СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО АНТИГЕННОГО ГИСТОПЛАЗМОЗНОГО И КОКЦИДИОИДОМИКОЗНОГО ДИАГНОСТИКУМА Российский патент 2011 года по МПК G01N33/556 G01N33/53 

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к производству диагностикумов, используемых для выявления антител к возбудителям гистоплазмоза и кокцидиоидомикоза в реакции непрямой гемагглютинации.

Для определения антител к возбудителям особо опасных микозов известны диагностикумы, приготовленные с применением бараньих эритроцитов, обработанных танином [1, 4], с последующей конъюгацией их с полисахаридным антигенным комплексом, выделенным из клеток микромицетов бета-нафтольным методом [2].

1. Наиболее близким аналогом является препарат, описанный в статье Липницкого А.В. с соавт. [1] (прототип).

Однако известные препараты отличает относительно низкая стабильность, недостаточная воспроизводимость способа приготовления диагностикума, а также трудоемкость и длительность процесса выделения антигенов из клеточной массы грибов - возбудителей особо опасных микозов [2].

На сегодняшний день остается актуальным создание высокочувствительных эритроцитарных диагностикумов, пригодных для применения в условиях чрезвычайных ситуаций.

Цель изобретения - выделение антигенного комплекса, не требующего дополнительных этапов очистки, общего для возбудителей кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза, и создание на его основе антигенного эритроцитарного диагностикума, характеризующегося стабильностью и воспроизводимостью получаемых результатов.

Поставленная цель достигается за счет использования в качестве сенситина не полисахаридных антигенов, экстрагированных из клеточной массы грибов (см. прототип), а экстрацеллюлярного комплекса, общего для возбудителей кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза, способ выделения которого и сенсибилизация им эритроцитов характеризуются тем, что для оптимального образования и выделения экстрацеллюлярных антигенов культуру H.capsulatum G185 Р в мицелиальной фазе роста культивируют на синтетической безбелковой солевой среде Смита при температуре 28°С в течение 3 месяцев, после чего биомассу отделяют фильтрованием через ватно-марлевые фильтры и стерилизуют через мембранные фильтры, осуществляют контроль стерильности, а затем осаждают находящиеся в среде культивирования антигены охлажденным до -20°С двух-трехкратным объемом ацетона; полученный осадок отделяют центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин, дважды отмывают при тех же соотношениях новыми порциями охлажденного ацетона и высушивают при 37°С, определяют оптимальную сенсибилизирующую дозу выделенного антигена и используют последний при получении эритроцитарного диагностикума.

Полученный антиген не требует лиофилизации, относительно легко поддается точному дозированию, не содержит остатков дезинфицирующих средств, длительно хранится без потери серологической активности и обеспечивает высокую воспроизводимость метода. Таким образом, единовременно приготовленный в достаточном количестве экстрацеллюлярный антигенный комплекс может обеспечить получение стандартного диагностикума со стабильными свойствами в течение ряда лет.

В качестве жидкой питательной среды культивирования используют синтетическую солевую среду Смита [3]. Такой бульон не содержит в своем составе белково-пептонных компонентов питательной среды, что позволяет получить экстрацеллюлярный антиген для его дальнейшего использования без дополнительных этапов очистки. Сухой антиген для сенсибилизации растворяют в 0,01 М фосфатно-буферном растворе, рН 5,9. Коньюгацию проводят на водяной бане при температуре 45°С в течение 2-2,5 ч при постоянном перемешивании. Фиксацию осуществляют добавлением 1 об.% формалина с дополнительной инкубацией при тех же условиях в течение 30 мин. Данные параметры оптимизируют сенсибилизацию эритроцитов, улучшают качество препарата и, в конечном итоге, повышают чувствительность РИГА.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Выделение антигенного комплекса из культурального фильтрата H.capsulatum G185P. Культивирование штамма проводят в синтетической солевой среде Смита, приготовленной по следующей прописи:

1. L-аспаргин 7,0 г 2. Хлористый аммоний 7,0 г 3. Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,31 г 4. Цитрат натрия 0,9 г 5. Магний сернокислый 1,5 г 6. Железо лимоннокислое 0,3 г 7. Глюкоза 10 г 8. Глицерин 25 г 9. Вода до 1 л

Среду стерилизуют в автоклаве при 120°С в течение 15 минут.

Приготовленную среду разливают по 600-800 мл в бактериологические матрацы, куда вносят культуру H.capsulatum G185P в мицелиальной фазе роста 5 мл в концентрации 5-10×10⁶ м.т./мл по оптическому стандарту мутности ГИСК им Л.А.Тарасевича. Матрацы в горизонтальном положении инкубируют в термостате при 26-28°С в течение 3 месяцев. Биомассу отделяют от среды методом фильтрования через ватно-марлевый и мембранный стерилизующий фильтры. После проведения контроля стерильности комплекс антигенов осаждают из фильтрата путем добавления к последнему 2-3 объемов охлажденного до -20°С ацетона. Осадок отделяют центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин, дважды отмывают новыми порциями охлажденного ацетона и высушивают в термостате при 37°С.

Полученный сухой антигенный комплекс используют при определении оптимальной сенсибилизирующей дозы антигена и получения диагностикума.

Пример 2. Приготовление диагностикума эритроцитарного гистоплазмозного антигенного. Определение оптимальной сенсибилизирующей дозы антигенного комплекса.

Определение оптимальной сенсибилизирующей дозы антигенного комплекса проводят с использованием формалинизированных танизированных эритроцитов барана. Осадок, полученный из 5 мл 2,5% взвеси эритроцитов, суспендируют в таком же объеме 0,01 М фосфатно-буферного раствора, рН 5,9, в который добавлены навески 50, 100, 200, 400 мкг/мл сухого антигенного комплекса соответственно. Коньюгацию проводят на водяной бане при температуре 45°С в течение 2-2,5 ч при постоянном перемешивании. Фиксацию осуществляют добавлением 1 об.% формалина с дополнительной инкубацией при тех же условиях в течение 30 мин. После трехкратного отмывания эритроциты доводят до концентрации 2,5 об.% в 0,15 М растворе хлористого натрия, рН 7,2, и используют в реакции непрямой гемагглютинации. Оптимальная сенсибилизирующая доза составила 100 мкг/мл, которая обусловливала чувствительность РИГА с контрольной гистоплазмозной сывороткой серии 2-1 в титрах 1:20480 с четкими отрицательными контролями.

Приготовление рабочих серий диагностикума проводят по вышеописанной методике при больших объемах реагентов. При этом оптимальную сенсибилизирующую дозу увеличивают в 2 раза (до 200 мкг/мл). Полученный диагностикум расфасовывают в ампулы в виде суспензии 10 об.% в протективной среде высушивания и подвергают лиофилизации.

Пример 3. Определение специфической активности диагностикума

Гистоплазмозные и кокцидиоидомикозные козьи иммунные сыворотки получали путем многоцикловой иммунизации продуцентов. Антигенами для иммунизации служили обеззараженные клетки мицелиальной фазы возбудителей H.capsulatum и C.immitis. При постановке РИГА сыворотки разводили 1:10 0,15 М раствором натрия хлорида, титровали двукратным шагом в объеме 0,4 мл в 1 об.% НКС и вносили одну каплю 2,5 об.% взвеси диагностикума. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Данные таблицы свидетельствуют о возможности применения диагностикума для определения уровня антител в иммунных сыворотках как к возбудителю гистоплазмоза (в титре до 1:40960), так и к возбудителю кокцидиоидомикоза (при некотором снижении титра).

Пример 4. Определение специфичности диагностикума

Для оценки специфичности были использованы иммунные сыворотки лабораторных животных (баранов, козлов, лошади), содержащие антитела к возбудителям сапа, мелиоидоза, чумы, а также сыворотки людей, больных микотическими инфекциями (кандидозом или инвазивным аспергиллезом), и нормальная сыворотка человека.

Гетерологичные сыворотки разводили 1:10 с помощью 0,15 М раствора натрия хлорида, титровали двукратным шагом в объеме 0,4 мл и использовали для постановки РИГА в макроварианте. Полученные результаты представлены в таблице 2 и свидетельствуют о том, что диагностикум, изготовленный по предложенному способу, способен выявлять группоспецифические антитела к возбудителям гистоплазмоза и кокцидиоидомикоза в титре от 1:160 и выше. Титры с более высокой концентрацией до 1:80 обусловлены перекрестно реагирующими антителами к гетерологичным антигенам, не имеющим диагностического значения.

Источники информации

1. Липницкий А.В., Валькова Е.Р., Вальков Б.Г. Разработка и применение реакции пассивной гемагглютинации и реакции нейтрализации антител при глубоких микозах. / Диагностика особо опасных инфекций. - Ростов на Дону. - 1968. - С.54-57 (прототип).

2. Дроздов А.И. Методы выделения антигенов из патогенных грибов (Методическое пособие). - Ленинград, 1971, 33 с.

3. Smith CD. Nutritional factors that are requaired for the grows and sporulation of Histoplasma capsulatum. / In ′Histoplasmosis′. Proceeding of the Suond national conference / Ed. By A. Balows. - Springfild. - 1971. - P.64-70.

4. Валькова E.P., Липницкий A.B. Серологические показатели при экспериментальных глубоких микозах. // Ж. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. - 1970. - №12. - С.55-59.

Таблица 1 Результаты определения специфической активности диагностикума № п/п № продуцента Серия (цикл иммунизации) Вид сыворотки Серия диагностикума Титр в РИГА Контроль 1 2 1 Гистоплазмозная 2 1:40960 -       3 1:20480 -       4 1:20480 - 2 2 3 Гистоплазмозная 2 1:5120 -       3 1:1280 -       4 1:5120 - 3 2 4 Гистоплазмозная 2 1:10240 -       3 1:5120 -       4 1:10240 - 4 16 1 Гистоплазмозная 2 1:2560 -       3 1:2560 -       4 1:2560 - 5 16 2 Гистоплазмозная 2 1:10240 -       3 1:2560 -       4 1:10240 - 6 16 3 Гистоплазмозная 2 1:10240 -       3 1:5120 -       4 1:10240 - 7 18 1 Гистоплазмозная 2 1:5120 -       3 1:2560 -       4 1:2560 - 8 18 3 Гистоплазмозная 2 1:40960 -       3 1:5120 -       4 1:10240 - 9 18 5 Гистоплазмозная 2 1:40960 -       3 1:20480 -       4 1:20480 - 10 20 1 Гистоплазмозная 2 1:1280 -       3 1:1280 -       4 1:1280 -   20 2 Гистоплазмозная 2 1:5120 - 11     3 1:1280 -       4 1:2560 - 12 20 3 Гистоплазмозная 2 1:1280 -       3 1:320 -       4 1:2560 - 13 1 1 Кокцидиоидомикозная 2 1:1280 -       3 1:320 -       4 1:1280 - 14 1 3 Кокцидиоидомикозная 2 1:640 - 3 1:320 - 4 1:640 -

Продолжение таблицы 1 № п/п № продуцента Серия(цикл иммунизации) Вид сыворотки Серия диагностикума Титр в РНГА Контроль       Кокцидиоидомикозная 2 1:320 - 15 1 4 3 1:160 -       4 1:320 -       Кокцидиоидомикозная 2 1:10240 - 16 9 1 3 1:5120 -       4 1:5120 -       Кокцидиоидомикозная 2 1:5120 - 17 9 5 3 1:2560 -       4 1:5120 -       Кокцидиоидомикозная 2 1:2560 - 18 9 10 3 1:640 -       4 1:1280 -       Кокцидиоидомикозная 2 1:640   19 9 15 3 1:320 -       4 1:2560 -       Кокцидиоидомикозная 2 1:2560 - 20 9 20 3 1:640 -       4 1:1280 -       Кокцидиоидомикозная 2 1:2560 - 21 17 1 3 1:640 -       4 1:1280 -       Кокцидиоидомикозная 2 1:2560 - 22 17 3 3 1:1280 -       4 1:2560 -       Кокцидиоидомикозная 2 1:2560 - 23 17 6 3 1:640 -       4 1:1280 -       Кокцидиоидомикозная 2 1:2560 - 24 19 1 3 1:640 -       4 1:1280 - Условные обозначения: - отрицательный результат РИГА. Примечание. Данные взяты из таблиц «Акта комиссионных испытаний диагностикума эритроцитарного гистоплазмозного антигенного сухого», ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ Роспотребнадзора от 05 июня 2009 г.

Таблица 2 Результаты определения специфичности диагностикума № п/п № продуцента Серия (цикл иммунизации) Вид сыворотки Серия диагностикума Титр в РНГА Контроль   5574 (козел)   Мелиоидозная 2 1:80 - 1 2 3 1:40 -     4 1:80 -   5 (козел)   Мелиоидозная 2 1:40 - 2   14 3 1:20 -       4 1:40 -   7 (козел)   Мелиоидозная 2 1:20 - 3   21 3 - -       4 1:20 -   6518 (баран)   Сапная 2 - - 4 4 3 - -     4 - -   6518 (баран)   Сапная 2 - - 5 12 3 - -     4 - -   2801 (козел)   Сапная 2 - - 6 9 3 - -     4 - -   10 (баран)   Чумная 2 1:40 - 7   4 3 1:20 -       4 1:40 -   10 (баран)   Чумная 2 - - 8   9 3 - -       4 - -   Кокетка (лошадь) коммерческая Чумная 2 1:20 - 9 3 - -   4 - -   Сыворотка больного Клинич. диагноз: кандидоз 2 40 - 10 3 20 -   4 40 -   Сыворотка больного Клинич. диагноз: кандидоз 2 40 - 11 3 1:20 -   4 1:40 -   Сыворотка больного Клинич. диагноз: кандидоз 2 1:20 - 12 3 1:20 -   4 1:20 -   Сыворотка больного Клинич. диагноз: аспергиллез 2 1:20 - 13 3 1:20 -   4 1:20 -   Нормальная сыворотка человека - 2 1:20 - 14 3 - -   4 1:20 - Условные обозначения: - отрицательный результат РНГА. Примечание. Данные взяты из таблиц «Акта комиссионных испытаний диагностикума эритроцитарного гистоплазмозного антигенного сухого» ФГЗУ Волгоград НИПЧИ Роспотребнадзора от 05 июня 2009 г.

Изобретение относится к области медицины, а именно к области медицинской микробиологии, и касается способа получения эритроцитарного антигенного гистоплазмозного и кокцидиоидомикозного диагностикума. Сущность изобретения включает культивирование H.capsulatum G185 Р в мицелиальной фазе роста на синтетической безбелковой солевой среде Смита при температуре 28°С в течение 3 месяцев, после чего биомассу отделяют фильтрованием через ватно-марлевые фильтры и стерилизуют через мембранные фильтры, осуществляют контроль стерильности, а затем находящиеся в среде культивирования антигены осаждают охлажденным до -20°С ацетоном и высушивают. На основе выделенного антигенного комплекса, общего для возбудителей гистоплазмоза и кокцидиоидомикоза, получают эритроцитарный диагностикум. Преимущество изобретения заключается в повышении стабильности и воспроизводимости результатов в РНГА. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения эритроцитарного антигенного гистоплазмозного и кокцидиоидомикозного диагностикума, включающий выделение антигенного комплекса и сенсибилизацию им эритроцитов, отличающийся тем, что для оптимального образования и выделения экстрацеллюлярных антигенов культуру H.capsulatum G185 Р в мицелиальной фазе роста культивируют на синтетической безбелковой солевой среде Смита при температуре 28°С в течение 3 мес., после чего биомассу отделяют фильтрованием через ватно-марлевые фильтры, стерилизуют через мембранные фильтры, после чего осуществляют контроль стерильности и затем осаждают находящиеся в среде культивирования экстрацеллюлярные антигены охлажденным до -20°С двух-трехкратным объемом ацетона, полученный осадок отделяют центрифугированием при 8000 g в течение 15 мин, дважды отмывают при тех же соотношениях новыми порциями охлажденного ацетона и высушивают при 37°С, определяют оптимальную сенсибилизирующую дозу выделенного антигена и используют его для получения эритроцитарного диагностикума.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сенсибилизацию эритроцитов проводят в 0,01 М фосфатно-буферном растворе рН 5,9 при температуре 45°С в течение 2-2,5 ч с последующей фиксацией путем добавления в реакционную смесь 1 об.% формалина с инкубацией в течение 30 мин.