СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНТОМОПАТОГЕННОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 2011 года по МПК A01N63/04 C12N1/14 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и касается производства средств защиты растений от вредителей, в частности способа получения грибных энтомопатогенных препаратов. Известны способы получения энтомопатогенных препаратов путем глубинного культивирования микроскопических грибов, таких как Verticillium lecanii, Beauveria bassiana на питательных средах, содержащих источники углерода, азота и минеральные соли, с последующим концентрированием и сушкой концентрата (Вертициллин зерновой ТУ 10.01.28-89 [1], Вертициллин-К ТУ 10.01.29-89 [2]). Недостатками этих препаратов является низкопроизводительный поверхностный способ культивирования, необходимость стадии сушки, которая существенно снижает жизнеспособность спор и усложняет технологический процесс. В случае получения жидких препаратов (Боверин-концентрат Ж ТУ 10.01.26-88 [3]), их применяют сразу после получения. Современными препаративными формами, более экономичными и простыми в получении являются стабилизированные пасты.

Наиболее близким техническим решением к изобретению, взятый за прототип (Патент RU 2035144. Третьяков В.П. Способ получения энтомопатогенного препарата от 22.01.1993 [4]) является способ получения жидкого энтомопатогенного препарата путем глубинного культивирования микроскопических грибов (Verticillium lecanii, Beauveria bassiana или Metarhizium anisopliae) на питательной среде, содержащей глюкозу, глицерин, гидролизат белково-витаминного концентрата, мел и воду, концентрирование культуральной жидкости, введение в концентрат дополнительно глицерина и полиэтиленоксида или поливинилпироллидона.

Полученный по описанному способу влажный препарат (паста) имеет титр бластоспор 11·10⁹ спор/мл, биологическая эффективность 80% на личинках оранжерейной белокрылки при рабочей концентрации 10·10⁶ спор/мл, срок хранения до трех месяцев при температуре не выше 10°С.

Недостатком известного способа является сравнительно низкая биологическая эффективность биопрепарата и снижение жизнеспособности инфекционных единиц в процессе хранения за счет несбалансированного состава препаративной формы.

Цель изобретения - увеличение биологической эффективности биопрепарата и удлинение срока хранения без ее потери.

Сущность способа заключается в следующем. Готовят жидкую стерильную питательную среду (Леднев и др. «Возбудители микозов насекомых», СПб. 2003, с.71 [5]), содержащую, мас.: 20 г глюкозы, 10 г пептона, 2 г дрожжевого экстракта, Н₂О - до 1 л. Доводят до рН 6,5 едким натром. Засевают штаммом гриба Verticillium lecanii P-81 (Каталог государственных коллекций полезных и вредных организмов, М. - СПб, РАСХН, 2001, с.14 [6]) и культивируют глубинно, скорость перемешивания 200-220 об/мин. Культивирование осуществляют в течение 5 суток при 27°С до максимального спорообразования. Полученную культуральную жидкость концентрируют до остаточной влажности 73-85% фильтрованием. Для получения пасты в концентрат культуральной жидкости вводят полифункциональную добавку, которая состоит из наполнителя - картофельного крахмала, в качестве эмульгатора и антиоксиданта соевого лецитина или вазелинового масла, ультрафиолетового протектора - диоксида титана, консерванта - борной кислоты (СанПиН 2.3.2.1078-01 Приложение 7, с.577, 578, 611, 616 [7]) и антибиотика - стрептомицина [5, с.70] при соотношении компонентов, мас.%: картофельный крахмал 6-8;.диоксид титана 2-5; борная кислота 0,01-0,03; стрептомицин 0,004-0,008; соевый лецитин 8-14 или вазелиновое масло 4-6; вода - остальное.

Пример 1, иллюстрирующий приготовление составов.

К 5 г концентрата культуральной жидкости с остаточной влажностью 78% и титром жизнеспособных единиц 5,0·10¹³ КОЕ/г добавляли 1 мл 0,1%-ного раствора борной кислоты, 1 мл 0,02%-ного раствора стрептомицина, 10% (0,5 г) соевого лецитина. После частичного растворения гранул лецитина, смешивали образец с 5 г 7,5%-ного картофельного крахмала. Полученный энтомопатогенный препарат, представляющий собой стойкую однородную суспензию (пасту), имеет следующую характеристику: исходный титр жизнеспособных спор 2,3·10¹² КОЕ/г, срок хранения до четырех месяцев при температуре 4°С, титр после хранения составил 4,3·10⁸ КОЕ/г. Непосредственно перед применением в препарат добавляли 5% (0,25 г) диоксида титана.

Биологическая эффективность препарата на виковой тле (Megoura viciae Buckt.) - 100%, на черемухо-злаковой тле (Rhopalosiphum padi L.) - (98,0±3,5)%, на белокрылке - (95,5±7,9)% (рабочая концентрация 5,0·10⁶ спор/мл).

Пример 2. Так же как в примере 1 получали препарат на основе 5 г концентрата культуральной жидкости в такой же последовательности с заменой соевого лецитина на 0,3 г вазелинового масла. Полученный энтомопатогенный препарат, представляющий собой стойкую однородную суспензию (пасту), имеет следующую характеристику:

исходный титр жизнеспособных спор 2,3·10¹² КОЕ/г, срок хранения до четырех месяцев при температуре 4°С, титр после хранения 2,0·10⁸ КОЕ/г. Биологическая эффективность препарата на виковой тле (Megoura viciae Buckt) - (91,3±4,3)% (рабочая концентрация 5,0·10 спор/мл), на черемухо-злаковой тле (Rhopalosiphum padi L.) - (99,3±1,2)%, на белокрылке - (85,0±7,7)% (рабочая концентрация 5,0·10⁶ спор/мл).

Приведенный в примерах 1-2 титр концентрата культуральной жидкости - 5,0·10¹³ КОЕ/г является промежуточным параметром при получении препарата. Из литературы известны различные показатели титра спор (спор/мл культуральной жидкости), полученные в результате культивирования штаммов этого вида гриба в глубинных условиях. Эти показатели определяются прежде всего штаммовыми особенностями продуцента. Например, в прототипе получают культуральную жидкость с титром спор гриба 1,5·10³ спор/мл, концентрируют до титра 1,3·10¹⁰ спор/г и в готовом препарате получают в пересчете на граммы 2,27·10⁹ спор/г.

Титр пасты после внесения добавок (исходный) составил 2,3·10¹² КОЕ/г. Такие наработки были проведены многократно (таблица 1). Для всех образцов паст, полученных по предлагаемому способу, характерно первоначальное увеличение КОЕ/г (через неделю хранения) за счет частичного использования компонентов полифункциональной добавки и последующее снижение через 4 месяца хранения до уровня (0,5-3,5)·10⁸ КОЕ/г. Паста, полученная по прототипу, не хранится в течение 4-х месяцев (таблица 2).

Таблица 1 Номер наработки Титр концентрата, КОЕ/г Титр жизнеспособных единиц в пасте, КОЕ/г     исходный 1 неделя 4 месяца 1 9.3·10⁹ 4,6·10⁹ 1,4·10¹⁰ 9,7·10⁷ 2 4,7·10¹² 2,3·10¹² 1,6·10¹³ 3,5·10⁸ 3 2.1·10⁸ 1.1·10⁸ 1,2·10⁹ 5,0·10⁷ 4 7,4·10¹⁰ 9,8·10⁹ 8,0·10¹⁰ 1,2·10⁸ 5 2,6·10¹⁰ 1,0·10¹⁰ 1,8·10¹¹ 3,3·10⁸ Без добавок 6.0·10⁹ 3,0·10⁹ 2,6·10¹⁰ не хранится

Универсальность изобретения состоит в том, что при любом значении исходного титра жизнеспособных спор мы имеем эффект сохранения жизнеспособности спор за счет введения полифункциональной добавки, который проявляется в более высоком показателе КОЕ/г в результате хранения.

Таблица 2 Изменение титра образцов паст при хранении. Композиция Титр жизнеспособных спор в результате хранения 1 неделя КОЕ/г, ·10¹² 1 месяц КОЕ/г, ·10¹² 2 месяца КОЕ/г, ·10¹⁰ 4 месяца КОЕ/г, ·10⁸ Примеры 1-2 описания: ЛПФ 20,0±2,8 16,3±0,2 8,5±0,5 4,3±0,1 ВПФ 25,0±0,6 12,6±0,4 3,3±0,3 2,0±0,2 Добавка Твин-80 35,0±0,2 6,3±2,2 2,0±0,2 Не хранится Контроль (без добавок) 22,5±1,4 8,6±2,5 0,2±0,1 Не хранится

Пример 3. Запредельные параметры полифункциональной добавки приводили к ухудшению препарата (табл.3). При этом оптимальное соотношение концентрата культуральной жидкости к полифункциональной добавке на основе приведенных в таблице 3 и в примерах 1-2 концентраций отдельных компонентов в пересчете стандартными методами составляет 1: 1,2-1,9 соответственно. Это вытекает из известного уровня техники при пересчете процентов в пропорции.

Предлагаемый способ получения энтомопатогенного препарата путем глубинного культивирования гриба Verticillium lecanii при внесении полифункциональной добавки в процессе получения пасты (по сравнению с глицерином и полиэтиленоксидом по прототипу) обладает преимуществом: более высокая биологическая эффективность биопрепарата и жизнеспособность инфекционных единиц в процессе хранения за счет сбалансированного состава препаративной формы.

Источники информации

1. Вертициллин зерновой ТУ 10.01.28-89.

2. Вертициллин-К ТУ 10.01:29-89.

3. Боверин-концентрат Ж ТУ 10.01.26-88.

4. Патент RU 2035144. Третьяков В.П. Способ получения энтомопатогенного препарата от 22.01.1993.

5. Леднев Г.Р., Борисов Б.А., Митина Г.В. Возбудители микозов насекомых, СПб, 2003.

6. Каталог государственных коллекций полезных и вредных организмов, Москва-С.Петербург, РАСХН отд. защиты растений. 2001.

7. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов 2002 года. Приложение 7 (Пищевые добавки, не оказывающие вредного воздействия на здоровье человека при использовании для изготовления пищевых продуктов (с изменениями от 15 апреля 2003 г.).

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения энтомопатогенного препарата. Способ включает глубинное культивирование гриба Verticillium lecanii на питательной среде, с последующим концентрированием культуральной жидкости и введением в нее полифункциональной добавки, содержащей: мас.%: картофельный крахмал 6-8, диоксид титана 2-5, борная кислота 0,01-0,03, стрептомицин 0,004-0,008, соевый лецитин 8-14 или вазелиновое масло 4-6, вода - остальное. Изобретение позволяет повысить биологическую эффективность биопрепарата и сохранить активность биопрепарата при хранении в течение 4 месяцев. 3 табл.

Способ получения энтомопатогенного препарата путем глубинного культивирования гриба Verticillium lecanii на питательной среде с последующим концентрированием культуральной жидкости и введением в нее полифункциональной добавки, отличающийся тем, что в качестве полифункциональной добавки вводят крахмал, диоксид титана, борную кислоту, стрептомицин, соевый лецитин или вазелиновое масло, воду при следующем соотношении компонентов, мас.%:
картофельный крахмал 6-8 диоксид титана 2-5 борная кислота 0,01-0,03 стрептомицин 0,004-0,008 соевый лецитин 8-14 или вазелиновое масло 4-6 вода остальное