ШТАММ ГРИБА Trichoderma aureoviride Rifai - ПРОДУЦЕНТ 1,3-β-D-ГЛЮКАНАЗ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/14 C12N9/14 C12R1/885 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового штамма гриба - продуцента 1,3-β-D-глюканаз (ламинариназ).

Известен штамм Acremonium persicinum, продуцирующий 1,3-β-D-глюканазы [Pitson S.M., Seviour R.J., McDougall B.M. Effect of carbon source on extracellular (1→3)- and (l→6)-β-glucanase production by Acremonium persicinum. // Can. J. Microbiol. 1997. Vol.43. P. 432-439]. Недостатком известного штамма является низкий выход целевого продукта.

В качестве прототипа был выбран известный продуцент 1,3-β-D-глюканаз - штамм гриба Chaetomium indicum, поскольку этот штамм, как и заявляемый штамм, получают в культуре [Burtseva Yu.V., Verigina N.S., Sova V.V., Pivkin M.V., Zvyagintseva T.N. Filamentous marine fungi as producers of O-glycosylhydrolases: β-l,3-glucanase from Chaetomium indicum. // Mar. Biotechnol. 2003. Vol.5. P. 349-359]. К недостаткам известного штамма можно отнести его низкую продуктивность в отношении ферментов - 0,02 мг/л среды с удельной активностью 4,1±0,55 ед./мг белка.

В связи с тем, что 1,3-β-D-глюканазы представляют значительный интерес для получения глюкозы из природного сырья, содержащего β-D-глюканы, для разрушения клеточных стенок растений и микроорганизмов с целью более полной экстракции полезных веществ и для утилизации отходов микробиологических производств, ставится задача получения продукта с более высокой активностью фермента.

Поставленная задача решена выявлением нового штамма гриба Trichoderma aureoviride, эффективно продуцирующего 1,3-β-D-глюканазы.

Штамм Trichoderma aureoviride выделен из морского грунта, собранного на глубине 25 м в Южно-Китайском море, и хранится в Коллекции Морских Микроорганизмов (КММ) Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН под номером 4636.

Штамм Trichoderma aureoviride Rifai депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ F-4115D.

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Культуральные и морфологические признаки.

Колонии, выращенные на среде Чапека, приготовленной на морской воде, со слабым белым ватообразным воздушным мицелием. Конидии желто-зеленые образуются на конидиеносцах, собранных в компактные подушечки. Обратная сторона колонии желтая. Конидиеносцы древовидно разветвленные. Фиалиды удлененно-кеглевидные, часто асимметричные, 7-15×2-2,5 мкм. Конидии яйцевидные, с усеченным основанием, 3-5×2-3 мкм, с каплями масла, желто-зеленые.

Колонии гриба при выращивании на среде «сусло-агар на натуральной морской воде» со слабым белым ватообразным воздушным мицелием. Конидальные подушечки от лимонно-салатных до желто-зеленых. Реверзум желто-коричневый. Микроскопические признаки те же, что и на среде Чапека.

Новый штамм продуцирует суммарное количество ферментов с активностью 13,5±0,55 ед./мг белка.

Физиолого-биохимические признаки.

Штамм хорошо растет и образует конидии как на агаризованных средах (картофельно-сахарозный (глюкозный), приготовленной на натуральной морской воде агар, агар Чапека), так и на жидких средах того же состава (в стационарной культуре и на качалке). На среде Чапека максимальный рост отмечен на среде с мальтозой, на втором месте по усвояемости находятся сахароза и глюкоза. Из источников азота лучше всего усваиваются нитрат натрия и пептон. Среди источников углерода наибольшая интенсивность конидиобразования (5,6-6,8×10⁵ конидий/см²) отмечена на средах с мальтозой сахарозой и глюкозой. Однако наибольшая продуктивность конидиобразования зарегистрирована на средах с пептоном в качестве источников азота (таблица).

Таблица Влияние источников азота и углерода на рост штамма Trichoderma aureoviride BKM F-4115D Источники азота Диаметр колонии, мм на 7 сутки роста Продуктивность конидиобразования, конидий/см² Морфолого-культуральные особенности колоний Без сахаров 3,2±2,8 1,9×10⁵ Паутинистые,       белые с желто-зелеными подушечками спороношения Мальтоза 8,5±0,0 6,8×10⁵ Войлочные, травянисто-зеленые Сахароза 7,3±1,3 5,9×10^s Войлочные, желто-зеленые Глюкоза 6,8±2,3 5,6×10⁵ Войлочные, желто-зеленые Лактоза 4,7±1,5 4,8×10⁵ Войлочные, желто-зеленые Галактоза 5,7±1,3 3,9×10⁵ Войлочные, желто-зеленые Манит 4,6±2,3 4,6х10⁵ Войлочные, желто-зеленые NaNO₃ 7,2±1,4 4,9×10⁵ Войлочные, желто-зеленые Мочевина 6,9±2,5 3,2×10⁵ Войлочные, желто-зеленые Пептон 7,4±1,8 7,2×10⁵ Войлочные, желто-зеленые Аспарагин 5,6±1,2 4,6×10⁵ Войлочные, желто-зеленые NH₄NO₃ 6,5±1,7 3,9×10⁵ Войлочные, желто-зеленые

Штамм хранится на картофельно-морковной среде (20 г картофеля, 20 г моркови, 1 л натуральной морской воды. 10 г агар-агара) под минеральным маслом [Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов. Справочник. - М.: Агропромиздат, 1990. - 240 с.]. Время пересева - раз в три года.

Технический результат штамма гриба Trichoderma aureoviride заключается в его более высокой продуктивности, что проявляется как в более высоком выходе целевого продукта, так и в большей активности фермента. Продуктивность этого штамма превосходит продуктивность известного грибного штамма более чем в три раза. Кроме того, преимуществом заявляемого штамма по сравнению с прототипом является то, что для его выращивания требуется среда с меньшим числом компонентов и, что особенно важно, не включает в себя сахаров. Затраты на сахара составляют основную статью расходов на выращивание культур в промышленных масштабах. Таким образом, производство штамма гриба Trichoderma aureoviride с экономической точки зрения более выгодно по сравнению с производством штамма-прототипа.

Новый штамм может использоваться для промышленного получения 1,3-β-D-глюканаз.

Исследования свойств и механизма действия 1,3-β-0-глюканаз, выделенных нами из культуральной жидкости и мицелия морского гриба Т. aureoviride, показали, что они осуществляют глубокий гидролиз смешанных 1,3;1,6-β-D-глюканов с образованием монопродукта - глюкозы. Обе 1,3-β-D-глюканазы отнесены к ферментам экзотипа действия (1,3-β-D-глюкан-глюканогидролазы КФ 3.2.1.58). Молекулярная масса 1,3-β-D-глюканаз Т. aureoviride, согласно данным гель-хроматографии, составляет 56 кДа.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Trichoderma aureoviride Rifai BKM F-4115D выращивают методом глубинного культивирования на питательной среде следующего состава: неочищенный пластинчатый агар 2 г, пептон 1 г, дрожжевой экстракт 0,5 г, KH₂PO₄ 1 г, MgSO₄×7H₂O 0,5 г, FeSO₄×7H₂O 0,002 г, натуральная морская вода 1 л. Культивирование осуществляют при 22°С в колбах на качалке 180-200 об/мин в течение 168 часов.

Комбинацией методов ультрафильтрации, гидрофобной хроматографии на фенил-сефарозе 6 Fast Flow и ионообменной хроматографии на 15 Q РЕ и 15 S РЕ (FPLC) с выходом 13,5±0,55 ед./мг белка получают препараты 1,3-р-D-глюканаз, не содержащие сопутствующих О-гликозилгидролаз.

Пример 2. Штамм Trichoderma aureoviride Rifai BKM F-4115D выращивают методом глубинного культивирования на питательной среде следующего состава: сухие бурые водоросли 2 г, пептон 1 г, дрожжевой экстракт 0,5 г, КН₂РO₄ 1 г, MgSO₄×7H₂O 0,5 г, FeSO₄×7H₂O 0,002 г, натуральная морская вода 1 л. Культивирование осуществляют при 22°С в колбах на качалке 180-200 об/мин в течение 168 часов.

Выделение 1,3-β-D-глюканаз проводят описанным в примере 1 способом. Суммарный выход 1,3-β-D-глюканаз составляет 16±0,55 ед./мг белка.

Штамм гриба Trichoderma aureoviride Rifai выделен из морского грунта, собранного на глубине 25 м в Южно-Китайском море. Депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К.Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ F-4115D. Для выращивания штамма используют питательную среду, не содержащую сахаров. Штамм характеризуется высокой продуктивностью 1,3-β-D-глюканаз. Суммарный выход 1,3-β-D-глюканаз составляет 13,5-16 ед./мг белка. 1 табл.

Штамм гриба Trichoderma aureoviride Rifai BKM F-4115D - продуцент 1,3-β-D-глюканаз.