GFR-альфа 2, GFR-альфа 3, GITR, глюкагона, Glut 4, гликопротеина Ilb/IIIa (GP Ilb/IIIa), GM-CSF, gpl30, gp72, GRO, соматотропин-рилизинг-фактора, гаптена (NP-cap или NIP-cap), HB-EGF, HCC, гликопротеина оболочки gB HCMV, гликопротеина оболочки gH HCMV, HCMV UL, гемопоэтического фактора роста (HGF), Hep B gpl20, гепараназы, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), гликопротеина gB вируса простого герпеса (HSV), гликопротеина gD HSV, HGFA, высокомолекулярного меланома-ассоциированного антигена (HMW-MAA), HIV gpl20, V3-петли gp 120 HIV IIIB, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, сердечного миозина человека, цитомегаловируса человека (HCMV), гормона роста человека (HGH), HVEM, 1-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, рецептора IgA, IgE, IGF, IGF-связывающих белков, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, альфа-интерферона (INF), INF-бета, INF-гамма, ингибина, iNOS, А-цепи инсулина, B-цепи инсулина, инсулиноподобного фактора роста 1, альфа-2-интегрина, альфа-3-интегрина, альфа-4-интегрина, альфа-4/бета-l-интегрина, альфа-4/бета-7-интегрина, альфа-5(альфа-V)-интегрина, альфа-5/бета-l-интегрина, альфа-5/бета-3-интегрина, альфа-6-интегрина, бета-l-интегрина, бета-2-интегрина, гамма-интерферона, IP-10, 1-TAC, JE, калликреина 2, калликреина 5, калликреина 6, калликреина 11, калликреина 12, калликреина 14, калликреина 15, калликреина LI, калликреина L2, калликреина L3, калликреина L4, KC, KDR, фактора роста кератиноцитов (KGF), ламинина 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), латентного TGF-1, bpl латентного TGF-1, LBP, LDGF, LECT2, Lefty, антигена Lewis-Y, Lewis-Y-родственного антигена, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, липопротеинов, LIX, LKN, Lptn, L-селектина, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, легочного сурфактанта, лютеинизирующего гормона, рецептора бета-лимфотоксина, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, металлопротеазы, рецептора MGDF, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-альфа, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, муцина (Mucl), MUC18, антимюллерова гормона, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-кадгерина, NCA 90, NCAM, NCAM, неприлизина, нейротрофина-3, -4 или -6, нейротурина, фактора роста нейронов (NGF), NGFR, NGF-бета, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, pl50, p95, PADPr, паратиреоидного гормона, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-кадгерина, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, щелочной фосфатазы плаценты (PLAP), PIGF, PLP, PP14, проинсулина, прорелаксина, C-белка, PS, PSA, PSCA, простат-специфического мембранного антигена (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, А-цепи релаксина, B-цепи релаксина, ренина, F респираторного синцитиального вируса (RSV), RSV Fgp, Ret, ревматоидных факторов, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, сывороточного альбумина, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (опухолеассоциированный гликопротеин-72), TARC, TCA-3, T-клеточных рецепторов (например, T-клеточного рецептора альфа/бета), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, PLAP-подобной щелочной фосфатазы семенников, TfR, TGF, TGF-альфа, TGF-бета, полиспецифического TGF-бета, RI TGF-бета (ALK-5), RII TGF-бета, Rllb TGF-бета, RIII TGF-бета, TGF-бета 1, TGF-бета 2, TGF-бета 3, TGF-бета 4, TGF-бета 5, тромбина, Ck-1 тимуса, тиреотропного гормона, Tie, TIMP, TIQ, тканевого фактора, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-альфа, TNF-альфа/бета, TNF-бета 2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL Rl Apo-2, DR4), TNFRSFIOB (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcRl, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSFllB (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF 18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSFIA (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSFIB (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3), TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF 5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL Rl TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (лиганд TRAIL Apo-2, TL2), TNFSF11 (лиганд ODF TRANCE/RANK, лиганд OPG), TNFSF12 (лиганд TWEAK Apo-3, лиганд DR3), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (лиганд LIGHT HVEM, LTg), TNFSF15 (TLIA/VEGI), TNFSF18 (лиганд GITR, лиганд AITR, TL6), TNFSFIA (конектин TNF-a, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (лиганд gp34 OX40, TXGP1), TNFSF5 (лиганд CD40 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (Fas-лиганд, лиганд Apo-1, лиганд APT1), TNFSF7 (лиганд CD27 CD70), TNFSF8 (лиганд CD30 CD153), TNFSF9 (лиганд 4-1BB CD137), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, рецептора трансферрина, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, опухолеассоциированного антигена CA 125, опухолеассоциированного антигена, характеризующегося экспрессией углеводного антигена, родственного Lewis Y, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, урокиназы, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-кадгерина, VE-кадгерина-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VFM, вирусных антигенов, VLA, VLA-1, VLA-4, интегрина VNR, фактора фон Виллебранда, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, CTLA4 (антиген 4 цитотоксического Т-лимфоцита), PD1 (белок запрограммированной гибели клеток 1), PD-L1 (лиганд 1 белка запрограммированной гибели клеток), LAG-3 (ген активации лимфоцитов 3), TIM-3 (белок 3, содержащий домены T-клеточного иммуноглобулина и муцина), рецепторов гормонов и факторов роста.
34. Биспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 29-33, где второй антигенсвязывающий домен специфически связывается с антигеном, выбранным из группы, состоящей из: BCMA, CTLA4 (антиген цитотоксического Т-лимфоцита 4), PD1 (белок запрограммированной гибели клеток 1), PD-L1 (лиганд 1 белка запрограммированной гибели клеток), LAG-3 (ген активации лимфоцитов 3), TIM-3, CD20, CD2, CD19, Her2, EGFR, EpCAM, FcyRIIIa (CD16), FcyRIIa (CD32a), FcyRIIb (CD32b), FcyRI (CD64), Toll-подобных рецепторов (TLR), TLR4, TLR9, цитокинов, IL-2, IL-5, IL-13, IL-6, IL-17, IL-12, IL-23, TNFa, TGFb, рецепторов цитокинов, IL-2R, хемокинов, рецепторов хемокинов, факторов роста, VEGF и HGF.
35. Биспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 29-34, которые содержат константный домен IgG.
36. Биспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 29-35, которые имеют мультиспецифический формат, выбранный из группы, состоящей из: Fab-Fc-scFv, «открывалки для бутылок», Mab-scFv, Mab-Fv, Dual scFv, центрального Fv, центрального scFv, центрального scFv с одним плечом, Fab-Fab, Fab-Fv, mAb-Fv, mAb-Fab, DART, BiTE, IgG с общей легкой цепью, TandAb, Cross-Mab, SEED, BEAT, TrioMab и DuetMab.
37. Выделенная или рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая биспецифическкое антитело или фрагмент антитела по любому из пп. 29-36, где нуклеиновая кислота содержит:
(А) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность первого антигенсвязывающего домена, и
(В) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность второго антигенсвязывающего домена.
38. Вектор экспрессии, содержащий выделенную или рекомбинантную нуклеиновую кислоту по п. 37.
39. Клетка-хозяин для экспрессии биспецифического антитела или фрагмента антитела по любому из пп. 29-36, которая трансфицирована, трансформирована или трансдуцирована нуклеиновой кислотой по п. 37.
40. Клетка-хозяин для экспрессии биспецифического антитела или фрагмента антитела по любому из пп. 29-36, которая трансфицирована, трансформирована или трансдуцирована экспрессирующим вектором по п. 38.
41. Клетка-хозяин по п. 39 или 40, которая является эукариотической клеткой.
42. Клетка-хозяин по п. 39 или 40, которая является клеткой млекопитающего или дрожжей.
43. Клетка-хозяин по п. 39 или 40, которая является клеткой яичников китайского хомячка (CHO), клеткой почки эмбриона человека (HEK) или лимфоидной клеткой.
44. Клетка-хозяин по п. 39 или 40, которая является прокариотической клеткой.
45. Клетка-хозяин по п. 39 или 40, которая является клеткой бактерий.
46. Фармацевтическая композиция для усиления иммунной функции, содержащая биспецифическое антитело или фрагмент антитела по любому из пп. 29-36 и фармацевтически приемлемый носитель и/или вспомогательное вещество.
47. Способ лечения нарушения у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, где нарушение предусматривает пролиферативное нарушение, онкологическое нарушение, иммуноонкологическое нарушение, неврологическое нарушение, нейродегенеративное нарушение или аутоиммунное нарушение, где способ предусматривает введение эффективного количества одного или более анти-CD3 антител или фрагментов антител по любому из пп. 1-8, одного или нескольких анти-CD3 CARs по любому из пп. 19-21, одного или нескольких биспецифических антител или фрагментов антител по любому из пп. 29-36, клетки-хозяина по любому из пп. 11-17, 24-27 или 39-45 или фармацевтической композиции по п. 46.
48. Способ по п. 47, где клетка-хозяин является иммунной клеткой.
49. Способ по п. 48, где иммунная клетка является Т- или NK-клеткой.
50. Способ по любому из пп. 47-49, где способ также включает введение млекопитающему дополнительного терапевтического агента.
51. Способ по любому из пп. 47-50, где млекопитающее является человеком.
| WO 2018208864 A1, 15.11.2018 | |||
| RU 2020138026 A, 21.05.2019 | |||
| WO 2016116626 A1, 28.07.2016. |
