МЫШИНАЯ ГИБРИДОМА S79 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА, ОБЛАДАЮЩЕГО СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ К БЕЛКУ ЯДРЫШКА SURF-6 ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2011 года по МПК C12N5/18 C07K16/18 

Изобретение относится к биотехнологии, биологии и медицине и предназначено для выявления белка SURF-6 человека иммуноферментным и иммуноцитохимическим методами, а также на иммуноблотах для научно-исследовательских и клинико-лабораторных целей.

Известно, что антитела являются мощным инструментом для изучения фундаментальных вопросов, направленных на выяснение функций белков человека в норме и при патологиях. Антитела к белкам, служащим биомаркерами пролиферативного состояния клеток, повсеместно применяются также для клинической оценки прогноза опухолевой прогрессии (Lea P., Ling М. "New molecular assays for cancer diagnosis and targeted therapy". Curr. Opin. Mol. Ther. 2008, 10: 251-259).

Известно также, что активация клеток к пролиферации сопровождается повышением содержания некоторых белков ядрышка (Sirri et al. "Nucleolus: the fascinating nuclear body". Histochem. Cell Biol. 2008, 129: 13-31). Одним из них является эволюционно-консервативный белок SURF-6, называемый также SURF6 или Surfeit6 (Малышева и др. "Сравнительный анализ экспрессии ключевых белков ядрышка в лимфоцитах периферической крови здоровых доноров, активированных к пролиферации in vitro". Труды XXII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2010, с.40). Для выявления SURF-6 у человека на сегодняшний день существует несколько антител. Одно антитело было получено в лабораторных условиях (Magoulas and Fried "The Surf-6 gene of the mouse surfeit locus encodes a novel nucleolar protein. DNA Cell Biol. 1996, 15: 305-316"), другие антитела являются коммерческими. Однако все известные на сегодняшний день антитела, позволяющие выявлять SURF-6 человека, являются поликлональными. Сведений о мышиных гибридомах - прототипах настоящего изобретения - нам обнаружить не удалось.

Задачей изобретения является получение мышиной гибридомы - продуцента моноклонального антитела, обладающего специфичностью к белку ядрышка SURF-6 человека, для его выявления иммуноферментным, иммуноцитохимическим методами и на иммуноблотах.

Поставленная задача решается за счет мышиной гибридомы S79 - продуцента моноклонального антитела, специфичного к белку ядрышек SURF-6 человека, для его выявления иммуноферментным методом, а также методами иммунофлуоресценции и иммуноблотирования в клетках человека разного линейного и тканевого происхождения и полученная путем иммунизации мышей линии Balb/c SURF-6 человека, экспрессированным в Е. coli в виде рекомбинантного белка SURF-6-глутатион-S-трансфераза, и слиянием сенсибилизированных лимфоцитов с клетками мышиной миеломы линии P3X63-Ag8.653 с помощью 50%-ного раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1450.

Мышиную гибридому S79 получают следующим образом.

Трем мышам линии Balb/c (весом 20 г) внутрибрюшинно инъецируют по 5 мкг белка, растворенного в 0.5 мл полного адъюванта Фрейнда, а затем дважды - то же количество белка, растворенного в неполном адъюванте Фрейнда. Интервал между иммунизациями составляет 7 суток. Сенсибилизацию (т.е. появление в сыворотке крови животных антител к SURF-6) проверяют в реакции непрямой иммунофлуоресценции и методом иммуноблотирования на клетках человека HeLa, как описано в Примерах 2 и 3. Лимфоциты селезенки мыши, в сыворотке крови которой присутствуют антитела к SURF-6, выделяют, как описано в Примере 4. Их сливают с культивируемыми клетками мышиной миеломы линии P3X63-Ag8.653 в соотношении 3:1, используя в качестве сливающего агента 50%-ный раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1450, как описано в Примере 5. После завершения процедуры слияния клетки переносят в ячейки 96-луночных плоскодонных планшетов (0.2×10⁶ клеток на ячейку) в среде RPMI 1640 с селективными агентами (0.1 мМ гипоксантина, 0.4 мкМ аминоптерина и 0.016 мМ тимидина) (Пример 5). Через 7 суток производят скрининг культуральных жидкостей из лунок, давших рост гибридным клонам сначала методом ELISA, используя в качестве субстрата белок SURF-6-глутатион-S-трансферазу, выделенный из бактерий, как описано в Примере 1. Культуральную жидкость от ELISA-позитивных клонов затем тестируют методом иммунофлуоресценции на клетках человека HeLa, мыши NIH/3T3 и крысы С6, как описано в Примере 2, а также на иммуноблотах, как описано в Примере 3. В результате отбирают клон S79, секретирующий моноклональное антитело, выявляющее SURF-6 в клетках HeLa в реакции непрямой иммунофлуоресценции и на иммуноблотах (фиг.1а-з и 2 дорожки а, б и а' и б'), но в тех же условиях не выявляющий SURF-6 в клетках мыши NIH/3T3 и крысы С6 (фиг.1и, к; фиг.2, дорожки в и в'). Клетки клона S79 четырехкратно клонируют методом лимитирующих разведений (Пример 6) и выводят в массовую культуру по стандартной методике.

Мышиная гибридома S79 - продуцент моноклонального антитела S79 - имеет следующие характеристики.

Морфологические признаки. Культура имеет вид суспензии, где клетки собраны в конгломераты и слабо прикрепляются к субстрату.

Условия культивирования клеток гибридомы S79. Среда для культивирования - RPMI 1640 («ПанЭко», Россия), 20% эмбриональной телячьей сыворотки ("HyClone", США), 2 мМ L-глутамина, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина. Условия культивирования: 37°С, абсолютная влажность и 5% CO₂ в атмосфере. Частота пассирования - каждые 3-4 суток, кратность рассева 1:5-1:10.

Способ криоконсервирования клеток гибридомы S79. Криозащитная среда: 55% среды DMEM («ПанЭко», Россия), 40% эмбриональной сыворотки теленка ("HyClone") и 5% диметилсульфоксида ("Sigma-Aldrich", США). Криоампулы с клеточной взвесью помещают на сутки в холодильник на -70°, после чего переносят в жидкий азот (-196°С) для длительного хранения. Жизнеспособность после размораживания - 80-90%. После размораживания клетки культивируют при плотности 0.2-0.3·10⁶ кл./мл.

Бактерии, грибы, дрожжи и микоплазма в культуре не обнаружены.

Изотип моноклонального антитела S79. Моноклональное антитело S79 относится к иммуноглобулинам класса IgG1.

Специфичность моноклонального антитела S79. Моноклональное антитело S79 выявляет SURF-6 в клетках человека разного тканевого и линейного происхождения, включая клетки HeLa (карцинома шейки матки, фиг.1а-г), НЕр-2 (карцинома гортани), Ramos (лимфобластоидная линия, фиг.1д, е), лимфоциты периферической крови доноров, активированные к пролиферации in vitro (фиг.1ж, з) как после фиксации ацетоном (фиг.1а, б), так и после фиксации параформальдегидом (фиг.1в-з). Антитело S79 не выявляет SURF-6 в клетках мыши (линия NIH/3T3) (фиг.1и, к) и крысы (линия С6) при их фиксации способами, перечисленными выше. Антитело S79 также узнает SURF-6 в суммарных лизатах клеток человека HeLa (фиг.2, дорожки а') и Ramos (фиг.б'), но не выявляет белок в лизатах клеток мыши NIH/3T3 и крысы С6 (фиг.2, дорожка в').

Оптимальные титры антител S79, определяемые в культуральной жидкости на клетках HeLa методом непрямой иммунофлуоресценции составляют 1:20, методом иммуноблотов - 1:200.

Полученная мышиная гибридома S79 и продуцируемое ею моноклональное антитело S79 рекомендуются для специфического выявления белка ядрышка SURF-6 человека методами ELISA, иммунофлуоресценции и иммуноблотирования. Антитело S79 может быть также рекомендовано для выявления возможной контаминации культур клеток человека клетками мыши и крысы.

Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы.

Фиг.1. Специфичность антитела S79, продуцируемого гибридомой S79, к белку SURF-6 в клетках человека разной тканевой и линейной принадлежности, выявляемая методом иммунофлуоресценции.

(а-г) - клетки человека HeLa, (д, е) - клетки человека Ramos, (ж, з) - лимфоциты человека, активированные к пролиферации in vitro, (и, к) - клетки мыши NIH/3T3; (а, б) - фиксация клеток ацетоном, (в-к) - фиксация клеток параформальдегидом, как описано в Примере 2; (а, в, д, з, к) - фазово-контрастные изображения, (б, г, е, ж, и) - иммунофлуоресценция. Стрелками указаны ядрышки. Масштабная линия, 25 мкм.

Фиг.2. Специфичность антитела S79, продуцируемого гибридомой S79, к белку SURF-6 в клетках человека, выявляемая на иммуноблотах.

(дорожки а и а') - клетки человека HeLa, (дорожки б и б') - клетки человека Ramos, (дорожки в и в')- клетки крысы С6. На дорожках (а-в) показана окраска геля красителем Coomassie blue G-250 после электрофоретического разделения белков, на дорожках (а'-в') - выявление SURF-6 антителом S79 после переноса белков на мембрану. Лизаты приготовлены, а мембрана проявлена, как описано в Примере 3.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. Экспрессия и выделение рекомбинантного белка SURF-6 из бактерий.

Для получения рекомбинантного белка SURF-6 человека, слитого с глутатион-S-трансферазой, используют вектор pGEX-2T ("AmershamPharmaciaBiotech", США). Ген SURF-6 человека амплифицируют на матрице кДНК, полученной из мРНК клеток линии HeLa с использованием ген-специфических праймеров (5'-cgcggatccatggcctctctactcgccaa-3', 5'-cggaattctcagaccaggcctgcgcgct-3', встроенные сайты эндонуклеаз рестрикции BamHI/EcoRI подчеркнуты). Амплифицированные фрагменты ДНК очищают и клонируют в вектор pGEX-2T по сайтам рестрикции эндонуклеазами BamHI и EcoRI. В результате получают плазмиду pGEX-Surf6, несущую ген белка SURF-6 человека, слитый с геном глутатион-S-трансферазы (GST) Schistosoma japonicum. Плазмиду тестируют на наличие нуклеотидных замен методом автоматического секвенирования ДНК.

Компетентные клетки E. coli штамма BL21-Codon-Plus ("Stratagene", США) химически трансформируют плазмидой pGEX-Surf6, высевают на чашки с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина, и инкубируют при 37°C в течение 16 ч.

Для экспрессии рекомбинантного белка 5 мл среды LB инокулируют единичной колонией с LB-чашки и инкубируют при горизонтальном перемешивании (250 об/мин) 16 ч при 37°C. После окончания инкубации 250 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, инокулируют 5 мл ночной бактериальной культуры. При достижении суспензией оптической плотности 0.6 ед. (при λ=600 нм) индуцируют экспрессию плазмиды с помощью 0.1 мМ изопропил-1-тио-β-D-галактопиранозида, ИПТГ ("Aldrich", США). Наработку белков осуществляют при 37°C в течение 3 ч и постоянном горизонтальном перемешивании клеток в режиме 200 об/мин.

Бактерии осаждают при 5000 g в течение 10 мин (4°С), осадок ресуспендируют на льду в 15 мл буфера В, содержащего 20 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана (рН 7.5), 150 мМ NaCl с добавлением 1 мМ PMSF и коктейля протеазных ингибиторов для бактерий ("Sigma"). Бактериальные клетки разрушают на льду с помощью ультразвукового дезинтегратора (20 импульсов по 1 мин каждый) и смешивают с Тритоном Х-100 до конечной концентрации 1%. Суспензию центрифугируют при 12000g 10 мин, к полученному супернатанту добавляют NaCl до конечной концентрации 0.5 М и 1 мл глутатион-сефарозы 4 В, предварительно уравновешенной буфером В, содержащим 0.5 М NaCl и 1% Тритона Х-100, и инкубируют при интенсивном перемешивании 2 ч. Суспензию переносят в колонку и промывают 100 мл буфера В, содержащего 1 М NaCl и 1% Тритона Х-100, а затем - 100 мл буфера В, содержащего 1% Тритона Х-100. Все операции при работе с суспензией производят при 4°С. Сорбированный на глутатион-сефарозе рекомбинантный SURF-6, слитый с глутатион-S-трансферазой, элюируют с колонки буфером В, содержащим 1 М NaCl и 20 мМ L-глутатиона, и используют для иммунизации мышей. Отдельные этапы выделения SURF-6 из Е. coli описаны нами ранее (Кордюкова и др. "Клонирование, экспрессия и выделение белка ядрышка человека SURF-6". Труды XXII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва, 2010, с.36).

Пример 2. Способы фиксации клеток для выявления SURF-6 в реакции непрямой иммунофлуоресценции.

Монослойные культуры (HeLa, HEp-2, фибробласты мыши NIH/3T3, клетки глиомы крысы С6) выращивают на покровных стеклах до достижения 70% конфлуентности. Суспензионные клетки (культура Ramos, лимфоциты человека) прикрепляют на стекла, покрытые поли-L-лизином, во влажной атмосфере при комнатной температуре 15 мин. Клетки фиксируют двумя способами:

(1) клетки помещают в охлажденный (-18°С) абсолютный ацетон на 10 мин при -18°С, высушивают на воздухе при комнатной температуре и помещают в PBS на 10 мин;

(2) клетки фиксируют 2%-ным параформальдегидом на стандартном фосфатном буфере PBS (140 мМ NaCl; 2,7 мМ KCl; 1,5 мМ KH₂PO₄ и 8,1 мМ Na₂HPO₄; рН 7.2-7.4) 20 мин при комнатной температуре, обрабатывают 0.1%-ным Тритоном Х-100 10 мин при 4°С, промывают в PBS 30 мин.

После фиксации клетки инкубируют с антителом S79 (разведение супернатанта 1:20 в PBS) 1 ч при комнатной температуре, а затем с козьими антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с флуорохромом Alexa Fluor 488 ("Molecular Probes", США), 30 мин при комнатной температуре. Препараты заключают в Мовиол и изучают в микроскоп Axiovert 200 ("Carl Zeiss", Германия), сопряженный с монохромной 13-битной камеры CoolSnap_cf («Roper Scientific», США), используя объективы PlanNeoFluar ×40/ЧА 0.75 и PlanNeoFluar ×100/ЧА 1.25. Результаты представлены на фиг.1.

Пример 3. Способ получения суммарных лизатов клеток и выявления SURF-6 на иммуноблотах.

5×10⁶ клеток лизируют на льду в буфере А, содержащем 50 mM Трис-(гидроксиметил)-аминометана (рН 7.5), 150 mM NaCl, 10% глицерина, 0.5% Тритона Х-100 и коктейль протеазных ингибиторов ("Sigma"). Суммарную концентрацию белков в лизатах определяют по методу Лоури (модификация Петерсона) с помощью набора Protein Assay Kit ("Sigma"), следуя рекомендациям производителя.

Перед электрофоретическим разделением к приготовленным лизатам добавляют 5×-ный буфер Лэммли, содержащий 250 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана (рН 6.8), 50% глицерина, 10% ДСН, 500 мМ β-меркаптоэтанола, 0.5% бромфенолового синего. Образцы подвергают термической обработке при 100°С 5 мин. В каждый карман 12% ПААГ-SDS наносят лизаты, содержащие не менее 50 мкг суммарного белка. Электрофоретическое разделение белков проводят 15 мин при 60 В и при 1.5 при 160 В для дальнейшего разделения в электрофорезной камере. Гель инкубируют в буфере для проведения полусухого электроблоттинга, содержащем 50 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана, 38 мМ глицина, 0.1% додецилсульфата натрия (ДСН) и 20% метанола. Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (0.22 мкм, "Millipore", США) проводят при постоянном напряжении 20 В 30 мин. Мембрану инкубируют с антителами S79 (разведение 1:500), а затем с антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (разведение 1:2000, "Sigma"). Оба антитела разводят в буфере TBST, содержащим 20 мМ Трис-(гидроксиметил)-аминометана (рН 7.6), 150 мМ NaCl, 0.05% Твина-20. Мембрану проявляют методом хемилюминесценции, используя набор ECL+Plus ("AmershamPharmaciaBiotech", Великобритания) согласно инструкции производителя. Проявитель рентгеновской пленки Hyperfilm ("AmershamPharmaciaBiotech") содержит 7% метола и 7% гидрохинона, фиксаж - 25% Na₂S₂O₃ и 2.5% Na₂SO₃. Результаты показаны на фиг.2.

Пример 4. Выделение сенсибилизированных лимфоцитов из селезенки мыши.

Селезенку мыши, в крови которой присутствуют антитела к SURF-6 человека, выделяют и помещают в стерильных условиях в чашку Петри диаметром 100 мм, содержащую 10 мл среды RPMI 1640 («ПанЭко», Россия). Измельчают селезенку с помощью иглы (номер 19), закрепленной на шприце объемом 1 мл, до тех пор, пока большая часть лимфоцитов не перемещается в среду. Переносят лимфоциты вместе со средой в стерильную пробирку объемом 15 мл и оставляют взвесь на 2 мин при комнатной температуре. Аккуратно удаляют супернатант и переносят взвесь лимфоцитов в новую стерильную пробирку. Осаждают лимфоциты при 500g 5 мин. В результате выделяют около 5×10⁷ лимфоцитов.

Пример 5. Слияние лимфоцитов селезенки с клетками миеломы мыши линии Р3Х63-Ag8.653.

3×10⁷ выделенных лимфоцитов дважды промывают центрифугированием при 500g в теплой (37°С) среде RPMI 1640 в течение 5 мин. 10⁷ миеломных клеток линии P3X63-Ag8.653 суспендируют в 20 мл среды RPMI 1640 и промывают, как указано выше для лимфоцитов. Нагревают пробирку с 50%-ным стерильным раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ) молекулярной массы 1450 (Hybri-Max™, "Sigma-Aldrich", США) при 37°С в водяной бане. Осадки клеток ресуспендируют в 5 мл среде RPMI 1640 и сливают в одну пробирку, центрифугируют при 800g 5 мин. Супернатант удаляют и к осадку по каплям добавляют 0.5 мл ПЭГ при постоянном перемешивании клеток. Добавляют 10 мл среды RPMI 1640 и центрифугируют при 500g 5 мин. Супернатант удаляют, а к осадку добавляют 20 мл ростовой среды RPMI 1640, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки ("HyClone", США), 2 мМ L-глутамина, по 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина и селективные агенты - 0.1 мМ гипоксантина, 0.4 мкМ аминоптерина и 0.016 мМ тимидина. Клетки рассевают в ячейки 96-луночных плоскодонных планшетов из расчета 0.2×10⁶ клеток на ячейку. Появление клонов оценивают с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 200, используя фазово-контрастный объектив 10×.

Пример 6. Метод лимитирующих разведений.

В каждую из лунок 96-луночного плоскодонного планшета добавляют по 100 мкл ростовой селективной среды (см. Пример 5). Из ячейки с клоном, вырабатывающим антитела к SURF-6, отбирают 100 мкл суспензии, переносят в крайнюю верхнюю левую ячейку и пипетируют.Из ячейки отбирают 100 мкл суспензии и добавляют к ячейке, расположенной под ней. Повторяют операцию 6 раз, в результате чего все ячейки в первом левом ряду будут содержать клетки. Затем с помощью 8-канальной пипетки производят те же операции в направлении от крайнего ряда вдоль планшета вправо. Появление клонов анализируют с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 200, используя фазово-контрастный объектив 10×. Через 7 суток отмечают плашки, в которых присутствует только один клон.

Мышиную гибридому, названную «S79», получают путем слияния лимфоцитов селезенки мыши, иммунизированной рекомбинантным белком SURF-6 человека, слитым с глутатион-S-трансферазой, экспрессированным и выделенным из клеток Е. coli, с клетками мышиной миеломы линии Р3Х63-Ag8.653 в соотношении 3:1 с помощью 50%-ного раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1450. Полученная гибридома секретирует моноклональное антитело S79, специфичное к белку ядрышка SURF-6 человека с известной аминокислотной последовательностью вне зависимости от тканевого или линейного происхождения клеток. Антитело S79 не реагирует с SURF-6 в клетках мыши NIH/3T3 и крысы С6. Моноклональное антитело S79, производимое клоном S79, может быть использовано для выявления SURF-6 в пролиферирующих нормальных и опухолевых лимфоцитах человека, а также для выявления возможной контаминации культур клеток человека клетками другой видовой принадлежности, включая мышь и крысу. Полученное моноклональное антитело предназначено для специфического выявления белка ядрышка SURF-6 человека иммуноферментным методом, а также в реакции иммунофлуоресценции и на иммуноблотах в клетках человека разного линейного и тканевого происхождения. 2 ил.

Мышиная гибридома S79 - продуцент моноклонального антитела, специфичного к белку ядрышек SURF-6 человека, для его выявления иммуноферментным методом, а также методами иммунофлуоресценции и иммуноблотирования в клетках человека разного линейного и тканевого происхождения, и полученная путем иммунизации мышей линии Balb/c SURF-6 человека, экспрессированным в Е. coli в виде рекомбинантного белка SURF-6-глутатион-S-трансфераза, и слиянием сенсибилизированных лимфоцитов с клетками мышиной миеломы линии P3X63-Ag8.653 с помощью 50%-ного раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1450.